Trapianto cardiaco cervicale eterotopico di topo utilizzando bracciali vascolari

Riepilogo

I modelli di trapianto cardiaco murino rappresentano preziosi strumenti di ricerca per lo studio dell'immunologia dei trapianti. Il presente protocollo descrive il trapianto cardiaco cervicale eterotopico di topo che prevede il posizionamento di polsini sull'arteria carotide comune del ricevente e sul tronco dell'arteria polmonare del donatore per consentire il flusso sanguigno laminare.

Abstract

I modelli murini di trapianto cardiaco sono frequentemente utilizzati per studiare il danno da ischemia-riperfusione, le risposte immunitarie innate e adattative dopo il trapianto e l'impatto delle terapie immunomodulatorie sul rigetto del trapianto. Il trapianto di cuore cervicale eterotopico nei topi è stato descritto per la prima volta nel 1991 utilizzando anastomosi suturate e successivamente modificato per includere tecniche di bracciale. Questa modifica ha permesso di migliorare le percentuali di successo e, da allora, ci sono stati più rapporti che hanno proposto ulteriori miglioramenti tecnici. Tuttavia, la traduzione in un utilizzo più diffuso rimane limitata a causa della difficoltà tecnica associata alle anastomosi dell'innesto, che richiede precisione per ottenere una lunghezza e un calibro adeguati dei polsini per evitare torsioni anastomotiche vascolari o tensione eccessiva, che possono causare danni all'innesto. Il presente protocollo descrive una tecnica modificata per l'esecuzione di trapianto cardiaco cervicale eterotopico nei topi che prevede il posizionamento del bracciale sull'arteria carotide comune del ricevente e sull'arteria polmonare del donatore in allineamento con la direzione del flusso sanguigno.

Introduzione

Abbott et al. hanno pubblicato¹ la prima descrizione del trapianto di cuore addominale eterotopico nei ratti nel 1964. Queste tecniche chirurgiche sono state perfezionate e semplificate da Ono et al. nel 1969². Corry et al. hanno descritto per la prima volta un metodo per il trapianto di cuore addominale eterotopico nei topi nel 1973; Analogamente ai modelli di ratto precedentemente riportati, ciò ha comportato l'attecchimento nell'addome dell'ospite con rivascolarizzazione mediante anastomosi end-to-side dell'arteria polmonare del donatore e dell'aorta ascendente alla vena cava inferiore e all'aorta addominale del ricevente, rispettivamente³. Il trapianto eterotopico di cuore cervicale nei ratti è stato descritto da Heron nel 1971 utilizzando polsini in teflon costituiti da cateteri endovenosi da 16 G (diametro esterno 1,6 mm)⁴. Chen⁵ e Matsuura et ^al.6 hanno successivamente riportato il trapianto di cuore cervicale eterotopico nei topi nel 1991, le cui tecniche differivano principalmente nel loro metodo di ri-anastomosi. L'approccio di Chen prevedeva anastomosi suturate dell'aorta ascendente del donatore all'arteria carotide del ricevente e dell'arteria polmonare del donatore alla vena giugulare esterna del ricevente⁵. A causa delle avanzate competenze tecniche richieste per queste anastomosi suturate microchirurgiche, è stata necessaria una notevole quantità di tempo ed esperienza per ottenere un alto tasso di successo. Matsuura et al. hanno descritto un metodo che utilizza una tecnica di bracciale senza sutura, simile a quella usata da Heron, che prevedeva anastomosi end-to-end usando il posizionamento extra-luminale dei polsini. Ha modellato polsini in teflon da 22 G (diametro esterno 0,8 mm) e 24 G (diametro esterno 0,67 mm) cateteri endovenosi e li ha posizionati sulla vena giugulare esterna del ricevente e sull'arteria carotide comune, rispettivamente⁶. Questi polsini sono stati quindi posizionati all'interno dell'arteria polmonare e dell'aorta del donatore e fissati legando una legatura di sutura attorno alla connessione. Questo approccio si è tradotto in un migliore tasso di successo. Ancora più importante, ha comportato una riduzione del tempo necessario per completare entrambe le anastomosi cervicali, riducendo così il tempo ischemico caldo dell'innesto a meno di un terzo di quello che utilizza il metodo di sutura addominale. Inoltre, poiché i polsini sono posizionati attorno alla superficie esterna della nave, non vi è alcun corpo estraneo esposto al lume del vaso, il che riduce in gran parte la possibilità di trombosi dopo l'intervento chirurgico⁷. Nel frattempo, l'utilizzo della tecnica del bracciale fornisce supporto intorno ai vasi nel sito dell'anastomosi senza richiedere alcuna sutura, il che riduce il rischio di sanguinamento dopo la rivascolarizzazione⁶.

Sono state proposte numerose revisioni di questa tecnica. Per adattarsi alla breve lunghezza dell'arteria carotide comune del topo (circa 5 mm), Tomita et ^al.8 hanno sviluppato una modifica di questa tecnica con un bracciale arterioso più piccolo (diametro esterno di 0,6 mm) omettendo invece di tenere le suture e tirare l'arteria direttamente attraverso il bracciale con una pinza fine. Wang et al. hanno ulteriormente semplificato questo approccio posizionando bracciali da 22 G e 24 G sull'arteria polmonare destra del donatore e sull'arteria carotide comune destra del ricevente, rispettivamente⁹. Vari rapporti hanno descritto modifiche a questi approcci, tra cui l'uso di bracciali specializzati, morsetti microchirurgici, dilatatori dei vasi e cardioplegia^10,11,12. In particolare, tutti questi metodi comportano la circolazione retrograda del sangue attraverso il cuore, con il sangue che scorre dall'arteria carotide comune ricevente all'aorta del donatore, alle arterie coronarie, al seno coronarico, quindi si svuota nell'atrio destro ed esce dall'arteria polmonare nella vena giugulare esterna ricevente.

Rispetto all'attecchimento nell'addome, il trapianto cardiaco cervicale offre molteplici vantaggi. Come accennato in precedenza, l'esposizione cervicale consente una rivascolarizzazione più rapida e tempi ischemici caldi più brevi⁶. Il metodo cervicale è anche meno invasivo ed è associato a tempi di recupero postoperatorio più brevi in quanto evita una laparotomia⁶. È importante sottolineare che le anastomosi end-to-end con bracciali possono essere eseguite invece di anastomosi end-to-side, il che riduce il rischio di complicanze come il sanguinamento anastomotico. L'approccio addominale comporta anche un aumentato rischio di sviluppare complicanze trombotiche nell'aorta addominale o nella vena cava inferiore, portando a ischemia del midollo spinale e paralisi degli arti posteriori. La posizione cervicale superficiale del trapianto consente un facile accesso alla valutazione della vitalità dell'innesto mediante palpazione, elettrocardiografia e imaging invasivo o non invasivo. Sebbene gli innesti cervicali riprendano l'attività cardiaca spontanea dopo la riperfusione, non impattano significativamente sui parametri sistolici e diastolici del ricevente. Questo modello fornisce informazioni preziose per studiare le risposte cellulari dopo il trapianto, come il danno da ischemia-riperfusione e il rigetto del trapianto. Inoltre, questo modello offre un approccio ideale per consentire l'imaging post-trapianto, come la microscopia intravitale a due fotoni o la tomografia a emissione di positroni (PET). A tal fine, il nostro laboratorio ha precedentemente riportato metodi per visualizzare tessuti e organi in movimento nel topo, tra cui il battito di cuori murini e innesti di arco aortico dopo trapianto cervicale eterotopico per visualizzare il traffico leucocitario durante la lesione da ischemia-riperfusione e all'interno delle placche aterosclerotiche, rispettivamente^13,14,15 . Inoltre, grazie alla sua posizione superficiale e alla facilità di esposizione, questo modello è adatto per il retrapianto cardiaco¹⁶.

Questo rapporto descrive una tecnica che consente il flusso sanguigno laminare con il posizionamento esterno dei polsini vascolari sui vasi da cui proviene il flusso sanguigno. Ciò consente una transizione graduale del flusso sanguigno da un vaso all'altro, evitando l'esposizione del bordo distale del vaso nel lume vascolare. Inoltre, la tecnica utilizza un bracciale più grande da 20 G, invece dei polsini da 22 G precedentemente utilizzati, per l'arteria polmonare del donatore per garantire un ampio ritorno del flusso sanguigno al ricevente.

Protocollo

Tutte le procedure di gestione degli animali sono state condotte in conformità con le linee guida NIH Care and Use of Laboratory Animals e approvate dal Comitato per gli studi sugli animali presso la Washington University School of Medicine. I cuori di topi C57BL/6 (B6) e BALB/c (del peso di 20-25 g) sono stati trapiantati in riceventi B6 di sesso (6-8 settimane di età). I topi sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali). Sono stati eseguiti trapianti singeneici per valutare le risposte cellulari correlate al danno da ischemia-riperfusione e sono stati eseguiti trapianti allogenici per studiare i meccanismi immunitari coinvolti nella tolleranza e nel rigetto del trapianto. B6 lisozima M-green fluorescent protein (LysM-GFP) topi reporter¹⁷, originariamente ottenuti da Klaus Ley del La Jolla Institute for Allergy and Immunology, La Jolla, CA, e successivamente allevati nella nostra struttura, sono stati utilizzati come destinatari per esperimenti selezionati per visualizzare l'infiltrazione di neutrofili negli innesti cardiaci. La chirurgia di sopravvivenza è stata eseguita utilizzando procedure asettiche.

1. Procedura del donatore

1. Anestetizzare i topi iniettando ketamina (80−100 mg/kg) e xilazina (8−10 mg/kg) (vedere Tabella dei materiali) per via intraperitoneale nel topo donatore. Confermare il piano chirurgico dell'anestesia con pizzico di punta e coda.
2. Preparare l'area chirurgica radendo i capelli dal torace e dall'addome usando un rasoio elettrico.
3. Somministrare 100 unità di eparina (vedere Tabella dei materiali) per via endovenosa nella vena del pene (maschi) o nella vena giugulare esterna (maschi o femmine).
4. Metti i topi in posizione supina con gli arti anteriori sopra la testa. Fissare gli arti anteriori e posteriori con nastro chirurgico e disinfettare la pelle con tre scrub alternati di iodio allo 0,75% e etanolo al 70%.
5. Eseguire un'incisione, laparosternotomia mediana, dall'ombelico all'angolo sternale (3-4 cm), seguita da una toracotomia bilaterale lungo ciascun margine costale (2 cm bilateralmente). Piegare la parete toracica anteriore sopra il collo per una completa esposizione del mediastino.
6. Asportare il timo ed esporre la vena cava inferiore intratoracica.
7. Transetto attraverso la larghezza dell'aorta addominale per il dissanguamento.
8. Per la perfusione retrograda, iniettare 1,5 mL di soluzione salina a 4 °C nella vena cava inferiore intratoracica con l'ago orientato superiormente verso l'innesto, come descritto in precedenza¹³.
9. Ligare la vena cava superiore usando un 8-0 sutura di seta e dividere distalmente.
10. Ripetere la perfusione retrograda iniettando altri 1,5 mL di soluzione salina a 4 °C attraverso la vena cava inferiore.
11. Ligare la vena cava inferiore usando un 8-0 sutura di seta e dividere distalmente.
12. Sezionare l'arco aortico e il tronco dell'arteria polmonare per la raccolta dell'innesto e il transetto entrambi distale. Ligare le vene polmonari sulla superficie posteriore del cuore usando una sutura di seta 6-0 e dividere distalmente.
13. Eseguire la preparazione dell'innesto rimuovendo il cuore del donatore dalla cavità toracica. Mettere il cuore asportato in un contenitore di plastica riempito con soluzione salina eparinizzata a 4 °C per 1-2 minuti. Trasferire l'innesto su un pallone di plastica sterile pieno di ghiaccio per il posizionamento del bracciale (Figura 1A).
    NOTA: L'innesto di cuore deve rimanere sul pallone per circa 5 minuti per posizionare la cuffia dell'arteria polmonare del donatore.
14. Posizionare un angiocatetere da 20 G lungo 1 mm (vedere la tabella dei materiali) sopra l'arteria polmonare per il bracciale del donatore. Usando una pinza sottile, piegare delicatamente i bordi dell'arteria sopra il bracciale. Fissare il recipiente piegato al bracciale usando una fascetta di nylon 10-0, come descritto in precedenza¹⁸ (Figura 1B,C).
15. Conservare il cuore del donatore in soluzione salina eparinizzata o in un'altra soluzione di conservazione a 4 °C.
    NOTA: Mentre alcuni potrebbero preferire soluzioni di conservazione specifiche (ad esempio, la soluzione dell'Università del Wisconsin) per la conservazione ischemica prolungata, può essere costoso¹⁹. La soluzione salina può essere un'alternativa adatta per brevi periodi di ischemia (<1 h)²⁰. In definitiva, la scelta della soluzione di conservazione dipende dal disegno sperimentale²¹.

2. Procedura del destinatario

1. Iniettare ketamina (80−100 mg/kg) e xilazina (8−10 mg/kg) per via intraperitoneale nel topo ricevente per l'anestesia. Iniettare buprenorfina a rilascio prolungato (0,5-1,0 mg/kg) per via sottocutanea per l'analgesia. Confermare il piano chirurgico dell'anestesia con pizzico di punta e coda.
2. Preparare l'area chirurgica radendo i capelli dalla zona cervicale usando un rasoio elettrico. Applicare un unguento oftalmico sterile e non medicato sugli occhi per prevenire l'essiccazione corneale.
3. Metti l'animale in posizione supina con gli arti anteriori adiacenti al corpo e la testa girata leggermente a sinistra. Fissare gli arti anteriori e posteriori con nastro chirurgico. Disinfettare la pelle con tre scrub alternati di 0,75% di iodio e 70% di etanolo.
4. Fai un'incisione cervicale della linea mediana dalla mandibola inferiore allo sterno.
5. Transetto il muscolo sternocleidomastoideo destro. Asportare il lobo destro della ghiandola sottomandibolare per creare spazio per l'impianto dell'innesto.
6. Legare un nodo sulla vena giugulare esterna prossimale usando una sutura di seta 6-0. Ligare la vena giugulare esterna distale e i rami adiacenti usando un 8-0 sutura di seta. Fai un'incisione trasversale attraverso la parete anteriore della vena giugulare esterna.
7. Posizionare una sutura di nylon 10-0 attraverso il bordo della vena giugulare esterna prossimale e il tessuto sottostante per fissare la vena durante l'inserimento del bracciale (Figura 1D).
8. Ligare l'arteria carotide comune destra distale usando un 8-0 sutura di seta appena inferiore alla biforcazione carotidea. Legare un nodo sull'arteria carotide comune prossimale usando una sutura di seta 6-0. Transetto l'arteria distalmente tra le suture.
9. Simile alla cuffia del donatore, posizionare un bracciale angiocateter lungo 0,6 mm e 24 G sull'arteria carotide comune destra del ricevente. Usando una pinza sottile, piegare delicatamente i bordi dell'arteria sopra il bracciale. Fissare la nave piegata al bracciale usando una cravatta di nylon 10-0.
10. Posizionare il cuore del donatore superiore alla zona cervicale destra.
11. Gocciolare soluzione salina fredda sull'innesto di cuore ogni pochi minuti durante l'impianto.
12. Posizionare una sutura di nylon 10-0 attraverso il bordo dell'aorta donatrice e attraverso un morso superficiale del tessuto sottostante per fissare l'innesto in posizione (Figura 1E).
13. Lavare l'aorta del donatore con 0,5 ml di soluzione salina eparinizzata allo 0,9%.
14. Inserire la cuffia dell'arteria carotide comune del ricevente nell'aorta del donatore. Assicurati l'anastomosi con un 8-0 cravatta di seta (Figura 1F). Rimuovere la sutura dell'ancora aortica.
15. De-aria la vena giugulare esterna lavando la vena giugulare esterna del ricevente con 0,5 ml di soluzione salina eparinizzata allo 0,9%.
16. Eseguire l'anastomosi dell'arteria polmonare inserendo la cuffia dell'arteria polmonare del donatore nella vena giugulare esterna del ricevente e fissare con un 8-0 cravatta di seta (Figura 1G). Rimuovere la sutura di ancoraggio della vena giugulare esterna e transettare la parete posteriore rimanente della vena giugulare esterna per liberare l'innesto dal tessuto sottostante. Assicurarsi che l'innesto sia orientato correttamente senza attorcigliamento o torsione delle anastomosi.
17. Rilasciare i nodi sulla vena giugulare esterna del ricevente seguita dall'arteria carotide comune per avviare la riperfusione dell'innesto cardiaco (Figura 1H).
18. Chiudere l'incisione della pelle cervicale utilizzando una sutura di nylon 6-0 interrotta.

3. Cure postoperatorie

1. Posizionare il ricevente in una camera di recupero calda immediatamente dopo l'intervento chirurgico e monitorare attentamente fino a completo recupero dall'anestesia (circa 1 ora).
2. Continuare a monitorare attentamente l'animale (ogni 6-8 ore) per almeno 72 ore dopo l'intervento chirurgico per segni di comportamento anormale, come letargia, tremori, respirazione rapida o anoressia.
3. Per il controllo del dolore, iniettare carprofen (5 mg/kg) per via sottocutanea ogni 8-12 h per l'analgesia, oltre alla buprenorfina sottocutanea (0,05 mg/kg) ogni 8-12 ore per 24-48 h a partire dalla fine dell'intervento.

4. Imaging intravitale a due fotoni del traffico leucocitario nell'innesto cardiaco

1. Iniettare ketamina (80-100 mg/kg) e xilazina (8-10 mg/kg) per via intraperitoneale in un topo ricevente B6 LysM-GFP¹⁷ 2 ore dopo la riperfusione dell'innesto per anestesia.
2. Eseguire l'intubazione orotracheale utilizzando un angiocatetere da 20 G, come descritto in precedenza¹⁸.
3. Collegare l'angiocatetere al tubo da un ventilatore meccanico per mouse e ventilare con aria ambiente ad una velocità di 120 respiri / min e un volume corrente di 0,5 mL¹⁸.
4. Iniettare 12 μL di punti quantici non mirati a 655 nm (vedere Tabella dei materiali), sospesi in 50 μL di PBS per via endovenosa, come descritto in precedenza¹³.
5. Riaprire l'incisione del collo per esporre l'innesto di cuore. Posizionare il mouse in una camera di stabilizzazione.
6. Fissare una porzione della parete libera del ventricolo sinistro utilizzando un sottile anello di adesivo tissutale (vedi Tabella dei materiali), applicato su un vetrino di vetro attaccato alla piastra della camera superiore.
7. Posizionare la camera sotto l'obiettivo del microscopio a due fotoni per acquisire immagini e video, come descritto in precedenza¹³.

Risultati

Questo modello di trapianto cardiaco eterotopico cervicale di topo è stato utilizzato per eseguire oltre 1.000 trapianti nel nostro laboratorio, con un tasso di sopravvivenza di circa il 97%. Il tasso di successo è leggermente superiore rispetto ai precedenti rapporti che utilizzano altre tecniche di trapianto di cuore eterotopico cervicale nei topi^10,11,20. Ciò potrebbe potenzialmente essere attribuito al bracciale più gran...

Discussione

Utilizzando questa tecnica, il trapianto cardiaco cervicale eterotopico di topo può essere eseguito in meno di 40 minuti da un microchirurgo esperto e in circa 60 minuti da un microchirurgo entry-level. Mentre il trapianto di cuore cervicale è stato studiato in numerosi modelli animali, un modello murino rimane il gold standard a causa di molteplici ceppi genetici ben definiti, capacità di alterazione genetica e disponibilità di numerosi reagenti, inclusi gli anticorpi monoclonali²⁴. La tecnic...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 braided silk ties	Henry Schein Inc	7718729
0.75% Providone iosine scrub	Priority Care Inc	NDC 57319-327-0
10-0 nylon suture	Surgical Specialties Corporation	AK-0106
655-nm nontargeted Q-dots	Invitrogen	Q21021MP
70% Ethanol	Pharmco Products Inc	111000140
8-0 braided silk ties	Henry Schein Inc	1005597
Adson forceps	Fine Science Tools Inc	91127-12
BALB/c and C57BL/6 mice (6-8 weeks)	Jackson Laboratories
Bipolar coagulator	Valleylab Inc	SurgII-20, E6008/E6008B
Carprofen (Rimadyl) injection	Transpharm	35844
Carprofen (Rimadyl) oral chewable tablet	Transpharm	38995/37919
Custom-built 2P microscope running ImageWarp acquisition software	A&B Software
Dumont no. 5 forceps	Fine Science Tools Inc	11251-20
Fine vannas style spring scissors	Fine Science Tools Inc	15000-03
GraphPad Prism 5.0	Sun Microsystems Inc.
Halsey needle holder	Fine Science Tools Inc	91201-13
Halsted-Mosquito clamp curved tip	Fine Science Tools Inc	91309-12
Harvard Apparatus mouse ventilator model 687	Harvard Apparatus	MA1 55-0001
Heparin solution (100 U/mL)	Abraxis Pharmaceutical Products	504031
Imaris	Bitplane
Ketamine (50 mg/kg)	Wyeth	206205-01
Microscope—Leica Wild M651 × 6–40 magnification	Leica Microsystems
Moria extra fine spring scissors	Fine Science Tools Inc	15396-00
Ohio isoflurane vaporizer	Parkland Scientific	V3000i
Qdots	ThermoFisher	1604036
S&T SuperGrip Forceps angled tip	Fine Science Tools Inc	00649-11
S&T SuperGrip Forceps straight tip	Fine Science Tools Inc	00632-11
Sterile normal saline (0.9% (wt/vol) sodium chloride	Hospira Inc	NDC 0409-4888-20
Sterile Q-tips (tapered mini cotton tipped 3-inch applicators)	Puritan Medical Company LLC	823-WC
Surflow 20 gauge 1/4-inch Teflon angiocatheter	Terumo Medical Corporation	SR-OX2032CA
Surflow 24 gauge 3/4-inch Teflon angiocatheter	Terumo Medical Corporation	R-OX2419CA
ThermoCare Small Animal ICU System (recovery settings 3 L/min O2, 80 °C, 40% humidity)	Thermocare Inc
VetBond	Santa Cruz Biotechnology SC361931	NC0846393
Xylazine (10 mg/kg)	Lloyd Laboratories	139-236