Utilizzo di dati single-worm per quantificare l'eterogeneità nelle interazioni caenorhabditis elegans-batteriche

Riepilogo

Questo protocollo descrive un'interruzione di 96 pozzi di singole Caenorhabditis elegans colonizzate battericamente a seguito di paralisi fredda e sbiancamento superficiale per rimuovere i batteri esterni. La sospensione risultante è placcata su piastre di agar per consentire una quantificazione accurata e di media produttività della carica batterica in un gran numero di singoli vermi.

Abstract

Il nematode Caenorhabditis elegans è un sistema modello per le interazioni ospite-microbo e ospite-microbioma. Molti studi fino ad oggi utilizzano digest batch piuttosto che singoli campioni di vermi per quantificare la carica batterica in questo organismo. Qui si sostiene che la grande variabilità inter-individuale osservata nella colonizzazione batterica dell'intestino di C. elegans è informativa e che i metodi di digestione batch scartano le informazioni che sono importanti per un confronto accurato tra le condizioni. Poiché la descrizione della variazione inerente a questi campioni richiede un gran numero di individui, viene stabilito un comodo protocollo a piastre a 96 pozzetti per l'interruzione e la placcatura della colonia di singoli vermi.

Introduzione

L'eterogeneità nelle associazioni ospite-microbo è osservata ovunque e la variazione tra gli individui è sempre più riconosciuta come un fattore che contribuisce ai processi a livello di popolazione dalla competizione e coesistenza¹ alla trasmissione della malattia ^2,3,4. In C. elegans, "eterogeneità nascosta" all'interno di popolazioni isogeniche è stata osservata ripetutamente, con sottopopolazioni di individui che mostrano fenotipi distinti nella risposta allo shock termico ^5,6, invecchiamento e durata della vita ^7,8,9,10,11 e molti altri aspetti della fisiologia e dello sviluppo¹² . La maggior parte delle analisi che tentano di identificare la struttura della sottopopolazione forniscono prove di due sottopopolazioni in popolazioni sperimentali di vermi isogenici e sincronizzati ^5,7,8, sebbene altri dati suggeriscano la possibilità di distribuzioni all'interno della popolazione di tratti piuttosto che gruppi distinti ^7,12,13 . Di rilevanza qui, l'eterogeneità sostanziale nelle popolazioni intestinali è osservata anche all'interno di popolazioni isogeniche di vermi colonizzati da una fonte condivisa di microbi 13,14,15,16, e questa eterogeneità può essere nascosta dalle misurazioni del digest batch che sono ampiamente utilizzate 17,18,19,20 per la quantificazione batterica nel verme.

Questo lavoro presenta dati che suggeriscono la necessità di una maggiore dipendenza dalle misurazioni a singolo worm nell'associazione ospite-microbo, nonché dai protocolli per aumentare l'accuratezza e il throughput nell'interruzione del singolo worm. Questi protocolli sono progettati per facilitare l'interruzione meccanica di un gran numero di singoli C. elegans per la quantificazione della carica batterica vitale, fornendo al contempo una migliore ripetibilità e uno sforzo inferiore per campione rispetto all'interruzione basata sui parassiti dei singoli vermi. Una fase raccomandata di spurgo intestinale, in cui i vermi sono autorizzati a nutrirsi di E. coli ucciso dal calore prima della preparazione per l'interruzione, è inclusa per ridurre al minimo i contributi di batteri recentemente ingeriti e altri batteri transitori (non aderenti). Questi protocolli includono un metodo di paralisi a freddo per la pulizia della cuticola con un trattamento di candeggina superficiale a bassa concentrazione; lo sbiancamento superficiale può essere utilizzato come fase preparatoria nella distruzione di un singolo verme o come metodo per preparare vermi vivi e privi di germi esternamente. Questo metodo di sbiancamento superficiale è sufficiente per rimuovere una vasta gamma di microbi esterni e il trattamento a freddo fornisce un'alternativa alla paralisi convenzionale basata sul levamisolo; mentre il levamisolo sarà preferito per gli esperimenti sensibili al freddo, la paralisi a freddo riduce al minimo i contributi ai flussi di rifiuti pericolosi e consente una rapida ripresa della normale attività. Mentre il protocollo completo descrive un esperimento di laboratorio in cui i vermi sono colonizzati con batteri noti, le procedure per la pulizia dei vermi e l'interruzione del verme singolo possono essere prontamente applicate a vermi isolati da campioni selvatici o colonizzati in esperimenti di microcosmo. I protocolli qui descritti producono batteri vivi estratti dall'intestino del verme, adatti per la placcatura e la quantificazione di unità formanti colonie (CFU) in singoli vermi; per l'analisi della comunità intestinale basata sul sequenziamento, a questi protocolli devono essere aggiunte successive fasi di lisi cellulare e di estrazione dell'acido nucleico.

Protocollo

I vermi utilizzati in questi esperimenti sono stati ottenuti dal Caenorhabditis Genetic Center, che è finanziato dal NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Bristol N2 è il wild-type. I mutanti DAF-2/IGF daf-16(mu86) I (CGC CF1038) e daf-2(e1370) III (CGC CB1370) sono usati per illustrare le differenze nella carica batterica intestinale.

HT115(DE3) E. coli che trasporta il vettore pos-1 RNAi proviene dalla libreria Ahringer²¹. La collezione MYb di batteri intestinali nativi C. elegans ²² è stata ottenuta dal laboratorio Schulenburg. Salmonella enterica LT2 (ATCC 700720) attB:GFP-KmR proviene da questo laboratorio²³. Pseudomonas mosselii è stato isolato in questo laboratorio. Staphylococcus aureus MSSA Newman pTRKH3-mGFP è stato ottenuto dal laboratorio LaRock della Emory University.

Tutti i worm buffer e i supporti sono preparati secondo la letteratura^{precedentemente pubblicata 24} con piccole modifiche (vedere il file supplementare 1).

1. Preparazione di C. elegans sterili sincronizzati

NOTA: in questa sezione vengono descritte procedure dettagliate per la generazione di una popolazione sincronizzata di vermi adulti sterili per la riproduzione. Nutrirsi di piastre RNAi pos-1 viene utilizzato qui per prevenire la produzione di progenie perché questa interferenza è letale embrionale; Le larve L1 allevate fino all'età adulta su pos-1 RNAi si sviluppano in ermafroditi che depongono le uova, ma queste uova sono invivibili²⁵. Il protocollo di alimentazione RNAi è come nel capitolo "Reverse genetics" di Wormbook²⁶.

1. Prima di sincronizzare i vermi, assicurarsi che siano disponibili piastre fresche NGM + pos-1 RNAi da 10 cm. Le piastre possono essere preparate fresche da colture liquide indotte concentrate (+Amp +IPTG) o inoculate come prati su NGM + 100 μg/mL di ampicillina + 1 mM IPTG e lasciate crescere a 25 °C al buio per 1 giorno²⁷.
   NOTA: La carbenicillina (25 μg/ mL) viene spesso utilizzata al posto dell'ampicillina sulle piastre RNAi. L'ampicillina è meno costosa ma meno stabile; se si utilizza ampicillina, i piatti devono essere seminati immediatamente una volta asciutti e utilizzati il prima possibile (possono essere conservati per <1 settimana a 4 °C)²⁷. L'alta concentrazione di antibiotici qui raccomandata contribuirà a garantire una selezione adeguata.
2. Inizia con diverse (in genere da due a quattro) placche NGM con grandi popolazioni di ermafroditi gravidi. Isolare le uova utilizzando la sincronizzazione candeggina-NaOH²⁴.
   1. Lavare i vermi dalle piastre di agar usando 2 ml di ddH_{sterile 2}O per piastra. Distribuire uniformemente il liquido in tubi microcentrifuga da 1,5 ml (un tubo per piastra o ermafroditi).
   2. Spin down per ~ 5 s in una minicentrifuga da banco (2.000 x g) per tirare gli adulti sul fondo dei tubi. Pipettare il surnatante e scartare.
   3. Lavare con 1 mL di ddH₂O sterile; girare verso il basso come prima e scartare il surnatante.
   4. Ripetere il passaggio precedente per ridurre i detriti batterici rimanenti.
   5. Sospendere il contenuto di ciascun tubo in 1 mL di ddH₂O sterile. Aggiungere a ciascun tubo 130 μL di candeggina commerciale (8,25% ipoclorito di sodio) e 130 μL di idrossido di sodio 5 N (NaOH, concentrazione finale 0,5 N).
   6. Tubi a vortice vigorosamente per almeno 10-15 s ogni 2 minuti fino a quando i corpi adulti si sono rotti. Non permettere che il trattamento con candeggina-NaOH duri più di 5 minuti per evitare di uccidere le uova.
   7. Girare in un minicentrifuga per 30-60 s a 2.000 x g per pellettizzare le uova. Pipettare il surnatante e scartare. Ci può essere o non può essere un pellet visibile, questo è normale.
   8. Aggiungere 1 mL di worm buffer M9 e ruotare per 30-60 s a 2000 x g. Scartare il surnatante.
   9. Ripetere la fase di risciacquo (1.2.8) 5x per rimuovere accuratamente la miscela di candeggina-NaOH, rimuovendo il più possibile il surnatante senza disturbare il pellet d'uovo.
   10. Trasferire le uova in 10 mL di tampone a vite senza fine M9 in un tubo conico da 50 mL o in un tubo di coltura da 30 mL con cappuccio. Se si utilizzano tubi conici, lasciare il coperchio leggermente svitato e utilizzare un po 'di nastro adesivo per tenerlo al sicuro. Incubare con agitazione notturna (16 h) a 25 °C e 200 RPM per consentire alle larve di schiudersi.
3. Trasferisci le larve L1 sincronizzate alle placche RNAi per crescere fino all'età adulta.
   1. Aggiungere 2 mL di tampone M9 sterile + 0,01% Triton X-100 (d'ora in poi M9TX-01) a ciascun tubo L1 e trasferire l'intero volume (12 mL) in un tubo conico a vite da 15 mL.
   2. Posizionare tubi da 15 ml con vermi L1 a 4 °C per 10 minuti per rallentare il movimento larvale.
   3. Spin down di tubi conici da 15 mL in una grande centrifuga da tavolo (1.500 x g a 4 °C per 3 min; accelerazione e decelerazione non devono essere superiori all'80% del massimo).
   4. Pipettare con cura il surnatante senza disturbare il pellet L1. Scartare il surnatante.
   5. Aggiungere 12 ml di M9TX-01 freddo a ciascun tubo. Ripetere la centrifugazione. Pipettare con cura e scartare il surnatante. Ogni tubo dovrebbe avere ~ 200 μL rimanenti.
   6. Risciacquare una punta della pipetta da 200 μL in M9TX-01 per evitare che i vermi si attacchino alla plastica, quindi utilizzare questa punta per risospese il pellet di verme. Trasferire i vermi risospesi su piastre pos-1 preparate pipettando gocce di liquido sul prato batterico.
   7. Incubare le piastre a 25 °C fino al primo giorno di età adulta.
      NOTA: Se i vermi crescono su piastre RNAi pos-1 , i vermi DEVONO nutrirsi ad libitum sui batteri RNAi fino a quando non sono completamente passati all'età adulta per garantire un'elevata penetranza del fenotipo embrionale-letale. Controllare le piastre a 24 e 48 h. Se i piatti appaiono affamati o quasi affamati, i vermi dovranno essere spostati in piatti freschi per finire di crescere in adulti a grandezza naturale. Per evitare di esaurire le piastre prima che i vermi vengano coltivati, mirare ad aggiungere 250-500 larve L1 a ciascuna piastra RNAi di 10 cm.
4. Raccogli gli adulti e cancella l'E. coli intestinale per creare vermi privi di germi.
   1. Risciacquare i vermi adulti dalle piastre usando 5 ml di M9TX-01 per piastra. Trasferire tampone + vermi in un tubo conico da 15 ml e consentire agli adulti di depositarsi sul fondo del tubo.
   2. Risciacquare gli adulti con cambi di 10 ml di tampone fresco M9TX-01 fino a quando non rimane torbidità batterica visibile (in genere 1-2x). I tubi possono essere centrifugati a 700 x g per 30 s a vermi pellet, oppure gli adulti possono essere autorizzati a depositarsi per gravità.
   3. Eseguire un lavaggio aggiuntivo con 10 ml di M9TX-01 per ridurre i batteri esterni.
   4. Trasferire i vermi in tubi conici da 50 mL o tubi di coltura da 30 mL contenenti 5 mL S Medium + 2x E. coli OP50 termoidenti (~5 x 10⁹ cellule uccise/mL) + 200 μg/mL di gentamicina + 50 μg/mL di cloramfenicolo. Se si utilizzano tubi conici, lasciare il coperchio leggermente svitato e utilizzare un po 'di nastro adesivo per tenerlo al sicuro. Utilizzare pipette di vetro o risciacquare pipette di plastica in M9TX-01 per evitare che i vermi si attacchino.
   5. Incubare adulti a 25 °C con agitazione a 200 RPM per 24-48 ore per produrre adulti privi di germi.
      NOTA: Se i vermi devono rimanere negli antibiotici per >24 ore, potrebbe essere necessario aggiungere più OP50 ucciso dal calore per garantire che i vermi abbiano una fonte di cibo adeguata. Controllare i tubi a 24 ore e integrare con OP50 ucciso termicamente se la torbidità è visibilmente ridotta.
5. Il saccarosio lava gli adulti secondo i protocolli Wormbook²⁴ per ottenere scorte pulite, riproduttivamente sterili e sincronizzate per soli adulti per la colonizzazione batterica.
   1. Assicurarsi che i volumi freddi di saccarosio al 60%, worm buffer M9 e M9TX-01 siano pronti per l'uso. Per semplicità, questi possono essere lasciati a 4 °C la sera prima.
   2. Per ogni campione da lavare, creare un tubo conico da 15 mL etichettato contenente 8 mL di M9TX-01 e mettere da parte sul ghiaccio. Questi saranno necessari nel passaggio 1.5.10.
   3. Aggiungere 5 mL di M9TX-01 a ciascun tubo da 50 mL contenente larve L1. Trasferire l'intero volume (ora 10 mL) in un tubo conico a vite vuoto da 15 mL e consentire agli adulti di depositarsi sul fondo del tubo.
   4. Pipettare con cura il surnatante e scartare.
   5. Aggiungere 10 mL M9TX-01 a ciascun tubo e spostare i tubi in un secchiello del ghiaccio per 5-10 minuti.
      NOTA: a partire da questo punto, i vermi e tutti i buffer devono essere mantenuti sul ghiaccio.
   6. Utilizzare l'impostazione "temperatura rapida" per raffreddare una grande centrifuga da tavolo a 4 °C.
   7. Aggiungere 10 ml di M9TX-01 freddo a ciascun tubo per risciacquare eventuali detriti rimanenti. Lascia che i vermi si depositino sul ghiaccio; rimuovere il surnatante e scartare.
   8. Galleggiante di saccarosio: aggiungere 5 mL di tampone M9 freddo e 5 mL di soluzione fredda al 60% di saccarosio in ciascun tubo, mescolando accuratamente. Quindi, far galleggiare con attenzione 1 mL di tampone M9 freddo sopra la miscela tampone di saccarosio in ciascun tubo. Non mescolare dopo che il galleggiante è stato aggiunto.
      ATTENZIONE: Muoviti rapidamente per i prossimi passi: i vermi possono essiccare se esposti ad alte concentrazioni di saccarosio per troppo tempo!
   9. Centrifugare a 1500 x g per 3 min a 4 °C. I vermi adulti vivi saranno all'interfaccia tra m9 e saccarosio, a circa 1 mL dalla parte superiore del tubo.
   10. Utilizzare una pipetta sierologica di vetro da 5 mL per trasferire lo strato di vite senza fine in tubi conici da 15 mL preparati con M9TX-01 freddo (dal passaggio 1.5.2). Fai molta attenzione a ottenere lo strato di vermi vivi senza pipettare troppo del saccarosio.
   11. Se necessario, aggiungere M9TX-01 per ottenere volumi uguali di 10-12 ml / tubo. Centrifugare a 1500 x g a 4 °C per 1 min, quindi pipettare il surnatante. I vermi possono essere riportati a temperatura ambiente a questo punto.
   12. Ripetere due volte la fase di lavaggio 1.5.11, riducendo la velocità a 700 x g a 4 °C e il tempo a 30 s.

2. Nutrire i vermi con batteri vivi in coltura liquida

NOTA: Questo protocollo viene utilizzato per colonizzare vermi con batteri cresciuti in laboratorio in condizioni ben miscelate in coltura liquida (Figura supplementare 1). I vermi possono essere colonizzati con singoli isolati di coltura pura (ad esempio, agenti patogeni come Enterococcus faecium ^28,29) o miscele di isolati (ad esempio, comunità minime di microbioma¹⁴).

1. Inizia con vermi adulti sincronizzati lavati con saccarosio dal passaggio 1.5 del protocollo in un tubo conico da 15 ml. Lavare i vermi una volta in 12 ml di tampone S e scartare il surnatante.
2. Risospesciare i vermi lavati nel volume di S medium necessario per l'esperimento. Considera il volume delle condizioni sperimentali, il numero di condizioni su cui i vermi saranno divisi e le concentrazioni finali di vermi e batteri.
   NOTA: l'alimentazione nei vermi varia con la disponibilità batterica³⁰ e i vermi possono essere stressati affollando³¹. Per la colonizzazione in coltura liquida, si raccomandano <1000 vermi/mL e >10⁷ CFU/mL; 10¹¹ CFU/mL è considerata densità di alimentazione "ad libitum" su E. coli³².
3. Spin down colture batteriche. Versare il surnatante; l'aspirazione o il pipettaggio possono essere utilizzati per rimuovere il surnatante per i batteri che formano pellet sciolti.
   NOTA: per colture >5 mL, trasferire su tubi da 15 mL e ruotare a ~ 2800 x g in una grande centrifuga da tavolo per 8-10 min. Le colture <5 mL possono essere trasferite in tubi da 1,5 mL e centrifugate a 9000 x g per 1-2 minuti in una piccola centrifuga da tavolo. I batteri altamente mobili (ad esempio, molte specie di Pseudomonas) potrebbero dover essere refrigerati a 4 °C per 10-15 minuti per facilitare la formazione di un pellet stabile, e potrebbe essere meglio centrifugare a 4 °C.
4. Risospendare le colture batteriche in un volume di tampone S e centrifugare di nuovo a pellet. Rimuovere e scartare il surnatante come prima.
5. Risospese le colture batteriche in mezzo S alla densità desiderata per l'esperimento, più eventuali antibiotici per la selezione. Gli antibiotici da utilizzare, se presenti, dipenderanno dal profilo di resistenza dei batteri utilizzati per la colonizzazione.
6. Utilizzando una punta di pipetta rivestita in M9TX-01, i vermi delle pipette si insinuano delicatamente su e giù fino a quando i vermi non vengono completamente risospesi nel mezzo S, quindi trasferiscono su tubi o pozzetti di piastre per la colonizzazione batterica.
7. Aggiungere la sospensione batterica a ciascuna coltura di vermi per raggiungere la concentrazione batterica desiderata e il volume finale.
8. Se si utilizza una piastra multi-pozzo per la colonizzazione, coprire la piastra con una membrana sigillante sterile permeabile al gas a 96 pozzetti.
9. Incubare con agitazione a 200 RPM per evitare che i batteri si depositino durante l'incubazione.

3. Interruzione meccanica dei singoli vermi in un formato a 96 pozzetti

NOTA: Questa sezione descrive un protocollo di formato piastra a 96 pozzetti per l'interruzione meccanica di singoli C. elegans colonizzati battericamente. I primi passi del protocollo (3.1-3.8) descrivono un metodo per eliminare i batteri non aderenti dall'intestino del verme e pulire l'esterno dei vermi usando la paralisi a freddo e lo sbiancamento superficiale. Questi passaggi produrranno vermi adulti puliti e vivi che possono essere interrotti meccanicamente per la quantificazione del contenuto batterico (3.8-end) o utilizzati per ulteriori esperimenti (Figura supplementare 1). Questo protocollo può essere adattato per quantificare i batteri nei vermi colonizzati in coltura liquida (Sezione 2), su piastre di agar o da terreno naturale o microcosmo.

1. Posizionare un'aliquota di M9TX-01 sul ghiaccio per raffreddare (4-5 volte il numero di campioni in ml).
2. Preparare un'aliquota di M9TX-01 + candeggina (6% di ipoclorito di sodio, 1:1000 o 1:2000 v/v, 1 mL per campione + 1 mL extra) e mettere sul ghiaccio per raffreddare. Questa aliquota sarà utilizzata nella fase 3.8.
3. Preparare piastre a 96 pozzetti per la diluizione seriale di campioni di worm interrotti.
   1. Ottenere piastre sterili da 300 μL capacità 96 pozzetti con coperchi; questo protocollo utilizza una piastra di diluizione per 12 vermi digeriti.
   2. Utilizzare un pipettor multicanale a 96 pozzetti per riempire le file B-D di ogni piastra a 96 pozzetti (capacità di 300 μL) con 180 μL di 1 buffer PBS. Lasciare vuota la riga superiore. Le righe B-D diventeranno diluizioni seriali 10x dei digest worm [0,1x, 0,01x, 0,01x].
   3. Mettere da parte i piatti. Le piastre di diluizione saranno utilizzate nel passaggio 3.13.
4. Sospendere ogni campione di verme in 1 mL di M9TX-01 in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL.
5. Ruotare brevemente i tubi (2-3 s) in una minicentrifuga a bassa velocità (2.000 x g) a 25 °C per pellet adulti. Pipettare il surnatante e scartare, assicurandosi di non disturbare il pellet di verme.
6. Utilizzando le impostazioni di centrifugazione nel passaggio 3.5, sciacquare i vermi due volte con 1 mL di M9TX-01, quindi una volta con 1 mL di tampone worm M9, per ridurre i batteri esterni.
7. Eliminare i batteri non aderenti dall'intestino del verme.
   1. Risospesare ogni campione di vermi in 1 mL di S medio + 2x OP50 ucciso termicamente in un tubo di coltura.
   2. Incubare a 25 °C per 20-30 minuti per consentire il passaggio di eventuali batteri non aderenti dall'intestino.
      NOTA: Questo eliminerà anche qualsiasi proteina fluorescente extracellulare dal lume e consentirà una visualizzazione più chiara dei batteri etichettati aderenti all'epitelio intestinale, in particolare quando vengono utilizzati fluorofori acido-veloci (ad esempio, mCherry, dsRed).
8. Vermi di candeggina superficiale per eliminare i batteri esterni.
   1. Risciacquare i vermi eliminati due volte con 1 mL di M9TX-01 freddo ed eliminare il surnatante.
   2. Lasciare raffreddare i tubi per 10 minuti su ghiaccio (preferibilmente) o a 4 °C. Ciò paralizzerà i vermi e impedirà l'ingestione di candeggina.
      NOTA: Altri protocolli utilizzano un agente di paralisi chimica come il levamisolo; si tratta di un approccio consolidato³³ che richiede l'aggiunta di un flusso di rifiuti pericolosi.
   3. Aggiungere 1 mL di tampone a vite senza fine M9 ghiacciato + candeggina non profumata (8,25% idrossido di sodio, 1:1000 o 1:2000 v/v) a ciascun tubo. Lasciare che i tubi si siedano sul ghiaccio (preferibilmente) o a 4 °C per almeno 10 minuti per uccidere i batteri esterni.
      NOTA: Non superare la concentrazione di candeggina 1:1000. Anche nei vermi paralizzati, la mortalità può risultare.
   4. Pipettare fuori dal tampone di candeggina e scartare; riportare i tubi sul ghiaccio per garantire che i vermi non riprendano a pompare fino a quando la candeggina non viene eliminata.
   5. Aggiungere 1 mL di M9TX-01 freddo a ciascun tubo. Spin per ~5 s in una minicentrifuga (2.000 x g a 25 °C); riportare i tubi al ghiaccio. Rimuovere il surnatante e scartare.
   6. Ripetere questa fase di risciacquo con un altro 1 mL di M9TX-01 freddo, scartando il più possibile il surnatante.
      NOTA: Se si utilizzano vermi per ulteriori esperimenti, saltare la fase di permeabilizzazione (Protocollo 3.9) e trasferire invece gli adulti appena sbiancati in superficie in un tampone ghiacciato in una capsula di Petri di 6 cm e separare i vermi in condizioni sperimentali come nel Protocollo 3.10. Mantenere i vermi freddi per evitare che la motilità riprenda, ma lavorare rapidamente - mantenere i vermi per >30 minuti sul ghiaccio può potenzialmente comportare < ripresa al 100% della normale attività³⁴.
9. Permeabilizzazione chimica della cuticola vermiforme con sodio dodecil solfato e ditiotrikgil (0,25% SDS + 300 mM DTT) (basato su³⁵)
   ATTENZIONE: DTT è un agente riducente e irritante. Indossare DPI e lavorare in una cappa aspirante quando si maneggiano scorte o soluzioni asciutte. È necessario un flusso di rifiuti pericolosi.
   1. Nella cappa aspirante, preparare una soluzione SDS/DTT sufficiente per consentire 100 μL per ogni campione. Per 1 mL, fino a 965 μL di tampone worm M9 o M9TX-01 in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL, aggiungere 5 μL di SDS al 5% (p/v) e 30 μL di 1M DTT.
      NOTA: la soluzione di DTT da 1 M (acquosa) deve essere preparata fresca o conservata in aliquote a -20 °C per garantire la potenza. Le aliquote dovrebbero essere dimensionate per essere utilizzate in due o tre esperimenti per evitare un eccessivo ciclo di congelamento-scongelamento.
   2. Spostare i tubi microcentrifuga contenenti vermi sbiancati in superficie in un rack per tubi a temperatura ambiente. Ogni tubo deve contenere vermi in ~ 20 μL di tampone.
   3. Aggiungere 100 μL di soluzione SDS/DTT a ciascun campione di worm. Smaltire qualsiasi soluzione SDS/DTT rimanente nel flusso di rifiuti pericolosi appropriato.
   4. Lasciare che il trattamento proceda fino a 8 minuti sul banco per abbattere parzialmente la cuticola resistente dei vermi adulti. I vermi moriranno e si depositeranno sul fondo del tubo durante questo periodo.
   5. Dopo che il tempo di permeabilizzazione è scaduto, pipettare con cura il surnatante SDS / DTT e smaltirlo in un flusso di rifiuti pericolosi SDS / DTT appropriato.
   6. Aggiungere 1 mL di M9TX-01 a ciascun tubo. Ruotare brevemente in una centrifuga da tavolo per pellettificare i vermi o consentire ai vermi di depositarsi per gravità sul fondo dei tubi, quindi estrarre il surnatante e smaltire in un flusso di rifiuti pericolosi SDS / DTT.
   7. Sospendere i worm in 1 mL M9 worm buffer + 0,1% Triton X-100 fino a quando non è pronto per l'uso.
10. Separare i vermi in una profonda piastra a 96 pozzetti con graniglia di carburo di silicio per interruzioni meccaniche. Preparare la piastra di interruzione a 96 pozzetti come sotto.
    1. Ottenere una piastra sterile da 2 ml a 96 pozzetti profondi e un coperchio in silicone a 96 pozzetti corrispondente.
       NOTA: è importante utilizzare piastre compatibili con gli adattatori a 96 pozzetti per il disgregatore tissutale. Piccole differenze nelle dimensioni esterne fanno la differenza tra una piastra che può essere rimossa dagli adattatori e una che non può.
    2. Usando una spatola sterile, aggiungi una piccola quantità di carburo di silicio sterile a grana 36 a ciascun pozzetto della piastra che riceverà un verme. Utilizzare abbastanza grana per coprire a malapena il fondo del pozzo (circa 0,2 g per pozzetto). Il materiale eccessivo renderà difficile ottenere una punta di pipetta sul fondo del pozzo quando si recupera il contenuto.
    3. Aggiungere 180 μL di worm buffer M9 a ciascun pozzetto.
    4. Etichettare le colonne o le righe per indicare dove andrà ogni campione, quindi coprire liberamente la piastra con il coperchio della piastra in silicio a 96 pozzetti.
11. Trasferire i singoli vermi alla piastra a 96 pozzetti per l'interruzione.
    1. Spostare attentamente i vermi permeabilizzati su una piccola capsula di Petri (35 o 60 mm) contenente un M9TX-01 sufficiente per riempire il piatto a una profondità di ~ 1 cm.
       NOTA: se è presente un gran numero di vermi, potrebbe non essere possibile trasferire l'intero campione poiché il liquido diventerà affollato e sarà difficile pipettare singoli vermi.
    2. Utilizzando un microscopio di dissezione o un altro dispositivo a basso ingrandimento, pipettare i singoli vermi in volumi di 20 μL e trasferire questi vermi ai singoli pozzetti della piastra a 96 pozzetti.
       NOTA: è meglio raccogliere solo vermi appena uccisi. Evitare vermi con una forma lineare rigida, in quanto questi vermi potrebbero essere morti da qualche tempo. Prova a prendere vermi curvi o a forma di S, con normale fisiologia grossolana e un intestino intatto.
    3. Dopo aver trasferito ogni volume, assicurarsi che il worm selezionato sia stato effettivamente espulso nel pozzo. Per fare questo, pipettare fino a 20 μL di M9TX-01 da un'area chiara della piastra di Petri e rilasciare l'intero volume nella piastra; questo normalmente espellerà il worm se è attaccato alla pipetta. Se il worm è rimasto bloccato, rimuovere 20 μL dal pozzo e riprovare il trasferimento.
    4. Una volta trasferiti tutti i vermi, coprire la piastra a 96 pozzetti con un foglio di pellicola sigillante flessibile con supporto cartaceo disponibile in commercio (2 x 2 quadrati), assicurandosi che il lato cartaceo del film sigillante sia rivolto verso il basso sui pozzetti del campione. Fare attenzione a non allungare il film sigillante troppo sottile, o sarà molto difficile da rimuovere in seguito.
    5. Posizionare leggermente il tappetino sigillante in silicone sopra il film sigillante flessibile; non premere il coperchio nei pozzetti in questo momento.
    6. Spostare la piastra a 4 °C per raffreddare per 30-60 minuti. Ciò impedirà il surriscaldamento durante l'interruzione, che può danneggiare i campioni.
       NOTA: questo è un punto di interruzione nel protocollo. Nella maggior parte dei casi, la piastra può essere lasciata a 4°C per un massimo di 4 ore prima della macinazione. Non lasciare i vermi durante la notte, poiché ciò cambierà la conta batterica.
12. Carica piastre a 96 pozzetti su un distruttore di tessuto per rompere i tessuti dei vermi e rilasciare batteri intestinali.
    NOTA: (Opzionale) Se si utilizza un numero dispari di piastre da 96 pozzetti per i digest, è necessario preparare un contrappeso prima di procedere. Utilizzare una piastra vuota profonda da 96 pozzetti e riempire i pozzetti con acqua fino a quando non pesa lo stesso della prima piastra.
    1. Premere saldamente il tappetino sigillante in silicone nei pozzetti per creare una guarnizione, assicurandosi che il coperchio sia piatto su tutta la superficie della piastra.
       NOTA: se il film sigillante flessibile è troppo spesso dopo lo stiramento, sarà difficile fissare il coperchio in silicone in modo che sia piatto in tutti i pozzetti. Ciò si tradurrà in una tenuta insufficiente e in una contaminazione da pozzo a pozzo durante l'agitazione.
    2. Fissare le piastre nel disgregatore tissutale utilizzando gli adattatori per piastre a 96 pozzetti. Agitare le piastre per 1 minuto a 30 Hz, quindi ruotare le piastre di 180 ° e agitare di nuovo per 1 minuto. Ciò contribuirà a garantire un'interruzione uniforme in tutti i pozzetti della piastra.
    3. Tocca saldamente le piastre sul banco due o tre volte per rimuovere qualsiasi grana dal film sigillante flessibile.
    4. Utilizzando una grande centrifuga con due adattatori a piastre da 96 pozzetti, ruotare le piastre a 2400 x g per 2 minuti per raccogliere tutto il materiale sul fondo dei pozzetti.
    5. Rimuovere il coperchio in silicone e staccare con cura il film sigillante flessibile.
       NOTA: se il film sigillante flessibile si attacca in uno qualsiasi dei pozzetti, utilizzare una punta della pipetta da 200 μL per rimuoverlo. Questo è comune quando il film sigillante flessibile è stato allungato troppo sottile.
13. Campioni di digest di worm diluiti in serie in 300 μL in piastre a 96 pozzetti.
    1. Utilizzando un pipetttor multi-pozzo impostato su 200 μL, pipettare su e giù più volte lentamente e con attenzione per rimescolare il contenuto dei pozzetti, quindi estrarre il più possibile il liquido. Trasferire questo liquido nelle file superiori delle piastre a 96 pozzetti preparate al punto 3.3.
    2. Utilizzando un pipettor a 96 pozzetti impostato su 20 μL, rimuovere questo volume di liquido dalla fila superiore ed erogare nella riga B. Pipetta su e giù 8-10x per mescolare. Scartare le punte.
    3. Ripetere il passaggio 3.13.2, partendo dai campioni 0,1x nella riga B per creare campioni di diluizione 0,01x nella riga C.
    4. Ripetere nuovamente il passaggio 3.13.2, passando dalla riga C alla riga D.
    5. Piastra su agar solido per la quantificazione batterica. Per i vermi monocolodicizzati, è generalmente sufficiente placcare 10-20 μL gocce di ogni diluizione [1x-0,001x] su piastre di agar. Per la colonizzazione multispecie, placcare ogni diluizione separatamente pipettando 100 μL su una piastra di agar di 10 cm; diffondere immediatamente utilizzando perline di vetro.

4. Pulizia della graniglia di carburo di silicio per il riutilizzo

NOTA: Questa procedura viene utilizzata per pulire e sterilizzare il materiale di macinazione, graniglia di carburo di silicio, per il riutilizzo dopo gli esperimenti. Questo protocollo deve essere seguito nella sua interezza prima del primo utilizzo, poiché la graniglia di carburo di silicio è un prodotto industriale e non viene pre-sterilizzata. La graniglia in carburo di Si (3,2 g/cc) è un materiale denso e ruvido che funziona in modo efficiente per interrompere i campioni difficili. Tuttavia, le particelle possono consumarsi a causa di un uso ripetuto e devono essere sostituite quando l'usura diventa evidente. Fortunatamente, il materiale è economico e le dimensioni tipicamente vendute (~ 1 lb) sono sufficienti per molti esperimenti.

1. Dopo aver rimosso i campioni per la placcatura, aggiungere la soluzione di candeggina al 10% a tutti i pozzetti della piastra a 96 pozzetti e lasciare riposare per almeno 10 minuti.
2. Rimuovere la maggior parte della grana invertendo rapidamente la piastra a 96 pozzetti su un piccolo vassoio a lato alto o un contenitore vuoto P1000 pipetta abbastanza grande da catturare tutto il contenuto. La graniglia affonderà immediatamente sul fondo del vassoio. Versare la soluzione di candeggina in un lavandino.
3. Riempire nuovamente la piastra da 96 pozzetti con acqua di rubinetto e capovolgere nello stesso vassoio per risciacquare la graniglia rimanente. Versare l'acqua nel lavandino.
4. Ripeti da una a tre volte con l'acqua del rubinetto fino a quando il piatto è completamente privo di graniglia.
5. Risciacquare la grana 2x in acqua di rubinetto, riempiendo ogni volta il vassoio.
   NOTA: La piastra a pozzetto profondo da 96 pozzetti può essere lavata in lavastoviglie da laboratorio, coperta saldamente con un foglio e autoclavata con altre materie plastiche riutilizzabili. La graniglia non ha bisogno di essere lavata immediatamente e può essere messa da parte a questo punto. La graniglia usata viene solitamente accumulata da più esperimenti prima del lavaggio e dell'autoclave.
6. Lavare la graniglia in una soluzione di detergente da laboratorio per 30 minuti, agitando occasionalmente ruotando o mescolando con una spatola metallica.
7. Risciacquare tutte le tracce di detergente in diversi (8-10) cambi di acqua di rubinetto, quindi risciacquare 2 volte con acqua distillata.
8. Stendere la graniglia in un vassoio aperto, come un vassoio per autoclave in polipropilene poco profondo, e asciugare a 40-70 °C per diverse ore.
   NOTA: Se la grana è grumosa quando è asciutta, non è stata pulita o risciacquata a sufficienza. Ripetere il protocollo di pulizia a partire dal passaggio 4.6, aggiungendo ulteriori risciacqui nel passaggio 4.7.
9. Distribuire graniglia pulita e asciutta in bottiglie di vetro autoclavabile a vite fino a una profondità massima di 5-6 cm. Autoclave su ciclo pre-vuoto per 30 minuti per sterilizzare.

Risultati

Sterilizzazione con candeggina di vermi vivi
I vermi sbiancati in superficie sono effettivamente privi di batteri esterni fino a quando la motilità ritorna e l'escrezione riprende. Nelle condizioni qui utilizzate, si osserva una rapida estinzione dei batteri nel tampone (Figura 1A-C, Figura supplementare 2, Video 1) senza disturbare i batteri associati all'intestino nei vermi paralizzati dal freddo (Figura 1D-F

Discussione

Qui vengono presentati i dati sui vantaggi della quantificazione a verme singolo della carica batterica in C. elegans, insieme a un protocollo di interruzione a 96 pozzi per consentire l'acquisizione rapida e coerente di grandi set di dati di questo tipo. Rispetto ai metodi esistenti³³, questi protocolli consentono una misurazione a più alto rendimento delle comunità microbiche intestinali nel verme.

Questo approccio ha la placcatura come un passaggio limitan...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL	Evergreen Labware	290-8350-03F
96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat)	Axygen	AM-2ML-SQ
96-well plates, 2 mL, square wells	Axygen	P-2ML-SQ-C-S
96-well polypropylene plate lids	Evergreen Labware	290-8020-03L
Agar	Fisher Scientific	443570050
Bead mill adapter set for 96-well plates	QIAGEN	119900	Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II
Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II)	QIAGEN	85300	Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption
BioSorter	Union Biometrica	By quotation	Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans
Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite	Clorox
Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane	Diversified Biotech	BEM-1	Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box.
Calcium chloride dihydrate	Fisher Scientific	AC423525000
Cholesterol	VWR	AAA11470-30
Citric acid monohydrate	Fisher Scientific	AC124910010
Copper (II) sulfate pentahydrate	Fisher Scientific	AC197722500
Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge	Corning	COR-6765
Disodium EDTA	Fisher Scientific	409971000
DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics	Fisher Scientific	327190010
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural	Eppendorf
Eppendorf 5424R microcentrifuge	Eppendorf	5406000640	24-place refrigerated benchtop microcentrifuge
Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104	Eppendorf	22627040	3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates
Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104	Eppendorf	22638930
Ethanol 100%	Fisher Scientific	BP2818500
Glass beads, 2.7 mm	Life Science Products	LS-79127
Glass beads, acid-washed, 425-600 µm	Sigma	G877-500G
Glass plating beads	VWR	76005-124
Hydrochloric acid	VWR	BDH7204-1
Iron (II) sulfate heptahydrate	Fisher Scientific	423731000
Kimble Kontes pellet pestle motor	DWK Life Sciences	749540-0000
Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL	DWK Life Sciences	749520-0590
Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage	Leica	11889113
Leica LAS X Premium software	Leica	11640687
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher Scientific	AC124900010
Manganese(II) chloride tetrahydrate	VWR	470301-706
PARAFILM M flexible laboratory sealing film	Amcor	PM996
Peptone	Fisher Scientific	BP1420-500
Petri dishes, round, 10 cm	VWR	25384-094
Petri dishes, round, 6 cm	VWR	25384-092
Petri dishes, square, 10 x 10 cm	VWR	10799-140
Phospho-buffered saline (1X PBS)	Gold Bio	P-271-200
Polypropylene autoclave tray, shallow	Fisher Scientific	13-361-10
Potassium hydroxide	Fisher Scientific	AC134062500
Potassium phosphate dibasic	Fisher Scientific	BP363-1
Potassium phosphate monobasic	Fisher Scientific	BP362-1
R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443	R Foundation	n/a
Scoop-type laboratory spatula, metal	VWR	470149-438
Silicon carbide 36 grit	MJR Tumblers	n/a	Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor.
Sodium dodecyl sulfate	Fisher Scientific	BP166-100
Sodium hydroxide	VWR	BDH7247-1
Sodium phosphate dibasic anhydrous	Fisher Scientific	BP332-500
Sodum chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Sucrose	Fisher Scientific	AC419760010
Tri-potassium citrate monohydrate	Fisher Scientific	AC611755000
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
Zinc sulfate heptahydrate	Fisher Scientific	AC205982500