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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, descriviamo un modello sperimentale di infarto miocardico, una procedura di ecocardiografia per studiare il rimodellamento e la funzione cardiaca e procedure per quantificare la fibrosi e l'ipertrofia in sezioni colorate di rosso picrosirius e colorate con rodamina, nonché la dimensione dell'infarto e l'indice di espansione in fette colorate con tricromia di Masson.

Abstract

Le malattie cardiovascolari sono la causa di morte più diffusa nei paesi occidentali, con l'infarto miocardico acuto (IM) che è la forma più diffusa. Questo articolo descrive un protocollo per lo studio del ruolo della galectina 3 (Gal-3) nell'evoluzione temporale della guarigione e del rimodellamento cardiaco in un modello animale sperimentale di infarto miocardico.

Le procedure descritte includono un modello sperimentale di infarto miocardico con una legatura coronarica permanente in topi maschi C57BL/6J (controllo) e Gal-3 knockout (KO), una procedura di ecocardiografia per studiare il rimodellamento cardiaco e la funzione sistolica in vivo, una valutazione istologica della fibrosi miocardica interstiziale con sezioni colorate con lectina colorata con rosso picrosirius e colorate con lectina coniugata con rodamina per lo studio dell'ipertrofia miocitaria mediante l'area della sezione trasversale (MCSA), e la quantificazione delle dimensioni dell'infarto e del rimodellamento cardiaco (assottigliamento della cicatrice, spessore del setto e indice di espansione) mediante planimetria in fette colorate con tricromo di Masson e cloruro di trifenil tetrazolio. Gal-3 I topi KO con infarto miocardico hanno mostrato un rimodellamento cardiaco interrotto e un aumento del rapporto di assottigliamento della cicatrice e dell'indice di espansione. All'esordio dell'infarto miocardico, anche la funzione miocardica e il rimodellamento cardiaco sono stati gravemente colpiti. A 4 settimane dall'infarto miocardico, è stata influenzata anche l'evoluzione naturale della fibrosi nei topi infartuati Gal-3 KO.

In sintesi, il modello sperimentale di MI è un modello adatto per studiare l'evoluzione temporale della riparazione e del rimodellamento cardiaco nei topi con la delezione genetica di Gal-3 e di altri modelli animali. La mancanza di Gal-3 influisce sulla dinamica della riparazione cardiaca e interrompe l'evoluzione del rimodellamento cardiaco e della funzione dopo l'infarto miocardico.

Introduzione

L'infarto del miocardio (IM) è la forma più diffusa di malattia cardiovascolare. Dopo l'infarto miocardico, il miocardio subisce una serie di cambiamenti morfologici e funzionali, tra cui la guarigione della zona dell'infarto del miocardio, il rimodellamento ventricolare (VR) e la disfunzione miocardica1. La guarigione dell'infarto miocardico è un processo dinamico e ben orchestrato associato a una profonda infiltrazione infiammatoria che termina con la formazione di una cicatrice fibrotica 2,3. Il modello sperimentale di infarto miocardico nei topi è attualmente utilizzato per lo studio del rimodellamento cardiaco in condizioni patologiche 4,5 e la consapevolezza del preciso protocollo chirurgico è essenziale per sviluppare una procedura riproducibile ed efficace per indurre una legatura coronarica permanente. Questo metodo è necessario per studiare la guarigione dell'infarto miocardico e la sua rilevanza nell'evoluzione temporale del rimodellamento ventricolare sinistro (LVR) e della disfunzione cardiaca associata all'infarto miocardico.

Le galectine sono un gruppo di lectine che riconoscono carboidrati specifici nei ligandi intracellulari, nei recettori di membrana e nelle glicoproteine extracellulari. La galectina 3 (Gal-3) è un membro di questa famiglia che agisce attraverso il riconoscimento e la reticolazione di N- e O-glicani nei glicoconiugati sulla superficie cellulare ed è ampiamente espressa nel sistema immunitario6. Studi precedenti hanno indagato il ruolo di Gal-3 come regolatore dell'infiammazione e della fibrosi nelle malattie cardiovascolari 7,8,9,10,11,12. Poiché il targeting dei fattori regolatori dell'infiammazione durante la guarigione è molto rilevante perché l'infiammazione può influenzare notevolmente l'evoluzione del rimodellamento, abbiamo mirato a descrivere un protocollo per studiare l'evoluzione temporale del rimodellamento ventricolare post-infarto miocardico e le fasi e i metodi per determinare come la mutazione genetica di Gal-3 modifichi l'evoluzione temporale della guarigione nell'infarto miocardico e influenzi il rimodellamento cardiaco e la funzione nei topi.

Protocollo

NOTA: Tutti gli esperimenti descritti in questo protocollo sono stati approvati dal Comitato per la Cura e la Ricerca degli Animali dell'Università di Buenos Aires (CICUAL), in linea con il Comitato del Consiglio Nazionale delle Ricerche (USA) per l'Aggiornamento della Guida per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio13. Per gli esperimenti, utilizzare topi maschi C57BL/6J e Gal-3 KO di pari età (8-10 settimane) del peso di 30-35 g, che consentono una migliore manipolazione per la chirurgia. Consentire agli animali l'accesso all'acqua e al cibo ad libitum. I topi Gal-3 KO sono stati allevati su un background C57BL/6J presso le stesse strutture di biorisorse dei topi di controllo C57BL/6J.

1. Area chirurgica e strumenti

  1. Prima di iniziare l'intervento, verificare che il ventilatore sia collegato a una fonte di alimentazione e funzioni correttamente. Verificare che ci sia abbastanza soluzione anestetica. Preparare la soluzione il giorno dell'intervento calcolando il numero di animali da utilizzare.
  2. Conferma che tutti gli strumenti chirurgici sono sterilizzati, comprese le forbici in acciaio inossidabile, le micro forbici, i portaaghi per aghi grandi e piccoli, i divaricatori, le pinze extra affilate e curve, le pinze seghettate e le pinze per tessuti. Pulire l'area di lavoro con etanolo al 70%.
  3. Garantire la disponibilità di piccoli batuffoli di cotone, issopi e garze per la cauterizzazione immediata di qualsiasi potenziale emorragia.
  4. Conservare le suture di seta intrecciate rivestite in silicone da 10-0 a 7-0 già preparate per la legatura dell'arteria coronaria discendente sinistra (LDA), la sutura di nylon per la chiusura del torace e il filo di lino per la chiusura della pelle.

2. Anestesia e intubazione

  1. Pesare i topi per determinare la dose di anestesia.
  2. Preriscaldare un termoforo circondato da una base di polistirolo a 40 °C.
  3. Anestetizzare i topi con somministrazione intramuscolare di 0,1 ml/10 g di peso corporeo di una soluzione contenente ketamina (65 mg/kg), xilazina (13 mg/kg) e acepromazina (1,5 mg/kg).
  4. Una volta che il topo è stato anestetizzato e prima di iniziare la procedura chirurgica, controllare la profondità dell'anestetico inducendo uno stimolo leggermente doloroso, ad esempio premendo i piedi con le dita. Se l'animale risponde allo stimolo, regolare la profondità dell'anestetico.
  5. Posizionare il topo in decubito dorsale e fissare le zampe alla base di lavoro sopra il termoforo, posizionandolo sotto uno stereomicroscopio binoculare. Iperestendere il collo con un filo che tiene i denti mascellari attaccati alla base di lavoro.
  6. Quindi, per la parte di intubazione, esporre gli anelli della trachea attraverso un'incisione minima nel collo e incanalarli attraverso di esso con un catetere endovenoso da 20 G collegato a un ventilatore per roditori (volume corrente: 250 ml/corsa) a una frequenza respiratoria di 34-38 cicli/min, come descritto in precedenza14.
  7. Posizionare l'animale in decubito laterale per eseguire la toracotomia laterale sinistra al quarto o quinto spazio intercostale. Praticare un'incisione nella pelle dell'animale; Osserva i muscoli sottostanti e allargali con cura per separarli dalla parete toracica per vedere chiaramente lo spazio intercostale. A questo punto, assicurarsi che l'animale sia correttamente collegato al ventilatore; Quindi, apri lo spazio intercostale praticando un foro con la pinza extra affilata.
    NOTA: L'LDA deve essere identificabile lungo la parete ventricolare sinistra libera (LV) negli spazi intercostali sopra menzionati.
  8. Eseguire la pericardiectomia e identificare l'LDA contrastando le arterie coronarie con le vene coronariche e la ramificazione LDA sotto il padiglione auricolare sinistro. Quindi, eseguire la legatura dell'LDA utilizzando l'8-0 filo di seta ~2 mm dal bordo del padiglione auricolare. Infine, chiudi il torace a strati usando il filo di seta 6-0, chiudi le costole, assicurandoti che non ci sia pneumotorace all'interno (fallo con attenzione costringendo i polmoni ad espandersi con il ventilatore), e avvicinati ai muscoli o suturali prima di chiudere la pelle.
  9. Una volta chiusa la pelle, scollegare lentamente il topo dal ventilatore in decubito ventrale e rimuovere il tubo endotracheale quando la frequenza respiratoria si è ripresa. Lasciare che l'animale si riprenda dall'anestesia in un ambiente tranquillo e, preferibilmente, con una temperatura ambiente stabile a 27 °C.
  10. Attendi che gli animali si riprendano dall'anestesia, inizino a muovere gli arti e che la loro normale frequenza respiratoria venga ripristinata. Quindi, ospitali in gabbie individuali fino alla fine del protocollo.
  11. Eseguire la stessa procedura sugli animali di controllo o manovrati in modo fittizio, ma senza la legatura dell'LDA.

3. Disegno dello studio

  1. Per testare l'evoluzione temporale della guarigione e del rimodellamento ventricolare dopo l'infarto miocardico, randomizzare i topi nei seguenti gruppi:
    1. Per studiare la fase iniziale del rimodellamento ventricolare dopo 1 settimana di evoluzione dell'infarto miocardico, assegnare i topi ai seguenti gruppi: 1) C57 Sham (1 settimana); 2) Gal-3 KO Sham (1 settimana); 3) C57 MI (1 settimana); 4) Gal-3 KO MI (1 settimana).
    2. Per studiare la fase tardiva del rimodellamento ventricolare a 4 settimane di infarto miocardico, assegnare i topi ai seguenti gruppi: 5) C57 Sham (4 settimane); 6) Gal-3 KO Sham (4 settimane); 7) C57 MI (4 settimane); 8) Gal-3 KO MI (4 settimane).

4. Ecocardiografia

NOTA: Per gli ecocardiogrammi di topo, è necessario utilizzare trasduttori lineari superiori a 10 MHz per una corretta visualizzazione dei diametri delle pareti e delle dimensioni delle cavità. Questa procedura può essere eseguita in anestesia con avvertina intraperitoneale (IP) a 1,15 mL/kg o in animali coscienti. Tuttavia, quest'ultimo può portare a risultati confondenti nei topi con infarto miocardico a causa dello stress e dell'ansia causati dalla manipolazione.

  1. Per anestetizzare un topo, prendilo in braccio, tienilo con la schiena verso il palmo e giralo per raggiungere la superficie dell'addome. In quella posizione, iniettare l'anestesia IP con un angolo di 45° tra l'animale e l'ago sottocutaneo.
  2. Una volta che il topo è anestetizzato, radergli il torace e posizionare il mouse su un termoforo preriscaldato in posizione di decubito dorsale. Per ottenere viste parasternali dell'asse lungo e dell'asse corto, spostare il trasduttore di 90°. Una volta ottenuta la corretta vista dell'asse, posizionare il cursore a livello del muscolo papillare, premere il tasto 2-D M-mode per acquisire le immagini e utilizzare il software di analisi delle immagini per misurare i seguenti parametri:
    1. Misurare le dimensioni del ventricolo sinistro, compreso lo spessore della parete (LVWT), le aree del ventricolo sinistro sia in sistole (S) che in diastole (D) e l'area diastolica del ventricolo sinistro (LVDA) e l'area sistolica del ventricolo sinistro (LVSA) in almeno tre battiti.
    2. Inoltre, calcolare la funzione ventricolare in base alla frazione di eiezione (EF, %), alla frazione di accorciamento (SF, %) e alla massa cardiaca (supponendo un cubo non corretto) utilizzando l'equazione (1), l'equazione (2) e l'equazione (3), come descritto in precedenza15.
      SF (%) = ([LVEDD - LVESD]/LVEDD) × 100 (1)
      EF (%) = ([LVDA - LVSA]/LVDA) × 100 (2)
      Massa LV = 1,055 × ([IVST + LVEDD + PWT]3− [LVEDD]3) (3)
      Dove LVEDD è il diametro telediastolico del ventricolo sinistro, LVESD è il diametro telesistolico del ventricolo sinistro, IVST è lo spessore intraventricolare e PWT è lo spessore della parete posteriore.

5. Valutazione istologica

  1. Durante l'autopsia, estrarre il cuore dall'animale aprendo il torace da un lato all'altro e tagliando tutte le strutture che lo circondano. Pulisci il coagulo di sangue che si trova all'interno delle cavità applicando una leggera pressione con carta velina.
  2. Raccogli e pesa il cuore su una bilancia di precisione da laboratorio. Immergerlo in formaldeide al 10% per almeno 72 h a temperatura ambiente. Tagliate manualmente il cuore dall'apice alla base a fette trasversali spesse 1 mm utilizzando una lama, e lavorate le fette incorporandole nella paraffina. Eseguire tagli seriali alle sezioni incluse in paraffina di 5 μm di spessore con un microtomo.
  3. Posizionare ogni sezione tra i vetrini e colorarle con ematossilina ed eosina (H&E), sezioni tricromine di Masson, colorate con lectina coniugata con rodamina o rosso Picrosirius15,16.
    1. Utilizzando un fotomicroscopio appropriato, è possibile acquisire immagini digitalizzate a 400x per la morfometria, la fibrosi e la quantificazione MCSA. Verificare che il microscopio sia collegato a una fotocamera digitale e a un computer con software di analisi delle immagini. Per ogni analisi morfometrica, assicurarsi che le immagini si trovino nelle stesse aree, con un minimo di 10 campi ad alta potenza a 400x per sezione (setto, zona infartuata e zona remota) e senza sovrapposizioni ai campi.
      1. Per misurare l'MCSA, essere consapevoli delle posizioni dei miociti cardiaci e contare solo quei miociti che sono tagliati trasversalmente e circondati da almeno tre capillari vicini.
      2. Nelle fette colorate di rosso di Picrosirius, identificare le aree della cicatrice e del setto e visualizzare il collagene interstiziale in entrambe le zone. Carica le immagini sul software di analisi e apri la scheda della soglia per evidenziare tutte le aree di collagene positive e negative Per ottenere i dati, premere la scheda di misurazione e salvare i risultati. Per il calcolo della percentuale di collagene per regione, utilizzare l'equazione (4) e sommare le zone positive al collagene e dividerle per il tessuto totale, comprese le aree positive al collagene, come descritto altrove15,16.
        Collagene (%) = Area rossa di Picrosirio/Area totale del tessuto (4)
      3. Quantificare l'MCSA dalle immagini digitalizzate ottenute dalle sezioni colorate con lectina coniugata con rodamina dei campioni inclusi in paraffina. Per ottenere l'immagine corretta, utilizzare un software di analisi delle immagini per tracciare i contorni rossi dei miociti che circondano le membrane cellulari. Selezionare la scheda dell'area , tracciare i contorni e premere la funzione della scheda di misurazione . Infine, salva i risultati dalle aree delle celle16.

6. Determinazione quantitativa delle dimensioni e planimetria dell'infarto per valutare il rimodellamento cardiaco

  1. Misurare le dimensioni dell'infarto miocardico, lo spessore della parete e la lunghezza delle circonferenze endocardiche ed epicardiche utilizzando la planimetria dalle immagini istologiche delle sezioni tricromate di Masson ottenute con un microscopio ottico (4x) e il software appropriato.
    1. Per la quantificazione delle dimensioni dell'infarto, identificare la zona dell'infarto (blu) e la zona remota (rosso). Tracciare e misurare la lunghezza totale della zona dell'infarto e della zona remota ai lati endocardico ed epicardico. Calcolare la media dei tracciati endocardici ed epicardici come percentuale della circonferenza ventricolare sinistra totale17.
    2. Allo stesso modo, misurare lo spessore della cicatrice (la media di cinque misurazioni equidistanti) e lo spessore del setto (la media di tre misurazioni equidistanti) in una sezione centrale del cuore e utilizzare queste misurazioni per determinare il rapporto di spessore della cicatrice (equazione [5]) e l'indice di espansione (equazione [6]18).
      NOTA: Tutti i valori possono essere registrati in un foglio di calcolo.
      Rapporto spessore cicatrice = Spessore cicatrice/Spessore setto (5)
      Indice di dilatazione = (area della cavità ventricolare sinistra/area totale del ventricolo sinistro) × (spessore del setto/spessore della cicatrice) (6)
      NOTA: Poiché il rimodellamento può modificare l'espansione, con conseguente sottostima o sovrastima delle dimensioni dell'infarto, potrebbe essere necessario un po' di tempo per eseguire un esperimento pilota per misurare la dimensione dell'infarto a 24 ore, seguito dall'eutanasia. In questo caso, anestetizzare l'animale con la stessa soluzione anestetica IP utilizzata per la procedura MI.
  2. Porre l'animale in decubito dorsale e intubarlo come descritto in precedenza. Una volta che l'animale è anestetizzato, praticare una profonda incisione diagonale che raggiunga la pelle, i muscoli e le ossa costali dall'apofisi xifoidea alla cavità ascellare.
  3. Isolare l'arco aortico, praticare un piccolo foro nell'aorta ascendente e introdurre un catetere per perfondere il cuore con il blu di Evan. Quindi, rimuovi manualmente il cuore macchiato dall'animale e taglialo dall'apice alla base con una lama affilata. Mettere le fette di cuore in 1% di trifenil tetrazolio cloruro (TTC) in tampone fosfato isotonico (pH 7,4) e incubare a 37 °C per 30 minuti 4 per confermare che gli animali sono comparabili in termini di dimensioni dell'infarto.

Risultati

Sopravvivenza post-infarto miocardico e necroscopia
Nel corso di 4 settimane di follow-up, il 17% (4/23) dei topi C57 contro il 40% (8/20) dei topi Gal-3 KO sono stati trovati morti. È stata eseguita l'autopsia; i topi Gal-3 KO morti mostravano cuori più grandi rispetto ai topi C57 (Figura 1) e il 38% dei topi C57 rispetto al 32% dei topi Gal-3 KO presentava coaguli toracici macroscopici direttamente associati...

Discussione

Il modello sperimentale di infarto miocardico mediante legatura permanente dell'arteria coronarica viene utilizzato per studiare un'ampia varietà di meccanismi fisiopatologici di riparazione e rimodellamento cardiaco 5,14,17. Questo articolo riassume diversi metodi attualmente utilizzati in questo laboratorio per studiare l'evoluzione temporale della riparazione cardiaca e i suoi effetti sul ri...

Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Riconoscimenti

Gli autori apprezzano con gratitudine l'assistenza tecnica di Ana Chiaro. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'Agenzia argentina per la promozione della scienza e della tecnologia (PICT 2014-2320, 2019-02987 e PICT 2018-03267 a VM) e dell'Università di Buenos Aires (UBACyT 2018- 382 20020170100619BA a GEG).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
8-0 silk suture Ethicon
C57BL/6J miceDepartment of Bioresources of the Faculty of Veterinary of the University of Buenos Aires, Argentina
Forceps
Hardvard 386 respiratorHardvard company
Heating padmaintain animal's temperature during surgery
Image Pro-Plus 6.0Media CyberneticsImage Analysis Software
Ketamine Holiday
Masson TrichromeBIOPUR
Picrosirius redBIOPUR
Retractors
 Rodent Ventilator Model 683 Harvard ApparatusMechanical ventilator
Scissors 
Stereoscopic magnifying glassArcano
Vivid 7 machine (General Electric Medical Systems, Horten, Norway)General ElectricAny tracking software can be utilized with this protocol
WGA no. RL-1022, Vector Laboratories, BurlingameVector Laboratories
XylazinePro-Ser

Riferimenti

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