Dissezione della funzione autonoma delle cellule della proteina del ritardo mentale dell'X fragile in un circuito uditivo mediante elettroporazione in ovo

Riepilogo

Utilizzando l'elettroporazione in ovo , abbiamo ideato un metodo per trasfettare selettivamente l'orecchio interno uditivo e il nucleo cocleare negli embrioni di pollo per ottenere un knockdown specifico del gruppo cellulare della proteina di ritardo mentale X fragile durante periodi discreti di assemblaggio del circuito.

Abstract

La proteina del ritardo mentale dell'X fragile (FMRP) è una proteina legante l'mRNA che regola la traduzione proteica locale. La perdita o la disfunzione della FMRP porta ad attività neuronali e sinaptiche aberranti nella sindrome dell'X fragile (FXS), che è caratterizzata da disabilità intellettiva, anomalie sensoriali e problemi di comunicazione sociale. Studi sulla funzione FMRP e sulla patogenesi FXS sono stati condotti principalmente con knockout Fmr1 (il gene che codifica per FMRP) in animali transgenici. Qui riportiamo un metodo in vivo per determinare la funzione autonoma cellulare di FMRP durante il periodo di assemblaggio del circuito e formazione sinaptica utilizzando embrioni di pollo. Questo metodo impiega l'elettroporazione specifica per stadio, sito e direzione di un sistema vettoriale inducibile da farmaci contenente Fmr1 small hairpin RNA (shRNA) e un reporter EGFP. Con questo metodo, abbiamo ottenuto il knockdown selettivo FMRP nel ganglio uditivo (AG) e in uno dei suoi bersagli del tronco cerebrale, il nucleo magnocellularis (NM), fornendo così una manipolazione specifica del componente all'interno del circuito AG-NM. Inoltre, il modello a mosaico della trasfezione consente controlli all'interno degli animali e confronti neurone/fibra vicini per una maggiore affidabilità e sensibilità nell'analisi dei dati. Il sistema vettoriale inducibile fornisce il controllo temporale dell'insorgenza dell'editing genico per ridurre al minimo gli effetti accumulati sullo sviluppo. La combinazione di queste strategie fornisce uno strumento innovativo per analizzare la funzione autonoma cellulare di FMRP nello sviluppo sinaptico e circuitale.

Introduzione

La sindrome dell'X fragile (FXS) è un disturbo dello sviluppo neurologico caratterizzato da disabilità intellettiva, anomalie sensoriali e comportamenti autistici. Nella maggior parte dei casi, la FXS è causata da una perdita globale della proteina di ritardo mentale dell'X fragile (FMRP; codificata dal gene Fmr1) a partire dalle prime fasi embrionali¹. FMRP è una proteina legante l'RNA che è normalmente espressa nella maggior parte dei neuroni e delle cellule gliali nel cervello, così come negli organi sensoriali ^2,3,4. Nel cervello dei mammiferi, FMRP è probabilmente associato a centinaia di mRNA che codificano proteine importanti per varie attività neurali⁵. Studi su animali knockout convenzionali Fmr1 hanno dimostrato che l'espressione di FMRP è particolarmente importante per l'assemblaggio e la plasticità della neurotrasmissione sinaptica⁶. Diversi modelli di knockout condizionale e a mosaico hanno ulteriormente dimostrato che le azioni e i segnali FMRP variano tra regioni del cervello, tipi di cellule e siti sinaptici durante diversi eventi di sviluppo tra cui proiezione assonale, pattern dendritico e plasticità sinaptica 7,8,9,10,11,12,13,14 . La funzione acuta di FMRP nella regolazione della trasmissione sinaptica è stata studiata mediante somministrazione intracellulare di anticorpi inibitori FMRP o FMRP stesso in fette di cervello o neuroni in coltura^15,16,17,18. Questi metodi, tuttavia, non offrono la possibilità di tracciare le conseguenze indotte da espressioni errate di FMRP durante lo sviluppo. Pertanto, lo sviluppo di metodi in vivo per studiare le funzioni autonome cellulari di FMRP è in grande bisogno e dovrebbe aiutare a determinare se le anomalie riportate nei pazienti con FXS sono conseguenze dirette della perdita di FMRP nei neuroni e nei circuiti associati o conseguenze secondarie derivate da cambiamenti a livello di rete durante lo sviluppo¹⁹.

Il tronco cerebrale uditivo degli embrioni di pollo offre un modello straordinariamente vantaggioso per analisi funzionali approfondite della regolazione FMRP nello sviluppo di circuiti e sinapsi. Il facile accesso ai cervelli embrionali di pollo e la ben consolidata tecnica di elettroporazione ovo per la manipolazione genetica hanno contribuito notevolmente alla nostra comprensione dello sviluppo del cervello nelle prime fasi embrionali. In uno studio pubblicato di recente, questa tecnica è stata combinata con strumenti molecolari avanzati che consentono il controllo temporale della misespressione di FMRP^20,21. Qui, la metodologia è avanzata per indurre manipolazioni selettive dei neuroni presinaptici e postsinaptici separatamente. Questo metodo è stato sviluppato nel circuito uditivo del tronco cerebrale. Il segnale acustico viene rilevato dalle cellule ciliate nell'orecchio interno uditivo e quindi trasmesso al ganglio uditivo (AG; chiamato anche ganglio a spirale nei mammiferi). I neuroni bipolari nell'AG innervano le cellule ciliate con i loro processi periferici e a loro volta inviano una proiezione centrale (il nervo uditivo) al tronco cerebrale dove terminano in due nuclei cocleari primari, il nucleo magnocellularis (NM) e il nucleo angolare (NA). I neuroni nella NM sono strutturalmente e funzionalmente paragonabili alle cellule cespugliose sferiche del nucleo cocleare anteroventrale dei mammiferi. All'interno della NM, sinapsi delle fibre nervose uditive (ANF) sulla somata dei neuroni NM attraverso il grande bulbo terminale dei terminali Held²². Durante lo sviluppo, i neuroni NM derivano dai rombomeri 5 e 6 (r5/6) nel cervello posteriore²³, mentre i neuroni AG derivano dai neuroblasti che risiedono nell'otocisti²⁴. Qui, descriviamo la procedura per abbattere selettivamente l'espressione di FMRP nei neuroni AG presinaptici e nei neuroni NM postsinaptici separatamente.

Protocollo

Le uova e gli embrioni di pollo sono stati trattati con cura e rispetto in conformità con i protocolli animali approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Jinan.

1. Preparazione di uova e plasmidi

1. Preparazione delle uova
   1. Procurarsi uova di gallina fresche fecondate (Gallus gallus) dalla South China Agricultural University e conservare a 16 °C prima dell'incubazione. Per una vitalità ottimale, impostare tutte le uova per l'incubazione entro una settimana dall'arrivo.
   2. Mettere le uova orizzontalmente e incubare a 38 °C per 46-48 ore fino allo stadio 12²⁵ di Hamburger e Hamilton (HH) per la trasfezione del tubo neurale, o per 54-56 ore fino a HH13 per la trasfezione di otoste. Poiché il polo animale dell'uovo è più leggero del polo vegetale, il posizionamento orizzontale posiziona l'embrione sulla parte superiore dell'uovo per una facile manipolazione. Prestare attenzione per mantenere l'uovo orizzontale in questo e in tutti i passaggi successivi.
   3. La posizione dell'embrione appare come un'area scura sul guscio d'uovo quando si proietta luce dal fondo dell'uovo usando una torcia. Nelle fasi HH desiderate, utilizzare questo metodo torcia per contrassegnare la posizione dell'embrione sul guscio d'uovo con la matita.
   4. Pulire le uova con una garza contenente etanolo al 75%. Praticare un foro nell'estremità appuntita delle uova usando la punta delle forbici e rimuovere 2 ml di albumina con una siringa ad ago da 18 G. Assicurarsi che il foro sia abbastanza grande da consentire l'inserimento dell'ago. Pulire via l'albumina che perde con una garza e sigillare il foro con nastro trasparente.
   5. Per ridurre al minimo le crepe e per evitare la caduta di detriti del guscio durante la finestratura, coprire la parte superiore delle uova con nastro trasparente, centrando l'area scura segnata dalla matita.
2. Estrazione del DNA plasmidico
   1. Clonare il pollo Fmr1 shRNA utilizzando un sistema Tet-on basato su trasposone come descritto in precedenza²⁰. Questo sistema contiene tre plasmidi: pCAGGS-T2TP, pT2K-CAGGS-rtTA-M2 e pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNA, fornendo un sistema vettoriale inducibile da farmaci attraverso il quale l'espressione di Fmr1 shRNA e EGFP viene silenziata dopo la trasfezione e può essere attivata dall'induzione della doxiciclina (Dox).
      NOTA: questi plasmidi non sono attualmente disponibili in un repository. Gli autori si impegnano a fornire i plasmidi su ragionevole richiesta.
   2. Estrarre il DNA plasmidico utilizzando un kit di preparazione privo di endotossine secondo le istruzioni del produttore e precipitare aggiungendo 1/15 di volume di acetato di sodio 7,5 M e 1 volume di isopropanolo al 100%.
   3. Precipitare i plasmidi a -20 °C durante la notte e centrifugare a 13.000 x g per 10 minuti. Sciogliere il pellet con il tampone Tris-EDTA fornito nel kit fino a una concentrazione finale di 4-5 μg/μL. I plasmidi possono essere conservati a -20 °C per 12 mesi senza ridurre l'efficienza di trasfezione.
   4. Il giorno dell'elettroporazione, mescolare accuratamente 2 μL di ciascun plasmide in una provetta sterile da centrifuga utilizzando una punta per pipetta. Il volume risultante di 6 μL della miscela plasmidica è sufficiente per elettroporare tre dozzine di uova. Per aiutare a visualizzare il plasmide durante l'elettroporazione, aggiungere 1 μL di verde veloce allo 0,1% (preparato in_{ddH 2}O sterile) per ogni 6 μL di miscela di DNA²⁶, che trasforma la miscela plasmidica in blu.

2. Elettroporazione in ovo

1. Finestra degli ovuli e identificazione degli embrioni
   1. Il giorno dell'elettroporazione, rimuovere le uova dall'incubatrice, una dozzina di uova alla volta. Tenere le uova fuori dalla loro incubatrice per più di 1 ora introduce variazioni di sviluppo e riduce la vitalità.
   2. Pulire tutti gli strumenti chirurgici con una garza contenente etanolo al 75%.
   3. Metti ogni uovo in un portaschiuma su misura. Pulire l'area ricoperta di nastro con etanolo al 75% e tagliare una finestra (1-2 cm²) attorno alla circonferenza del segno della matita usando un piccolo paio di forbici (Figura 1A). Durante il taglio, tenere le forbici piatte per evitare di danneggiare l'embrione sottostante.
   4. Posizionare l'uovo finestrato sotto uno stereomicroscopio con un oculare 10x e uno zoom 2x e identificare l'embrione. Regolare l'angolo e la luminosità della sorgente luminosa per una migliore visualizzazione.
      NOTA: Ci vuole pratica ed esperienza per visualizzare l'embrione e identificare il tubo neurale in questa fase.
      1. Per i principianti, utilizzare la seguente iniezione di inchiostro opzionale per facilitare l'identificazione dell'embrione. Preparare in anticipo una soluzione di inchiostro indiano al 10% in soluzione salina tamponata con fosfato 0,01 M (PBS) e autoclave. Riempire una siringa da 1 mL con la soluzione di inchiostro e quindi inserire un ago da 27G. Piegare l'ago con un angolo di 45° con una pinza.
      2. Sotto il microscopio, colpire con attenzione dal bordo dell'area opaca e inserire l'ago sotto l'embrione. Iniettare ~ 50 μL di inchiostro, che si diffonderà sotto l'area pellucida per la visualizzazione dell'embrione. L'inchiostro formerà uno sfondo scuro per una chiara visualizzazione dell'embrione.
         NOTA: Espellere l'aria dalla siringa prima dell'inserimento e dell'iniezione. Quando si è esperti nella visualizzazione, evitare la fase di iniezione dell'inchiostro in quanto riduce il tasso di sopravvivenza.
2. Iniezione di tubo neurale ed elettroporazione
   NOTA: Questa procedura viene eseguita a HH12 per trasfettare i neuroni NM nel tronco cerebrale.
   1. Tirare capillari di vetro (~1 mm di diametro e 100 mm di lunghezza) in pipette utilizzando un estrattore di pipette. Sotto un microscopio da dissezione, aprire con attenzione la punta dell'ago capillare a 10-20 μm di diametro con una pinza. Conservare le pipette (di solito 5-10 alla volta) in una scatola fino all'uso.
   2. Riempire una pipetta capillare con 0,5-1 μL della miscela plasmidica applicando una pressione negativa attraverso un tubo di gomma all'estremità della pipetta. Questo può essere ottenuto con una siringa o una pompa ad aria.
   3. Posizionare l'uovo al microscopio in modo che l'embrione sia orientato verticalmente con la coda vicino a te (o orizzontalmente per iniettare pipette capillari usando un manipolatore a tre assi). Tenere la pipetta capillare con una mano o con il manipolatore a tre assi e guidare la punta della pipetta verso l'r5/6 in direzione coda-testa.
      NOTA: L'area del cervello posteriore più anteriore è r1 e ogni successivo rigonfiamento lungo il tubo neurale è un rombomero individuale. R5/6 è allo stesso livello anteroposteriore dell'otocisti, che è una struttura a coppa facilmente riconoscibile (Figura 1B-C).
   4. Colpire delicatamente la punta attraverso la membrana vitellina e nel tubo neurale dorsale e quindi ritirare leggermente la pipetta in modo che la punta sia nel lume del tubo neurale. Iniettare la miscela plasmidica applicando la pressione dell'aria fino a quando il plasmide colorato si diffonde completamente in r5/6 e si estende in r3 e r4.
      NOTA: Non è necessario creare una fessura sulla membrana vitellina per l'iniezione.
   5. Verificare la riuscita dell'iniezione, che si ottiene quando la soluzione plasmidica blu si diffonde rapidamente lungo il tubo neurale senza perdite (Figura 1B-C). Quando si verifica una perdita, il blu svanisce rapidamente.
   6. Immediatamente dopo l'iniezione, posizionare un elettrodo bipolare di platino su entrambi i lati del tubo neurale (Figura 1D). Erogare due impulsi di 12 V e 50 ms di durata con un elettroporatore. Osservare le bolle d'aria alle estremità dell'elettrodo bipolare, con più sul lato negativo.
   7. Verificare la corretta elettroporazione, che si ottiene quando la miscela plasmidica colorata entra nel tessuto del tubo neurale vicino al lato positivo dell'elettrodo. Dopo l'elettroporazione, rimuovere con attenzione l'elettrodo bipolare.
   8. Coprire la finestra sul guscio d'uovo con un pezzo di pellicola trasparente che viene pre-tagliato in 2 in quadrati e spruzzato con etanolo al 75%. Rimetti l'uovo nella sua incubatrice.
   9. Pulire l'elettrodo bipolare erogando 10-20 impulsi di 12 V e 50 ms di durata in soluzione salina prima di procedere all'uovo successivo.
3. Iniezione di otocisti ed elettroporazione
   NOTA: Questa procedura viene eseguita a HH13 per trasfettare le cellule ciliate e i neuroni AG nell'orecchio interno.
   1. A HH13 (che è ~ embrionale giorno 2.5), l'embrione si è girato in modo che il lato destro della testa sia rivolto verso l'alto. Sotto il microscopio, posiziona l'uovo in modo che l'embrione sia verticale, con la coda vicino a te. Tenere la pipetta capillare e colpire delicatamente l'otocisti destra in direzione dorsolaterale (Figura 2A).
      NOTA: In questa fase, l'otocisti appare come una piccola struttura circolare sulla parte superiore del corpo allo stesso livello anteroposteriore di r5/6.
   2. Iniettare la miscela plasmidica con pressione dell'aria fino a riempire l'otocisti con la soluzione blu²⁷. Verificare la riuscita dell'iniezione, che si ottiene quando la miscela di plasmide blu è confinata all'interno dell'otocisti e non fuoriesce.
   3. Immediatamente dopo l'iniezione, posizionare l'elettrodo bipolare sull'otocisti come illustrato nella Figura 2B. Posizionare i lati positivo e negativo anteriormente e posteriormente all'otocisti, rispettivamente. Erogare due impulsi di 12 V e 50 ms di durata con l'elettroporatore.
   4. Verificare la corretta elettroporazione, che si ottiene quando la miscela di plasmidi blu entra nel tessuto dell'otocisti vicino al lato positivo dell'elettrodo. Dopo l'elettroporazione, rimuovere con attenzione l'elettrodo bipolare. Coprire la finestra sul guscio d'uovo con un film trasparente e restituire l'uovo all'incubatrice.

3. Somministrazione di Dox per avviare e mantenere la trascrizione plasmidica

1. Preparazione della soluzione Dox
   1. Misurare 100 mg di polvere di Dox sotto una cappa chimica e scioglierla in 100 ml di PBS sterile per ottenere una soluzione di lavoro da 1 mg/ml. Filtrare la soluzione con un filtro da 0,22 μm e conservare 1 mL di aliquote a -20 °C. Proteggere dalla luce^20,28.
2. Somministrazione di Dox
   1. Per l'editing genetico a piena forza, a 24 ore prima dell'età desiderata, scongelare un'aliquota Dox sul ghiaccio. Rilasciare 50 μL di Dox direttamente sulla membrana corioallantoica dell'uovo usando una siringa che penetra nel film trasparente. Sigillare il foro dell'ago con pellicola trasparente o nastro adesivo dopo l'iniezione.
   2. Per mantenere l'effetto knockdown, somministrare Dox a giorni alterni fino alla raccolta dei tessuti nella fase di sviluppo desiderata.

4. Dissezione e sezionamento dei tessuti

1. Tronco encefalico
   1. Per gli embrioni allo stadio embrionale 3 (E3) ed E6, aprire il guscio d'uovo e tagliare la membrana associata con le forbici. Estrarre l'embrione e immergerlo in paraformaldeide (PFA) al 4% in tampone fosfato da 0,1 M.
   2. Per gli embrioni E9, aprire il guscio d'uovo, decapitare l'embrione con le forbici e trasferire la testa su una piastra con fondo di silicio riempita di PBS. Fissare la testa verso il basso attraverso le orbite e tagliare la parte superiore del cranio. Posizionare con attenzione la pinza sotto il cervello da entrambi i lati ed elevare l'intero cervello dal cranio con le spalle del forcipe. Immergere il cervello in PFA al 4%.
   3. Per gli embrioni E15 ed E19, aprire il guscio d'uovo, decapitare l'embrione con le forbici e posizionare la testa su una piastra con fondo di silicone riempita di PBS. Tagliare la pelle sulla parte superiore della testa per esporre il cranio.
   4. Incidi attraverso il cranio verticalmente con un rasoio per separare il proencefalo e il cervello caudale. Immergere il blocco caudale in PBS, rimuovere la parte superiore del cranio e quindi togliere il cervello dal cranio.
   5. Appuntare il cervello attraverso il lobo ottico e separare il cervelletto e il tronco cerebrale. Fare attenzione a non danneggiare il tronco cerebrale uditivo, che si trova proprio sotto il cervelletto. Rimuovere quanta più dura possibile dal tronco cerebrale e quindi immergerla in PFA al 4%.
   6. Mantenere gli embrioni e i tessuti cerebrali in PFA al 4% a 4 °C durante la notte, ad eccezione dei tronchi cerebrali E19, che devono essere mantenuti nelle stesse condizioni per 24 ore.
   7. Dopo la fissazione, disidratare il tessuto in PBS contenente il 30% di saccarosio fino a quando non si deposita, che di solito richiede 1-3 giorni, a seconda dell'età.
   8. Sezione il tronco encefalico (E15 ed E19) a 30 μm sul piano coronale usando un microtomo scorrevole. Raccogliere le sezioni in PBS e conservare a 4 °C prima dell'immunocolorazione.
   9. Per gli embrioni E3 ed E6 e il tronco encefalico E9, sezione a 50 μm trasversalmente. Raccogliere le sezioni in PBS e conservare a 4 °C. Montare le sezioni su vetrini da microscopio rivestiti di gelatina prima dell'immunocolorazione. La raccolta di sezioni più spesse per queste età facilita la manipolazione dei tessuti.
2. Dotto uditivo
   1. Dopo aver rimosso i tronchi cerebrali dagli embrioni E9, E15 ed E19, il dotto uditivo, che è incorporato nell'osso temporale, è facilmente identificabile giacendo sotto il cranio e l'osso temporale è facilmente separabile dal cranio circostante. Per gli embrioni E9, fissare l'intero osso temporale in PFA al 4%. Per gli embrioni più anziani, rimuovere la struttura ossea dell'osso temporale per isolare il dotto uditivo e fissare il dotto uditivo in PFA al 4%.
   2. Mantenere tutte le ossa temporali e i dotti uditivi in PFA al 4% a 4 °C durante la notte prima dell'incorporazione dei tessuti.
   3. Eseguire l'incorporamento del tessuto come descritto. Preparare la soluzione incorporante come segue: immergere il 10% di gelatina (da pelle bovina) in acqua fredda fino a quando i granuli di gelatina si gonfiano e si depositano (circa 30 minuti). Riscaldare la miscela a ~50 °C per sciogliere la gelatina e aggiungere il 20% di saccarosio nella soluzione di gelatina e mescolare per sciogliere. Conservare la soluzione di gelatina e saccarosio a 4 °C per un mese.
   4. Per l'uso, riscaldare la soluzione di gelatina e saccarosio a 37 °C. Immergere le ossa temporali/dotti uditivi nella soluzione calda di gelatina-saccarosio su una piastra a 96 pozzetti a 37 °C fino a quando non si depositano, di solito 30-60 min.
   5. Rivestire il fondo dei pozzetti di una piastra a 12 pozzetti con una striscia di pellicola trasparente. Aggiungere uno strato di soluzione calda di gelatina e saccarosio e attendere che si solidifichi. Trasferire un osso temporale / dotto uditivo a ciascun pozzetto.
   6. Impiantare il tessuto con un secondo strato di soluzione calda di gelatina-saccarosio. Regolare la posizione del tessuto in modo che sia al centro del gel e il dotto uditivo sia orientato orizzontalmente. Spostare con cautela la piastra in un frigorifero a 4 °C e attendere che il gel sia rassodato.
   7. Tirare la striscia di pellicola trasparente per spostare il blocco di tessuto gel fuori dal pozzetto. Tagliare il gel extra in un blocco quadrato e tagliare un angolo del blocco per identificare l'orientamento. Avvolgere il blocco di gelatina con un foglio di alluminio, congelare su ghiaccio secco e quindi conservare a -80 °C fino al sezionamento.
   8. Sezione il blocco a 20 μm lungo la longitudine del dotto uditivo con un criostato. Montare le sezioni direttamente su vetrini da microscopio rivestiti di gelatina. Conservare i vetrini a -80 °C prima dell'immunocolorazione.
   9. Prima dell'immunocolorazione, immergere i vetrini in PBS preriscaldato (45 °C) per 5 minuti per sciogliere la gelatina, quindi lavare i vetrini 3 volte con PBS a temperatura ambiente per rimuovere la gelatina residua.

5. Immunocolorazione e imaging al microscopio

NOTA: Vengono eseguiti due tipi di immunocolorazione a seconda che le sezioni siano montate su vetrini o fluttuanti in PBS.

1. Immunocolorazione sui vetrini
   1. Lavare i vetrini 3 volte per 10 minuti ciascuno con PBS. Circondare la regione contenente le sezioni con una penna ad olio per evitare perdite di liquido durante la colorazione. Coprire le sezioni con una soluzione bloccante contenente il 5% di siero di capra normale in PBS e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
   2. Diluire gli anticorpi primari (per la concentrazione finale utilizzata fare riferimento alla Tabella dei Materiali) in PBS contenente lo 0,3% di TritonX-100 e il 5% di siero di capra normale. Rimuovere la soluzione bloccante e quindi coprire le sezioni con la soluzione anticorpale primaria. Incubare i vetrini a 4 °C per una notte in una scatola contenente uno strato di acqua distillata sul fondo.
   3. Risciacquare i vetrini 3 volte per 10 minuti con PBS. Applicare anticorpi secondari fluorescenti diluiti a 1:500 in PBS contenenti lo 0,3% di TritonX-100 sui vetrini. Incubare i vetrini a temperatura ambiente per 4 ore, al riparo dalla luce.
   4. Lavare i vetrini 3 volte con PBS. Far cadere delicatamente due gocce di supporto di montaggio sulle guide e coprire le sezioni con dei vetrini. Fare attenzione a non generare bolle d'aria tra il coprivetrino e il vetrino.
2. Immunocolorazione per embrioni interi e sezioni fluttuanti
   1. Lavare gli embrioni/sezioni con PBS 3x per 10 minuti ciascuno in una piastra a pozzetto. Diluire gli anticorpi primari in PBS contenenti lo 0,3% di TritonX-100 e il 5% di siero di capra normale in provette centrifughe. Trasferire ogni embrione/sezione in un tubo con gancio di vetro e incubare su uno shaker a 60 giri/min per una notte a 4 °C.
   2. Lavare gli embrioni / sezioni 3 volte con PBS per 10 minuti ciascuno in una piastra del pozzetto. Trasferire ogni embrione/sezione in una provetta centrifuga scura riempita con una soluzione di anticorpi secondari fluorescenti e incubare a temperatura ambiente per 4 ore sullo shaker.
   3. Lavare gli embrioni/sezioni 3 volte con PBS in una piastra del pozzetto. Utilizzare un pennello per montare le sezioni su vetrini da microscopio rivestiti di gelatina in un piatto da 15 cm contenente PBS. Dopo che i vetrini si sono asciugati leggermente (~ 5 min), applicare due gocce di supporto di montaggio e posizionare un vetrino. Fare attenzione a non generare bolle d'aria tra il coprivetrino e il vetrino. Mantenere l'intero tessuto di montaggio in PBS per l'imaging.
3. Imaging
   1. Immagina l'intero tessuto di montaggio in PBS in un piatto con un fondo di silicio contenente polvere di carbonio, che fornisce uno sfondo nero. Acquisizione ed elaborazione di immagini utilizzando un pacchetto software Olympus di elaborazione di immagini commerciali, come descritto in precedenza²⁹.
   2. Immagini delle sezioni sui vetrini con un microscopio confocale come descritto in precedenza²⁰. Immagina le sezioni su un singolo piano focale con obiettivi 10x, 20x e 63x. Cattura tutte le immagini dallo stesso animale usando gli stessi parametri. Prestare attenzione a regolare il livello laser e le impostazioni di acquisizione delle immagini per evitare la saturazione del segnale.
   3. Eseguire l'elaborazione delle immagini utilizzando il software Fiji. Per l'illustrazione, regola la luminosità, il contrasto e la gamma dell'immagine utilizzando un software di editing delle immagini professionale.

Risultati

Eseguendo l'elettroporazione ovo in diversi siti e in diversi stadi di sviluppo, abbiamo ottenuto il knockdown selettivo FMRP sia nella periferia uditiva che nel tronco cerebrale uditivo.

FMRP knockdown in NM
L'RNA a forcina piccola (shRNA) contro il pollo Fmr1 è stato progettato e clonato nel sistema vettoriale Tet-On come descritto in precedenza²⁰. La configurazione per l'elettroporazione in ovo è mostrata nella

Discussione

Per determinare la funzione autonoma della cellula di FMRP, è necessario manipolare la sua espressione in singoli gruppi cellulari o tipi di cellule. Poiché una delle principali funzioni di FMRP è quella di regolare la formazione sinaptica e la plasticità, manipolare selettivamente ogni componente sinaptica di un determinato circuito è un prerequisito per una piena comprensione del meccanismo FMRP nella comunicazione sinaptica. Utilizzando l'elettroporazione in ovo di embrio...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Egg incubation
16 °C refrigerator	MAGAT		Used for fertilized egg storage.
Egg incubator	SHANGHAI BOXUN	GZX-9240MBE
Fertilized eggs	Farm of South China Agricultural University		Eggs must be used in one week for optimal viability.
Plasmid preparation
Centrifuge	Sigma	10016
Fast green	Solarbio	G1661	Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.
Plasmid Maxi-prep kit	QIAGEN	12162	Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit
Sodium Acetate	Sigma-Aldrich	S2889	Make 7.5M working solution in nuclase-free water.
Electroporation and Doxycycline Administration
Electroporator	BTX	ECM399
1 mL / 5 mL Syringe	GUANGZHOU KANGFULAI
Dissecting microscope	CNOPTEC	SZM-42
Doxcycline	Sigma-Aldrich	D9891	Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C.
Glass capillary	BEIBOBOMEI	RD0910	0.9-1.1 mm*100 mm
Laboratory parafilm	PARAFILM	PM996	transparent film
Pipette puller	CHENGDU INSTRUMENT FACTORY	WD-2	Pulling condition: 500 °C for 15 s
Platinum elctrodes	Home made		0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.
Rubber tube	Sigma-Aldrich	A5177
Tissue Dissection and Fixation
Forceps	RWD	F11020-11	Tip size: 0.05*0.01 mm
Other surgery tools	RWD
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week.
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	DOW	01673921	For black background plates, food-grade carbon powder is applied.
Sectioning
Cryostat	LEICA	CM1850
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391	From bovine skin.
Sliding microtome	LEICA	SM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse	Abcam	ab150113	1:500 dilution, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit	Abcam	ab150078	1:500 dilution, RRID: AB_2722519
DAPI	Abcam	ab285390	1: 1000 dilution
Fluoromount-G mounting medium	Southern Biotech	Sb-0100-01
FMRP antibody	Y. Wang, Florida State University	#8263	1:1000 dilution, RRID: AB_2861242
Islet-1 antibody	DSHB	39.3F7	1:100 dilution, RRID: AB_1157901
Netwell plate	Corning	3478
Neurofilament antibody	Sigma-Aldrich	N4142	1:1000 dilution, RRID: AB_477272
Parvalbumin antibody	Sigma-Aldrich	P3088	1:10000 dilution, RRID: AB_477329
SNAP25 antibody	Abcam	ab66066	1:1000 dilution, RRID: AB_2192052
Imaging
Adobe photoshop	ADOBE		image editing software
Confocal microscope	LEICA	SP8
Fluorescent stereomicroscope	OLYMPUS	MVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0	OlYMPUS		commercial image processing software package