Piattaforma analitica multimodale su un chip di imaging a risonanza plasmonica di superficie multiplexed per l'analisi di sottoinsiemi di vescicole extracellulari

Riepilogo

Questo articolo propone una nuova generazione di piattaforme analitiche multiparametriche con maggiore produttività per la caratterizzazione di sottoinsiemi di vescicole extracellulari. Il metodo si basa su una combinazione di metodi di biorilevamento multiplex con analisi metrologiche e morfomeccaniche mediante microscopia a forza atomica, accoppiata con spettroscopia Raman, per qualificare bersagli vescicolari intrappolati su un biochip microarray.

Abstract

Le vescicole extracellulari (EV) sono piccole vescicole derivate dalla membrana prodotte da tutte le cellule che vanno da 50 a diverse centinaia di nanometri di diametro e sono utilizzate come mezzo di comunicazione intercellulare. Stanno emergendo come promettenti strumenti diagnostici e terapeutici per una varietà di malattie. Esistono due principali processi di biogenesi utilizzati dalle cellule per produrre EV con differenze di dimensioni, composizione e contenuto. A causa della loro elevata complessità in termini di dimensioni, composizione e origine cellulare, la loro caratterizzazione richiede una combinazione di tecniche analitiche. Questo progetto prevede lo sviluppo di una nuova generazione di piattaforme analitiche multiparametriche con maggiore produttività per la caratterizzazione di sottopopolazioni di EV. Per raggiungere questo obiettivo, il lavoro parte dalla piattaforma nanobioanalitica (NBA) stabilita dal gruppo, che consente un'indagine originale delle EV basata su una combinazione di metodi di biorilevamento multiplex con analisi metrologiche e morfomeccaniche mediante microscopia a forza atomica (AFM) di bersagli vescicolari intrappolati su un biochip microarray. L'obiettivo era quello di completare questa indagine EV con un'analisi fenotipica e molecolare mediante spettroscopia Raman. Questi sviluppi consentono la proposta di una soluzione analitica multimodale e di facile utilizzo per la discriminazione dei sottogruppi di EV nei fluidi biologici con potenziale clinico

Introduzione

Il crescente interesse per la ricerca EV nella diagnosi e nella terapia 1,2,3,4,5, combinato con le sfide che questo campo deve affrontare^, ha portato allo sviluppo e all'implementazione di una grande varietà di approcci e tecniche per quantificare o caratterizzare queste vescicole. I metodi più utilizzati per l'identificazione delle EV sono l'immunoblotting e la proteomica specifici per confermare l'origine delle EV, la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per confermare la loro struttura e l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) per quantificare il loro numero e la distribuzione delle dimensioni in un volume di campione.

Nessuna di queste tecniche da sola, tuttavia, fornisce tutte le informazioni necessarie per caratterizzare i sottoinsiemi EV. L'eterogeneità intrinseca dei veicoli elettrici dovuta alla diversità delle loro proprietà biochimiche e fisiche impedisce analisi globali affidabili e riproducibili, in particolare per i veicoli elettrici contenuti in una miscela (campione grezzo). I metodi di rilevamento e caratterizzazione sono pertanto necessari per i veicoli elettrici, sia singolarmente che in generale per integrare altri metodi più rapidi ma non selettivi⁶.

L'imaging ad alta risoluzione mediante TEM (o cryoTEM) o AFM consente la determinazione della morfologia e della metrologia dei veicoli elettrici con una risoluzione nanometrica 7,8,9,10,11,12. Tuttavia, il principale limite dell'uso della microscopia elettronica per oggetti biologici, come i veicoli elettrici, è la necessità di un vuoto per eseguire lo studio che richiede la fissazione e la disidratazione del campione. Tale preparazione rende difficile la traduzione dalle strutture osservate alla morfologia EV in soluzione. Per evitare questa disidratazione del campione, la tecnica del cryoTEM è la più adatta per la caratterizzazione EV¹³. È ampiamente utilizzato per determinare l'ultrastruttura dei veicoli elettrici. L'immunomarcatura delle vescicole mediante nanoparticelle d'oro biofunzionalizzate consente inoltre di identificare specifiche sottopopolazioni di EV e distinguerle da altre particelle presenti in un campione biologico complesso. Tuttavia, a causa del basso numero di EV analizzate al microscopio elettronico, è spesso difficile eseguire una caratterizzazione rappresentativa di un campione complesso ed eterogeneo.

Per rivelare questa eterogeneità di dimensioni, l'International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) suggerisce di analizzare un numero sufficiente di immagini a campo ampio, accompagnate da immagini più piccole, per rivelare singoli EV ad alta risoluzione¹⁴. L'AFM è un'alternativa agli approcci ottici e alle tecniche di diffrazione elettronica per lo studio dei veicoli elettrici. Questa tecnica utilizza una punta affilata tenuta da un cantilever flessibile che scansiona il campione depositato su un supporto, linea per linea, e regola la distanza tra la punta e gli elementi presenti attraverso un anello di feedback. Ciò consente di caratterizzare la topografia del campione e raccogliere informazioni morfomeccaniche^15,16,17,18. Le EV possono essere scansionate mediante AFM sia dopo essere state depositate su un substrato atomicamente piatto o dopo essere state catturate su un substrato specifico funzionalizzato da anticorpi, peptidi o aptameri per caratterizzare le varie sottopopolazioni^18,19. Grazie alla sua capacità di quantificare e sondare simultaneamente la struttura, la biomeccanica e il contenuto biomolecolare membranoso delle EV all'interno di campioni biologici complessi senza la necessità di pretrattamento, etichettatura o disidratazione, l'AFM è ora sempre più utilizzato per caratterizzare le EV in modo fine e multiparametrico in condizioni fisiologiche di temperatura e mezzo.

Questo articolo propone una metodologia che utilizza un biochip d'oro in grado di essere (bio)funzionalizzato chimicamente in un formato multiplexato. Questo substrato è la pietra angolare di una potente piattaforma analitica che combina la biorilevazione di sottoinsiemi di EV mediante risonanza plasmonica di superficie e, una volta che gli EV sono adsorbiti / innestati o immunocatturati sul chip, AFM consente la caratterizzazione metrologica e morfomeccanica degli EV. Accoppiata con la firma Raman dei sottoinsiemi EV catturati sul chip, questa piattaforma analitica consente la qualificazione dei veicoli elettrici presenti nei campioni biologici in modo label-free e senza alcuna necessità di passaggi preanalitici. Questo documento mostra che la combinazione di potenti tecniche, assistite da una metodologia altamente rigorosa nella preparazione del substrato e nell'acquisizione dei dati, rende l'analisi EV profonda, definitiva e robusta.

Il principio dell'approccio proposto è quello di preparare un substrato d'oro, di assorbire/innestare o catturare i sottotipi EV e di scansionarli mediante AFM per stimare le dimensioni e la morfologia di ciascun sottoinsieme EV. Inoltre, questi EV adsorbiti vengono analizzati mediante spettroscopia Raman. Questo substrato può, infatti, presentare tre tipi di interfacce di crescente complessità: nudi, chimicamente funzionalizzati o microarray di ligando. Prima di descrivere le diverse fasi del protocollo, i lettori sono rimandati alla presentazione schematica dell'approccio della piattaforma nanobioanalitica (NBA) nella Figura 1, combinando la risonanza plasmonica di superficie (SPRi), AFM e spettroscopia.

Figura 1: La piattaforma NanoBioAnalitica. L'approccio combina (A) risonanza plasmonica di superficie, (B) microscopia a forza atomica e spettroscopia infrarossa / Raman (nano) spettroscopia, tutti impegnati sullo stesso substrato: un chip d'oro multiplexato. Abbreviazioni: NBA = piattaforma NanoBioAnalitica; SPRi = risonanza plasmonica di superficie; AFM = microscopia a forza atomica; EV = vescicola extracellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Il biochip d'oro costituisce il cuore della piattaforma poiché tutte le tecniche di caratterizzazione label-free sono condotte su questo biochip. In base alle esigenze della caratterizzazione dei veicoli elettrici (EV globali / totali o sottoinsiemi di EV) e ai limiti / richieste dei metodi utilizzati, sono stati sviluppati tre tipi di superfici di biochip d'oro: "nude", chimicamente funzionalizzate "C11 / C16" o biofunzionalizzate con ligando, chiamate superficie d'oro "ligando".

Il biochip nudo, chiamato "naked", consente il semplice adsorbimento di veicoli elettrici sull'oro. E' possibile selezionare il tampone utilizzato e realizzare questo adsorbimento sia in modo passivo (fasi di incubazione e poi risciacquo) sia monitorarlo sotto flusso (in SPRi). Inoltre, questo adsorbimento passivo può essere realizzato sia sull'intero chip (come macroarray) che localizzato in microarray utilizzando un micropipette spotter. La "procedura under flow" consente agli investigatori di seguire la cinetica e il livello di adsorbimento EV. Questo approccio sul substrato d'oro nudo viene adottato quando l'interfaccia dello strato chimico può interferire con il metodo analitico (ad esempio, per la spettroscopia Raman).

Il biochip funzionalizzato chimicamente, chiamato "C11/C16", viene utilizzato per creare un "tappeto" denso e robusto di EV legati covalentemente sulla superficie dell'oro formando legami ammidici primari con i tiolati quando l'obiettivo è quello di avere una visione globale del campione EV. Infatti, in questo caso, l'oro è funzionalizzato da una miscela tiolata di mercapto-1-undecanolo (11-MUOH: "C11") e acido mercapto-1-esadecanoico (16-MHA: "C16"), e una frazione dei tiolati viene attivata chimicamente per stabilire un legame covalente con i bersagli. Ancora una volta, questa strategia può essere realizzata passivamente (fasi di incubazione e poi risciacquo, sia in "macroarray" che in microarray multipli utilizzando uno spotter di micropipette) o sotto portate (in SPRi) per seguire la cinetica e il livello di innesto EV sulla superficie dell'oro.

Il biochip biofunzionalizzato del ligando, chiamato "ligandi", è attivato chimicamente per innestare covalentemente diversi ligandi (ad esempio, anticorpi, recettori) per catturare selettivamente (con affinità) diversi sottoinsiemi di EV che coesistono nel campione biologico.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

1. Preparazione del substrato d'oro

NOTA: Tre tipi di superfici sono prodotte su trucioli d'oro: 1) superficie nuda, 2) funzionalizzata chimicamente e 3) biofunzionalizzata (ligandi innestati sullo strato C11C16). Saranno chiamati rispettivamente "nudi", "C11C16" e "ligandi", da questo punto in poi.

1. Preparazione del substrato d'oro:
   NOTA: Per questo protocollo, i biochip d'oro sono stati fabbricati internamente nella camera bianca. I biochip fatti in casa erano composti da vetrini (SF11) con un rivestimento di cromo (2 nm Cr) e oro (48 nm Au). La lunghezza del biochip era di 28 mm, la larghezza era di 12,5 mm e lo spessore era di 0,5 mm²⁰.
   1. Utilizzare lo sputtering magnetron DC¹⁵ per rivestire le diapositive mediante deposizione fisica da vapore (PVD).
2. Funzionalizzazione chimica:
   1. Funzionalizzare i trucioli nudi incubandoli per una notte in una miscela 90%/10% di mole di mercapto-1-undecanolo (11-MUOH: C11) e acido mercapto-1-esadecanoico (16-MHA: C16) a 1 mM in etanolo assoluto, sotto agitazione e a temperatura ambiente.
      NOTA: Questo passaggio formerà un monostrato (SAM) stabile e autoassemblato, utile nell'innesto dei leganti.
   2. Pulire il biochip (lavare delicatamente) con etanolo assoluto e acqua ultrapura, asciugarlo sotto azoto e conservarlo in condizioni di camera bianca.
   3. Attivazione del biochip funzionalizzato chimicamente:
      NOTA: Da questo passaggio in poi, gli esperimenti devono essere eseguiti in un laboratorio di analisi.
      1. Pulire il biochip con acqua ultrapura lavandolo delicatamente, quindi asciugare il chip sotto un delicato flusso d'aria. Per attivare i gruppi carbossilici C16, incubare il biochip in una miscela di 200 mM di etile (dimetilamminopropil) carbodiimmide / N-idrossisuccinimide (EDC) e 50 mmol / L N-idrossisuccinimide (Sulfo-NHS) per almeno 30 minuti al buio a temperatura ambiente. Quindi risciacquare con acqua prima degli esperimenti di innesto.
3. Innesto dei ligandi sul biochip funzionalizzato:
   NOTA: L'immobilizzazione dei ligandi (o EV per alcuni esperimenti) sul chip può essere effettuata passivamente all'esterno dello strumento SPRi (incubazione di una goccia sul chip attivato) o dinamicamente sotto flusso nello strumento SPRi. Questo costituisce i chip modificati EV o ligando. La figura 2 presenta il biochip d'oro, lo spotter di micropipette e il biochip dopo l'individuazione con 16 goccioline di ligando da 300 nL ciascuna.
   1. Per l'innesto di ligando, utilizzare molecole come anticorpi (ad esempio, immunoglobuline-antiCD41 [specifici per EV derivati da piastrine native del sangue, chiamate N-PAV], antiCD61, antiCD62P, antiCD9 e antiOVA [anticorpo di controllo contro l'ovalbumina]) e Annexin V. Diluirli a 200 μg / ml in una soluzione acida (da pH 4,5 a 6 a seconda del pH ottimale per l'attività o la funzione del ligando).
      NOTA: Il pH ottimale per l'innesto di anticorpi è stato determinato in precedenza mediante esperimenti di preconcentrazione eseguiti su uno strumento SPR per la determinazione del pH ottimale per l'innesto di ligando (vedere Figura 3). Poiché le condizioni di innesto cambiano con i cloni di anticorpi utilizzati, si raccomanda di determinare queste condizioni prima di procedere con gli esperimenti SPRi.
   2. Per la procedura di innesto, aggiungere 300 nL di soluzione EV / ligando utilizzando lo spotter.
      NOTA: Un pezzo di carta immerso nell'acqua deve essere conservato sia nel pozzetto sinistro che in quello destro per evitare l'evaporazione delle goccioline. Questo passaggio è importante per mantenere i veicoli elettrici / leganti nelle loro condizioni ottimali di stabilità e funzionalità.
   3. Dopo l'individuazione, tenere il biochip sotto un bagno sonico (frequenza: 37 kHz, potenza: 30%) per un'incubazione di 30 minuti. Lavare il biochip dall'alto con acqua ultrapura e posizionarlo delicatamente su un prisma con lo stesso indice di rifrazione (RI) del biochip. Mentre si regola il biochip sulla parte superiore del prisma, aggiungere una goccia (~ 2,3 μL) di olio con lo stesso RI del prisma per creare uno strato uniforme e sottile tra il biochip e il prisma.
      NOTA: Questo passaggio garantisce un mezzo continuo dello stesso RI nel percorso ottico. È importante evitare di incorporare bolle nello strato di olio in questa fase, poiché ciò cambierà le proprietà ottiche nel percorso e ostacolerà ulteriori analisi.

Figura 2: Biochip e spotter manuale. Biochip d'oro (a sinistra), spotter di micropipette (al centro) e il biochip dopo l'individuazione con goccioline di ligando di 300 nL ciascuna (a destra). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Test di preconcentrazione per determinare il pH ottimale per l'innesto di ligando. Il sensorgramma presenta il livello di interazione in funzione del tempo per un ligando iniettato casualmente (a diversi valori di pH) alla stessa concentrazione su 2 minuti sulla superficie. OG è il detergente, che consente di recuperare la linea di base tra ogni iniezione. Qui, il sensorgramma indica che il pH 6 ha permesso il maggior numero di innesti di ligando, con un segnale SPRi di 1091 RU. Abbreviazioni: OG = octyl glucoside; UR = unità di risposta. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

2. Risonanza plasmonica superficiale

1. Montare il biochip sul sistema SPRi. Mantenere la portata del tampone PBS (buffer corrente) a 50 μL/min.
   NOTA: Se ci sono bolle, aumentare la portata fino a 500-1.000 μL / min e iniettare frequentemente 40 mM di glucoside ottilico (OG) per rimuoverle il prima possibile.
2. Condizionamento del biochip d'oro nello strumento SPRi: scelta degli angoli di lavoro
   1. Fare clic sul menu a tendina sul lato sinistro del software e fare clic sulla directory di lavoro per definire la cartella in cui salvare i dati sperimentali. Successivamente, fai clic su Plasmon | Acquisizione di immagini.
   2. Individuare l'immagine (come mostrato nella Figura 4A) in cui sono visibili diversi punti e fare clic per selezionare questa immagine. Per definire la regione di interesse (ROI), come rappresentato nella Figura 4, fare clic sul rilevamento automatico o sulla definizione manuale all'interno degli spot (Figura 4B) o sul chip per fare riferimento a una posizione specifica anche senza macchie (Figura 4C).
   3. Quando vengono utilizzati biochip multiplexati, scrivere il nome delle famiglie di liganti, quindi fare clic sui punti corrispondenti.
      NOTA: Una famiglia di liganti corrisponde a più punti funzionalizzati con lo stesso ligando. Di solito, il chip presenta almeno duplicati e spesso anche triplicati di ciascun ligando.
   4. Fare clic su Finish Species Definition e attendere di essere indirizzati alla finestra contenente le curve plasmoniche ottenute.
   5. Scegli un angolo di lavoro. Trascinare la linea nera con il cursore sull'angolo di lavoro ottimale e fare clic su Sposta specchia all'angolo di lavoro.
      NOTA: La curva plasmonica è costituita dal valore della riflettività (%) rispetto all'angolo e il software fornisce un'altra curva con il valore della pendenza (%) rispetto all'angolo. Per selezionare un buon angolo di lavoro, scegliete l'angolo con il valore più alto della pendenza.
      1. Nel caso di una fase passivante (a causa dell'albumina) eseguita all'interno dell'apparecchio, selezionare un angolo di lavoro per ottenere la sensibilità ottimale verso la superficie, stabilendo così un controllo di qualità della reattività superficiale.
         NOTA: Questa fase di passivazione è importante quando il chip è preparato per il biorilevamento di affinità/cattura per ridurre le interazioni non specifiche tra il campione e la superficie del biochip.
3. Fare clic su Kinetics per avviare il monitoraggio cinetico in tempo reale. Una volta che il software richiede all'utente di definire il controllo negativo, scegliere nessun controllo negativo a questo punto (in quanto ciò consentirà l'osservazione della cinetica sui punti di controllo negativi).
   1. Iniettare albumina sierica di ratto (RSA, 200 μg/ml, preparata in tampone acetato, pH 4,5) a 50 μL/min per 4 minuti per passivare la superficie intorno alle macchie e possibilmente per riempire gli spazi vuoti all'interno delle macchie del ligando.
      NOTA: L'RSA viene iniettato per coprire il biochip, che non è legato ad alcun ligando.
   2. Iniettare etanolammina (1 M) a 20 μL/min per 10 minuti per disattivare i gruppi carbossilici ancora presenti e reattivi sulla superficie.
   3. Lavare il biochip iniettando 40 mM OG a 50 μL/min per 4 minuti.
      NOTA: Dopo la fase di passivazione, l'angolo di lavoro viene regolato (come nuova determinazione della linea di base prima dell'iniezione del campione) per essere alla massima sensibilità sui punti di interesse.
4. Iniezione del campione:
   1. Ridefinisci le curve del plasmone dopo la passivazione e scegli l'angolo di lavoro in base al ligando questa volta.
   2. Nel monitoraggio cinetico, ridurre la portata a 20 μL/min e attendere che la linea di base sia stabile.
   3. Iniettare il campione ad una concentrazione a scelta (da 1 x 10 8 EV / ml a 1 x 10 10 EV / ml a seconda dell'affinità tra EV e ligandi innestati) e fare clic su iniezione manuale o iniezione automatica. In caso di iniezione manuale, dopo aver iniettato 200 μL del campione, cliccare su interrompere l'iniezione. Poiché la durata dell'iniezione è generalmente di 10 minuti, iniziare a seguire la cinetica dell'interazione e misurare la variazione di riflettività calcolando la differenza di riflettività tra l'inizio e la fine dell'iniezione osservata durante il monitoraggio cinetico (Figura 5).
      NOTA: I diversi campioni che sono stati iniettati sono descritti nella sezione dei risultati rappresentativi.
5. Dopo l'iniezione del campione, seguire uno di questi due approcci per completare l'esperimento SPRi:
   1. Nell'approccio non fisso/in liquido, estrarre il biochip dall'apparato SPRi, aggiungere una goccia di liquido su di esso e procedere per un'ulteriore caratterizzazione AFM della superficie nel liquido.
   2. Nell'approccio fisso , iniettare glutaraldeide (0,5%) diluita in acqua a 20 μL / min per 10 minuti per fissare le molecole catturate sul biochip. Iniettare acqua per risciacquare la superficie, estrarre il biochip, lavarlo molto delicatamente con acqua distillata e asciugarlo all'aria per essere ulteriormente analizzato sotto AFM.

Figura 4: Immagine CCD SPRi del biochip. (A,B) Biochip multiplexed dopo passivazione dell'albumina. (A) Un chip senza default; (B) alcuni difetti che sono apparsi sul chip: fusione di macchie (i), innesto debole (ii), o polvere o "contaminanti" (iii). I ROI, a colori nelle macchie (un colore per famiglia di ligando), sono stati scelti per evitare quei "contaminanti". Quando le macchie si sono unite, sono state notate e ignorate o denominate come "miscela di ligandi 1 e 2". (C) Chip d'oro nudo senza microarray per l'esperimento che esamina l'adsorbimento dei veicoli elettrici sull'oro. La freccia blu indica la direzione del flusso. Questo chip non presentava macchie e i ROI sono stati scelti per registrare il segnale di riflettività dalla linea 1 (L1, cerchi rossi) alla linea 4 (L4, cerchi viola) durante l'iniezione del campione. Barra della scala = 1 mm per tutte e tre le immagini. Abbreviazioni: SPRi = surface plasmon resonance imaging; CCD = dispositivo ad accoppiamento di carica; ROI = regioni di interesse; EVs = vescicole extracellulari. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Esperimenti SPRi di iniezione EV su un biochip. (A) Esperimento di cattura su un biochip multiplex che mostra i segnali di riflettività di diversi ligandi. Qui, il rapporto segnale-rumore per i diversi ligandi era molto buono (e specialmente sui punti antiCD41) poiché la risposta del controllo negativo era trascurabile. (B) Esperimento di adsorbimento di veicoli elettrici su un biochip nudo. Sensorgramma che presenta il condizionamento del chip con due lavaggi di tampone e pulizia OG (1), con l'iniezione del campione EV (2) e il segnale di riflettività dopo l'interazione EV (3). Su questo biochip, non c'era alcun controllo negativo, ma il segnale di riflettività (la sua cinetica, la sua stabilità dopo l'iniezione) era alto, il che significa che quei veicoli elettrici erano in grado di assorbire e rimanere stabili sul chip d'oro. Abbreviazioni: EV = vescicola extracellulare; OG = ottile glucoside. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

3. Microscopia a forza atomica

1. Utilizzare la modalità di contatto per scansionare il biochip in aria e la modalità di imaging quantitativo per scansionare il biochip in condizioni liquide.
2. Allineare il biochip sulla parte superiore della maschera sul vetrino (sviluppato in laboratorio) per identificare la posizione dei rispettivi micropunti sul biochip (Figura 6A).
   NOTA: La maschera contiene i segni delle macchie, che corrispondono alle posizioni delle macchie dei ligandi in base allo spotter utilizzato. Questa maschera è costituita da un vetrino su cui due cunei perpendicolari consentono il posizionamento del chip. Inoltre, il vetrino è contrassegnato da 16 punti di feltro corrispondenti alla localizzazione spot sul chip, che consente, per trasparenza, di localizzare gli spot e scansionare l'area desiderata.
3. Posizionamento della punta:
   1. Utilizzare una telecamera CCD sulla parte superiore dell'AFM per localizzare il cantilever nel punto corretto che deve essere scansionato. Per seguire questo protocollo, utilizzare cantilever triangolari di 200 μm di lunghezza, 28 μm di larghezza e una costante di molla di 0,08 N/m.
4. Allineare il laser sulla parte superiore del cantilever in una posizione che dia una risposta ottimale nel meccanismo di controllo del feedback.
5. Scansione:
   1. Una volta innestato e a contatto con la superficie del biochip, avviare l'acquisizione AFM in modalità contatto o in modalità di imaging quantitativo da tre a cinque grandi aree (tipicamente 10 × 10 μm²) a piccole aree (1 x 1 μm²).
      NOTA: nella Figura 6D è illustrata una rappresentazione delle diverse aree che possono essere scansionate. Assicurarsi che la caratterizzazione AFM sia rappresentativa dell'intero spot mm² e che venga visualizzato un numero sufficiente di veicoli elettrici a una buona risoluzione per un'analisi robusta (un minimo di 300 EV contati e analizzati per ogni condizione) ed eseguire le misurazioni metrologiche e morfologiche.
6. Trattamento delle immagini AFM:
   1. Trattare le immagini AFM con il software di elaborazione dati JPK selezionando prima il canale di altezza.
   2. Scegliere un adattamento polinomiale da sottrarre da ogni linea per ottenere linee di scansione raddrizzate.
   3. Selezionate la soglia di altezza sui grani dorati per eliminare la rugosità della superficie. Nel software di riferimento (vedere la tabella dei materiali), all'interno del modulo di estrazione dei grani, contrassegnare i grani utilizzando un valore di soglia di altezza a 8,5 nm. Una volta che i grani sono stati filtrati, appare il numero di grani .
      NOTA: Di solito, il substrato d'oro grezzo (RMS di ~ 3 nm) e la presenza degli strati chimici e liganti richiedono che la soglia sia impostata a 8,5 nm.
   4. Per estrarre diverse proprietà dei grani marcati, come altezza, volume e diametro, aprire l'immagine nel software di riferimento e selezionare Trattamento dati | Cereali | Segna per soglia.
   5. Scegli i grani del filtro nella funzione delle proprietà. Quando viene visualizzata una nuova finestra, scegliere i seguenti parametri: Valore = massimo z-max, Superficie = superficie proiettata A_0. Quindi, scegli i criteri A E B.
   6. Distribuzione di grano aperto; Nella finestra visualizzata, scegli Valore (massimo), Volume (base: zero) e Limite (lunghezza). Osservare la tabella (in formato .txt) che appare, che presenta tre colonne con i valori di altezza, volume e diametro per tutti i grani rilevati alla soglia impostata per immagine.
   7. Dall'altezza, h e diametro, D, calcolare il raggio di curvatura, Rc, di ogni EV usando l'equazione (1)⁸, e quindi calcolare il volume, V, usando l'equazione (2):
      (1)
      (2)
   8. Da V, calcola il diametro effettivo, d _eff, di ogni EV (il diametro di una sfera con lo stesso volume) usando l'equazione (3):
      (3)
   9. Grafici grafici che mostrano le dimensioni (altezza misurata, diametro misurato e diametro effettivo calcolato) dei veicoli elettrici, con ogni particella contata rappresentata da un punto.
      NOTA: Pertanto, alla fine della caratterizzazione, la piattaforma NBA consente la correlazione del segnale di biorilevazione e quindi, la fenotipizzazione, con i numeri e le dimensioni dei sottoinsiemi EV.

Figura 6: Caratterizzazione dei biochip mediante AFM. Dopo l'esperimento SPRi, il chip è stato fissato ed essiccato o mantenuto in liquido per la caratterizzazione AFM. (A) Il vetrino lavorato (con due cunei di posizionamento perpendicolari, indicati con una "w" sull'immagine) che presenta una maschera che si adatta alla localizzazione dei 16 microarray di biochip. Grazie all'esposizione alla luce e alla trasparenza, una volta installato per la caratterizzazione AFM, il vetrino consente di posizionare la punta AFM nel punto desiderato per caratterizzarla. (B) Il biochip installato sul vetrino "maschera" e sotto una goccia di tampone per scansionare in condizioni liquide. (C) Immagine SPRi dei 16 microarray. (D) Un microarray ripreso mediante microscopia ottica dopo l'immunocattura di nanoparticelle di calibrazione biofunzionalizzate di 920 nm di diametro. I quadrati bianchi indicano il campionamento delle diverse aree scansionate dall'AFM in ogni punto di interesse per rendere robusta la caratterizzazione dell'AFM. Barre della scala = (C) 1 mm, (D) 500 μm. Abbreviazioni: AFM = microscopia a forza atomica; SPRi = risonanza plasmonica di superficie. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

4. Spettroscopia Raman

NOTA: Per la spettroscopia Raman, sostituire il vetrino usato come substrato con un vetrino di CaF₂, che ha una firma Raman trascurabile.

1. Condizioni ottiche per l'acquisizione:
   1. Impostare le seguenti condizioni per il microscopio di imaging Raman: obiettivo microscopio: 50x; lunghezza d'onda laser: 532 nm; potenza laser: 10 mW; tempo di esposizione: 500 ms; numero di accumuli: 140; gamma spettrale: da 450 cm-1 a 3.200 ^cm-1.
      NOTA: L'utilizzo di troppa energia e/o di un tempo di acquisizione troppo lungo può causare danni al campione, evidenziati da spettri instabili nel tempo. Inizia con una bassa quantità di energia e aumenta questa se il segnale è troppo debole. È possibile utilizzare lunghezze d'onda laser più elevate (633 nm, 785 nm) per ridurre la fluorescenza dannosa per le misurazioni Raman. Tuttavia, l'intensità diminuisce con la quarta potenza della lunghezza d'onda e la sensibilità spettrale della fotocamera dovrebbe essere considerata.
2. Imaging Raman:
   1. In primo luogo, osservare gli spettri live con un numero ridotto di accumuli (10) per trovare l'area con il miglior rapporto segnale-rumore.
      NOTA: Un segnale forte nella regione ad alta frequenza (2.800-3.000 ^cm-1) può facilitare il rilevamento di veicoli elettrici sulla superficie con bassi tempi di esposizione, come mostrato in precedenza¹⁰.
   2. Una volta selezionato il ROI, scegli la risoluzione spaziale in base al tempo disponibile per l'acquisizione.
      NOTA: La risoluzione spaziale è limitata dal limite di diffrazione (~500 nm).
   3. Avviare l'acquisizione della mappatura Raman.
3. Pretrattamento dei dati:
   1. Utilizzando un ambiente di sviluppo integrato (IDE) Python (ad esempio, Spyder), aprire il file contenente gli spettri.
   2. Sottrarre la linea di base degli spettri per correggere l'interferenza da possibile fluorescenza. Ad esempio, utilizzare la funzione "arpls" dal pacchetto "irfpy"²³. Testare diversi valori del parametro "lam" per trovare quello che fornisce la migliore correzione di base (di solito tra 10³ e 10⁷).
   3. Normalizzare gli spettri, ad esempio, dividendo tutte le intensità di uno spettro per la sua intensità a 2.900 cm⁻¹ o sottraendo la media dello spettro e quindi dividendola per la sua deviazione standard (normalizzazione "normale standard").
      NOTA: Questo passaggio è necessario per confrontare la composizione molecolare relativa delle EV.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Determinazione delle condizioni di pH ottimali per l'innesto di ligando
I diversi ligandi utilizzati per preparare i biochip sono testati in funzione del pH e della loro disponibilità ad interagire con lo strato chimico tiolato (Figura 3). I ligandi vengono diluiti in tampone acetato a diversi valori di pH e iniettati sul biochip chimicamente funzionalizzato con uno strato di C11C16. Le soluzioni vengono iniettate in modo casuale sulla superficie e un detergente (OG a 40...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

I metodi recenti per l'identificazione delle EV che sono i più utilizzati sono l'immunoblotting protein-specific per confermare l'origine delle EV, TEM per confermare la loro struttura e NTA per quantificare il loro numero e la distribuzione delle dimensioni in un volume campione³. Tuttavia, l'elevato interesse per i veicoli elettrici nella ricerca (bio)medica e i limiti degli strumenti analitici esistenti hanno spinto la comunità scientifica a sviluppare nuovi metodi per la caratterizzazione, l...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD41a antibody	Diaclone SAS (France)	447528
CP920	Microparticles GmbH, Germany	448303
DXR3xi	Thermo Fisher Scientific	T1502
EDC	Sigma	A6272
Ethanolamine	Sigma	P5368-10PAK
Evs derived from platelet concentrates	Collaboration : Pr T. Burnouf (TMU, Taipei)	S2889
Evs from bovine milk	Collaboration : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt - France)	3450
Glutaraldehyde	Sigma	56845
Gwyddion		853.223.020
Magnetron sputtering	PLASSYS	SAB5300165
mercapto-1-hexadecanoic acid	Sigma	G5882
Mercapto-1-undecanol	Sigma	O8001
Mountains SPIP ones	Digital Surf
NanoWizard 3 Bioscience	Bruker-JPK
Octyl Glucoside (OG)	Sigma
Ovalbumine antibody	Sigma
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Sigma
Rat Albumin Serum (RSA)	Sigma
Sodium acetate buffer	Sigma
SPR-Biacore 3000	GE Healthcare/ Cytiva life sciences
SPRi Biochip	MIMENTO technology platform		The biochips were produced in-house in the clean room, Besancon
SPRi Plex II	Horiba Scientific
Sulfo-NHS	Sigma