Identificare le caspasi e i loro motivi che scindono le proteine durante l'infezione da virus dell'influenza A

Riepilogo

L'infezione da virus dell'influenza A (IAV) attiva le caspasi che scindono le proteine dell'ospite e virali, che, a loro volta, hanno funzioni pro e antivirali. Utilizzando inibitori, interferenza dell'RNA, mutagenesi sito-diretta e tecniche di western blotting e RT-qPCR, sono state identificate caspasi in cellule di mammifero infette che scindono la cortactina ospite e le deacetilasi istoniche.

Abstract

Le caspasi, una famiglia di proteasi della cisteina, orchestrano la morte cellulare programmata in risposta a vari stimoli, comprese le infezioni microbiche. Inizialmente descritta per verificarsi per apoptosi, la morte cellulare programmata è ora nota per comprendere tre percorsi interconnessi: piroptosi, apoptosi e necroptosi, insieme coniati come un unico processo, PANoptosis. L'infezione da virus Influenza A (IAV) induce la PANoptosi nelle cellule di mammifero inducendo l'attivazione di diverse caspasi, che, a loro volta, scindono varie proteine dell'ospite e virali, portando a processi come l'attivazione della risposta antivirale innata dell'ospite o la degradazione delle proteine antagoniste dell'ospite. A questo proposito, la scissione mediata dalla caspasi 3 della cortactina ospite, dell'istone deacetilasi 4 (HDAC4) e dell'istone deacetilasi 6 (HDAC6) è stata scoperta in cellule epiteliali sia animali che umane in risposta all'infezione da IAV. Per dimostrare ciò, sono stati impiegati inibitori, interferenze dell'RNA e mutagenesi diretta al sito e, successivamente, la scissione o resistenza alla scissione e il recupero dei polipeptidi cortactina, HDAC4 e HDAC6 sono stati misurati mediante western blotting. Questi metodi, in combinazione con RT-qPCR, formano una strategia semplice ma efficace per identificare l'ospite e le proteine virali che subiscono la scissione mediata dalla caspasi durante un'infezione di IAV o altri virus umani e animali. Il presente protocollo elabora i risultati rappresentativi di questa strategia e vengono anche discussi i modi per renderla più efficace.

Introduzione

Il virus dell'influenza A (IAV) è il membro prototipo della famiglia Orthomyxoviridae ed è noto per causare epidemie globali e pandemie imprevedibili. IAV causa malattie respiratorie umane, influenza, comunemente noto come "influenza". L'influenza è una malattia acuta che provoca l'induzione di risposte immunitarie innate pro- e anti-infiammatorie dell'ospite e la morte delle cellule epiteliali nel tratto respiratorio umano. Entrambi i processi sono governati da un fenomeno chiamato morte cellulare programmata¹. La segnalazione per la morte cellulare programmata viene indotta non appena vari recettori di riconoscimento dei patogeni rilevano le particelle virali in arrivo nelle cellule ospiti. Ciò porta alla programmazione della morte delle cellule infette e alla segnalazione alle cellule sane vicine attraverso tre percorsi interconnessi chiamati piroptosi, apoptosi e necroptosi, recentemente coniati come un unico processo, PANoptosis¹.

La PANoptosi comporta l'elaborazione proteolitica di molte proteine dell'ospite e virali dall'induzione all'esecuzione. Tale elaborazione delle proteine è principalmente guidata da una famiglia di proteasi della cisteina chiamate caspasi ^1,2. Sono note fino a 18 caspasi (dalla caspasi 1 alla caspasi 18)³. La maggior parte delle caspasi sono espresse come pro-caspasi e attivate subendo il proprio processo proteolitico mediante autocatalisi o altre caspasi⁴ in risposta a uno stimolo come un'infezione virale. Si pensava che la PANoptosi delle cellule infette da IAV fosse un meccanismo di difesa dell'ospite, ma IAV ha evoluto modi per eludere e sfruttarlo per facilitare la sua replicazione 1,2,5,6. Uno di questi è quello di antagonizzare i fattori dell'ospite attraverso la scissione o la degradazione mediata dalla caspasi che sono intrinsecamente antivirali o interferiscono con una delle fasi del ciclo di vita IAV. A tal fine, è stato scoperto che i fattori dell'ospite, cortactina, HDAC4 e HDAC6 subiscono una scissione o degradazione mediata da caspasi nelle cellule epiteliali infette da IAV ^7,8,9. HDAC4 e HDAC6 sono fattori anti-IAV 8,10 e la cortactina interferisce con la replicazione IAV in una fase successiva dell'infezione^, potenzialmente durante l'assemblaggio virale e il germogliamento ¹¹.

Inoltre, vengono attivate anche varie caspasi che, a loro volta, scindono più proteine per attivare la risposta infiammatoria dell'ospite durante l'infezione IAV ^1,2. Inoltre, la nucleoproteina (NP), la proteina M2 del canale ionico di IAV 12,13,14 e varie proteine di altri virus 3,15,16 subiscono anche una scissione mediata da caspasi durante l'infezione^, che influenza la patogenesi virale. Pertanto, vi è una continua necessità di studiare la scissione mediata dalla caspasi o la degradazione delle proteine dell'ospite e virali durante le infezioni da IAV e altri virus per comprendere le basi molecolari della patogenesi virale. Qui, i metodi sono presentati per (1) valutare la scissione o la degradazione di tali proteine da parte delle caspasi, (2) identificare tali caspasi e (3) individuare i siti di scissione.

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Protocollo

Le approvazioni normative sono state ottenute dal Comitato istituzionale per la sicurezza biologica dell'Università di Otago per lavorare con IAV e cellule di mammifero. Per il presente studio sono state utilizzate cellule A549 del rene canino Madin-Darby (MDCK) o epitelio alveolare polmonare umano e sottotipi IAV H1N1. IAV è stato coltivato in uova di gallina, come descritto altrove¹⁷. Le condizioni sterili e asettiche sono state utilizzate per lavorare con cellule di mammifero e sono state utilizzate una struttura di biosicurezza di livello 2 (o contenimento fisico 2) e un armadio di biosicurezza di classe II per lavorare con i sottotipi IAV.

1. Valutazione della scissione o della degradazione delle proteine nelle cellule infette da IAV da parte delle caspasi

1. Seminare 3 x 10⁵ cellule MDCK o A549 per pozzetto in una piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti.
   NOTA: Se si utilizzano cellule MDCK, assicurarsi che l'anticorpo contro la proteina di interesse riconosca la sua specie canina.
2. Seminare i pozzetti in coppia, cioè una coppia di controllo - un pozzetto per il campione finto non infetto e uno per il campione finto infetto - e una coppia di test - un pozzetto per il campione A inibitore non infetto e uno per il campione A inibitore infetto. Aumentare il numero di coppie con ogni inibitore aggiuntivo (vedere riferimenti ^7,8).
3. Incubare le cellule a 37 °C sotto un'atmosfera di CO₂ al 5% durante la notte.
4. Il giorno dopo, infettare le cellule con IAV (un sottotipo H1N1 o un altro sottotipo).
   1. Per questo, preparare l'inoculo del virus diluendo lo stock virale in 400 μL di mezzo essenziale minimo (MEM) privo di siero (vedi Tabella dei materiali) a una molteplicità di infezione (MOI) di 0,5-3,0 unità formanti placca (pfu)/cella ^7,11 (un fattore del raddoppio del numero di cellule nel calcolo del MOI).
      NOTA: Per infettare le cellule MDCK, integrare l'inoculo del virus con tosil fenilalanile clorometil chetone (TPCK)-tripsina ad una concentrazione finale di 1 μg/ml.
5. Rimuovere il vecchio terreno di coltura dalle cellule (fase 1.3) e lavare le cellule con 1 mL/pozzetto di MEM 2x senza siero.
6. Aggiungere 400 μL di inoculo virale (fase 1.4.1) alle cellule e incubarle per 1 ora a 35 °C in un'atmosfera di CO₂ al 5%.
7. Nel frattempo, diluire un inibitore della caspasi (ad esempio, Z-DEVD-FMK), un inibitore del lisosoma (ad esempio, NH₄Cl) o un inibitore del proteasoma (ad esempio, MG132) (vedere Tabella dei materiali) ad una concentrazione finale di 40 μM, 20 mM o 10 μM, rispettivamente, in MEM⁷ privo di siero (vedere Tabella dei materiali). Gli ultimi due inibitori fungono da controllo. Diluire un volume uguale del solvente (se diverso dall'acqua) utilizzato per ricostituire uno degli inibitori nel mezzo privo di siero come finzione.
8. Rimuovere l'inoculo del virus e lavare le cellule come al punto 1.5 (1x).
9. Aggiungere il MEM senza siero, 1 mL/pozzetto, finto o integrato con un inibitore, alle cellule e incubare le cellule come al punto 1.6. Questo punto temporale è considerato come infezione 0 h.
10. Dopo 24 ore, raccogliere le cellule raschiandole con uno stantuffo della siringa da 1 mL (lato gomma) e trasferirle in un tubo di polipropilene da 1,5 ml.
11. Centrifugare il tubo a 12.000 x g per 1-2 minuti a temperatura ambiente. Raccogliere il surnatante usando una pipetta.
    NOTA: Questo surnatante potrebbe essere scartato o utilizzato per un test di placca⁸ per misurare il titolo della progenie virale rilasciata.
12. Lavare il pellet cellulare con 250 μL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) mediante ricentrifugazione come al punto 1.11.
13. Rimuovere il surnatante e lisare le cellule aggiungendo 80-100 μL di tampone di lisi cellulare (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5% di sodio dodecilsolfato (SDS), 0,5% di sodio desossicolato, 1% Triton X-100 e 1x cocktail inibitore della proteasi, vedi Tabella dei materiali) e vortexing.
14. Riscaldare il tubo a 98 °C per 10 minuti per lisare completamente e preparare il lisato cellulare totale. Conservare i lisati a 4 °C per eseguire i passaggi 1.15-1.17 il giorno successivo, ma, per ottenere risultati ottimali, terminare questi passaggi lo stesso giorno.
15. Stimare la quantità di proteine in ciascun campione utilizzando un kit di analisi BCA (vedere la tabella dei materiali).
16. Risolvere quantità uguali di proteine da campioni non infetti e infetti mediante elettroforesi su gel standard SDS-poliacrilammide (SDS-PAGE)11 insieme a marcatori di peso molecolare ¹¹.
17. Trasferire la proteina su una membrana di nitrocellulosa o difluoruro di polivinilidene (PVDF) (vedere Tabella dei materiali).
    NOTA: la membrana PVDF può fornire uno sfondo elevato in alcuni imager western blot; Verifica la compatibilità.
18. Eseguire il western blotting per rilevare la proteina di interesse utilizzando il metodo descritto altrove¹¹.
19. Confronta i livelli di proteine nelle corsie campione infette trattate con finzione e inibitori.
    NOTA: Se il livello di proteina si è ripreso nella corsia del campione infetto trattata con inibitore della caspasi, la proteina viene scissa o degradata dalle caspasi. Altrimenti, è degradato dal lisosoma o dal proteasoma.
20. Quantificare il recupero della proteina misurando la sua intensità di banda in ciascuna corsia da almeno tre repliche dello stesso esperimento e normalizzandola con la corrispondente banda di controllo del carico.
21. Utilizzare qualsiasi imager contemporaneo e software associato (vedi Tabella dei materiali) per visualizzare le macchie occidentali e quantificare il recupero delle proteine.

2. Conferma della scissione mediata dalla caspasi o della degradazione delle proteine nelle cellule infette da IAV mediante interferenza dell'RNA

1. Progettare o ottenere un RNA a piccola interferenza (siRNA) pre-progettazione che colpisca la caspasi 3, la caspasi 6 e la caspasi 7 canina o umana (caspasi¹) e un siRNA di controllo non mirato (vedi Tabella dei materiali).
2. Consegnare ogni siRNA alle cellule MDCK o A549 mediante trasfezione inversa ^8,11.
3. Per questo, diluire in provette separate 100 nM di siRNA di controllo o siRNA caspasi o un volume raccomandato di reagente di trasfezione (vedere Tabella dei materiali) in 100 μL di mezzo appropriato (come OptiMEM, vedere Tabella dei materiali) e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
4. Preparare ogni diluizione in duplice copia.
   NOTA: Questo duplicato include una replica per analizzare il knockdown dell'espressione della caspasi mediante RT-qPCR o western blotting (se sono disponibili anticorpi contro le caspasi) e un'altra per valutare il recupero della proteina di interesse mediante western blotting.
5. Mescolare 100 μL di ciascuna soluzione di siRNA con 100 μL di soluzione di reagente di trasfezione (fase 2.3) e incubare per 20-45 minuti a temperatura ambiente per formare il complesso reagente siRNA-trasfezione.
6. Nel frattempo, dividere e aggiungere 1 x 10 5 cellule MDCK o A549 in 800 μL del terreno di coltura completo, mescolare con 200 μL di complesso reagente di trasfezione siRNA (fase^2.5 ) e aggiungere 1 mL della sospensione in un pozzetto di una piastra di coltura a 12 pozzetti. Questa diluizione porta la concentrazione finale di siRNA di controllo o siRNA caspasi a 10 nM.
7. Incubare le cellule a 37 °C sotto un'atmosfera di CO₂ al 5% per 72 ore.
8. Raccogliere le cellule da una replica come nel passaggio 1.10 ed elaborarle per convalidare o confermare il knockdown dell'espressione di caspasi 3, caspasi 6 e caspasi 7 mediante RT-qPCR o western blotting, rispettivamente, utilizzando metodi e protocolli standard ^8,11.
9. Infettare le cellule dell'altra replica con IAV come descritto nei passaggi 1.4-1.9 (senza inibitori).
10. Dopo 24 ore, raccogliere, elaborare e analizzare le cellule mediante western blotting e misurare e quantificare il recupero proteico come descritto nei passaggi 1.10-1.20.

3. Mutagenesi sito-diretta per localizzare il/i sito/i di scissione della caspasi nel polipeptide

1. Clonare la proteina codificante il gene di interesse in un plasmide di espressione¹¹ di un mammifero o ottenerla da un laboratorio di ricerca o da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: È preferibile se il gene è clonato con un tag epitopo o come fusione GFP per distinguere il polipeptide espresso ectopicamente da quello espresso endogenamente durante il western blotting.
2. Utilizzando database di substrati di caspasi⁴ o strumenti di allineamento proteico, individuare i motivi di scissione della caspasi di consenso, XXXD e DXXD, sul polipeptide. Quasi tutti i motivi di scissione delle caspasi possiedono l'acido aspartico nel sito di scissione (P1)^3,4.
3. Mutare il presunto acido aspartico P1 in acido glutammico o in un amminoacido non polare (alanina, valina) mediante mutagenesi sito-diretta seguita da sequenziamento del DNA¹¹ utilizzando metodi e protocolli standard.
4. Fornire il DNA plasmidico wild-type (WT) e mutante alle cellule MDCK o A549 mediante trasfezione inversa¹¹.
   1. Per questo, diluire 2 μg di DNA plasmidico o un volume raccomandato del reagente di trasfezione in 100 μL di un mezzo appropriato (vedere il punto 2.3 e la tabella dei materiali) in provette separate e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
   2. Mescolare 100 μL di ciascuna soluzione di DNA plasmidico con 100 μL della soluzione di reagente di trasfezione e incubare per 20-45 minuti a temperatura ambiente per formare il complesso reagente di trasfezione del DNA.
5. Nel frattempo, dividere e aggiungere 3 x 10⁵ cellule MDCK o A549 a 800 μL del terreno di coltura completo, mescolare con 200 μL di complesso reagente di trasfezione del DNA e aggiungere la sospensione da 1 mL a un pozzetto di una piastra di coltura a 12 pozzetti.
6. Incubare le cellule a 37 °C in un'atmosfera di CO₂ al 5%.
7. Dopo 48 ore, infettare le cellule con IAV come descritto nei passaggi 1.4-1.9 (senza aggiungere gli inibitori).
8. Dopo 24 ore, raccogliere, elaborare e analizzare le cellule mediante western blotting (se applicabile, utilizzando l'anticorpo di un tag epitopo o GFP). Quindi, misurare e quantificare il recupero proteico come descritto nei passaggi 1.10-1.20.

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Risultati

Trattamento con inibitore della caspasi 3
È stato scoperto che i polipeptidi di cortactina ospite, HDAC4 e HDAC6 subiscono degradazione in risposta all'infezione da IAV sia nelle cellule canine (MDCK) che umane (A549, NHBE) ^7,8,9. Utilizzando gli approcci di cui sopra, è stato scoperto che le caspasi ospiti indotte da IAV, in particolare la caspasi 3, causano la loro degradazione

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Discussione

È stabilito che i virus adattano i fattori e i percorsi dell'ospite a loro vantaggio. A loro volta, le cellule ospiti resistono a ciò impiegando varie strategie. Una di queste strategie è la PANoptosis, che le cellule ospiti usano come strategia antivirale contro le infezioni virali. Tuttavia, virus come IAV hanno evoluto le proprie strategie per contrastare la PANoptosi e sfruttarla a loro vantaggio ^1,3,6. Questa interazione...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
A549 cells	ATCC	CRM-CCL-185	Human, epithelial, lung
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	A9434
Caspase 3 Inhibitor	Sigma-Aldrich	264156-M	Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem'
cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836153001
Goat anti-NP antibody			Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	31985062
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	13778150
MDCK cells	ATCC	CCL-34	Dog, epithelial, kidney
MG132	Sigma-Aldrich	M7449
Minimum Essential Medium (MEM)	ThermoFisher Scientific	11095080	Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required
MISSION siRNA Universal Negative Control #1	Sigma-Aldrich	SIC001
Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2	LI-COR		Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software.
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225
Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion	Addgene	50728	Gift from Kenneth Yamada to Addgene
Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3	Sigma-Aldrich	NM_004346	siRNA ID: SASI_Hs01_00139105
Pre-designed small interferring RNA to caspase 6	Sigma-Aldrich	NM_001226	siRNA ID: SASI_Hs01_00019062
Pre-designed small interferring RNA to caspase 7	Sigma-Aldrich	NM_001227	siRNA ID: SASI_Hs01_00128361
Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs	Sigma-Aldrich	KSPQ12012	Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1
Protran Premium nitrocellulose membrane	Cytiva (Fomerly GE Healthcare)	10600003
Rabbit anti-actin antibody	Abcam	ab8227
Rabbit anti-cortactin antibody	Cell Signaling	3502
Rabbit anti-GFP antibody	Takara	632592
SeeBlue Pre-stained Protein Standard	ThermoFisher Scientific	LC5625
Transfection medium, Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	11668019
Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100	Merck
Trypsin, TPCK-Treated	Sigma-Aldrich	4370285