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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il presente protocollo descrive la bioingegneria delle vescicole della membrana esterna come una piattaforma vaccinale "Plug-and-Display", compresa la produzione, la purificazione, la bioconiugazione e la caratterizzazione.

Abstract

Le nanoparticelle biomimetiche ottenute da batteri o virus hanno suscitato un notevole interesse nella ricerca e nello sviluppo di vaccini. Le vescicole della membrana esterna (OMV) sono secrete principalmente da batteri gram-negativi durante la crescita media, con un diametro di dimensioni nanometriche e un'attività autoadiuvante, che può essere ideale per la somministrazione del vaccino. Gli OMV hanno funzionato come un sistema di consegna multiforme per proteine, acidi nucleici e piccole molecole. Per sfruttare appieno le caratteristiche biologiche degli OMV, gli OMV bioingegnerizzati derivati da Escherichia coli sono stati utilizzati come carrier e il dominio legante il recettore SARS-CoV-2 (RBD) come antigene per costruire una piattaforma vaccinale "Plug-and-Display". I domini SpyCatcher (SC) e SpyTag (ST) in Streptococcus pyogenes sono stati applicati per coniugare OMV e RBD. Il gene della citolisina A (ClyA) è stato tradotto con il gene SC come proteina di fusione dopo trasfezione plasmidica, lasciando un sito reattivo sulla superficie delle OMV. Dopo aver miscelato RBD-ST in un sistema tampone convenzionale durante la notte, è stato formato un legame covalente tra OMV e RBD. Pertanto, è stato raggiunto un vaccino OMV polivalente. Sostituendo con antigeni diversi, la piattaforma vaccinale OMV può visualizzare in modo efficiente una varietà di antigeni eterogenei, prevenendo così potenzialmente rapidamente le epidemie di malattie infettive. Questo protocollo descrive un metodo preciso per costruire la piattaforma vaccinale OMV, compresa la produzione, la purificazione, la bioconiugazione e la caratterizzazione.

Introduzione

Come potenziale piattaforma vaccinale, le vescicole della membrana esterna (OMV) hanno attirato sempre più attenzione negli ultimi anni 1,2. Gli OMV, principalmente secreti naturalmente dai batteri gram-negativi3, sono particelle sferiche su scala nanometrica composte da un doppio strato lipidico, di solito delle dimensioni di 20-300 nm4. Gli OMV contengono vari componenti batterici parentali, compresi gli antigeni batterici e i pattern molecolari associati ai patogeni (PAMP), che fungono da potenziatori immunitari solidi5. Beneficiando dei loro componenti unici, della struttura naturale delle vescicole e dei grandi siti di modifica dell'ingegneria genetica, gli OMV sono stati sviluppati per l'uso in molti campi biomedici, tra cui vaccini batterici6, adiuvanti7, farmaci immunoterapici contro il cancro8, vettori di somministrazione di farmaci9 e adesivi antibatterici10.

La pandemia di SARS-CoV-2, che si è diffusa in tutto il mondo dal 2020, ha avuto un pesante tributo sulla società globale. Il dominio legante il recettore (RBD) nella proteina spike (proteina S) può legarsi con l'enzima umano di conversione dell'angiotensina 2 (ACE2), che quindi media l'ingresso del virus nella cellula11,12,13. Pertanto, RBD sembra essere un obiettivo primario per la scoperta del vaccino14,15,16. Tuttavia, la RBD monomerica è scarsamente immunogenica e il suo piccolo peso molecolare rende difficile il riconoscimento per il sistema immunitario, quindi sono spesso necessari adiuvanti17.

Al fine di aumentare l'immunogenicità dei RBD, sono stati costruiti OMV che mostrano RBD polivalenti. Gli studi esistenti che utilizzano OMV per visualizzare RBD di solito fondono RBD con OMV per essere espresso nei batteri18. Tuttavia, RBD è una proteina derivata dal virus e l'espressione procariotica può influenzare la sua attività. Per risolvere questo problema, il sistema SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC), derivato da Streptococcus pyogenes, è stato utilizzato per formare un isopeptide covalente con OMV e RBD in un sistema tampone convenzionale19. Il dominio SC è stato espresso con la citolisina A (ClyA) come proteina di fusione mediante Escherichia coli bioingegnerizzato e ST è stato espresso con RBD tramite il sistema di espressione cellulare HEK293F. OMV-SC e RBD-ST sono stati miscelati e incubati durante la notte. Dopo la purificazione mediante ultracentrifugazione o cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC), OMV-RBD è stato ottenuto.

Protocollo

1. Costruzione plasmidica

  1. Inserire la sequenza di SpyCatcher codificante DNA (file supplementare 1) in un plasmide pThioHisA-ClyA resistente all'ampicillina (vedi Tabella dei materiali) tra i siti BamH I e Sal I per costruire il plasmide pThioHisA ClyA-SC seguendo un rapporto precedentemente pubblicato20.
  2. Collegare il gene di fusione sintetizzato SpyTag-RBD-Histag (File supplementare 1) in un plasmide pcDNA3.1 (vedere Tabella dei materiali) tra i siti BamH I ed EcoR I per costruire il plasmide pcDNA3.1 RBD-ST a seguito di un rapporto precedentemente pubblicato19.

2. Preparazione OMV-SC

  1. Eseguire la trasformazione ClyA-SC seguendo i passaggi seguenti.
    1. Aggiungere 5 μL di soluzione plasmidica pThioHisA ClyA-SC (50 ng/μL) a 50 μL di ceppo competente BL21, soffiare delicatamente e lasciare raffreddare sul ghiaccio per 30 minuti.
    2. Mettere la soluzione per 90 s a bagnomaria a 42 °C, quindi mettere immediatamente la soluzione miscelata su ghiaccio per 3 minuti.
    3. Aggiungere 500 μL di terreno LB alla sospensione batterica e, dopo miscelazione, coltura a 220 giri/min a 37 °C per 1 ora.
    4. Placcare tutta la trasformazione su una piastra di agar LB contenente ampicillina (100 μg/ml, vedi tabella dei materiali) e coltura per una notte a 37 °C.
      NOTA: Negli esperimenti successivi, l'ampicillina è stata mantenuta alla stessa concentrazione nel mezzo. In caso contrario, ciò può causare la perdita di plasmidi nei batteri.
  2. Per la produzione OMV-SC, eseguire i passaggi seguenti.
    1. Isolare una singola colonia dalla piastra (fase 2.1.4.) a 20 mL di terreno LB (resistente all'ampicillina) e coltivare per una notte a 220 giri/min a 37 °C.
    2. Inoculare la soluzione batterica (dal punto 2.2.1.) in terreno da 2 L, coltura a 220 giri/min, 37 °C per 5 ore fino allo stadio di crescita logaritmica (OD600nm è compreso tra 0,6 e 0,8).
    3. Quando l'OD a 600 nm della soluzione batterica raggiunge 0,6-0,8, aggiungere isopropil beta-D-tiogalattopiranoside (IPTG, vedi tabella dei materiali) per ottenere la concentrazione finale della soluzione batterica di 0,5 mM, quindi coltura per una notte a 220 giri / min a 25 ° C.
  3. Eseguire la purificazione OMV-SC.
    1. Centrifugare la soluzione batterica a 7.000 x g a 4 °C per 30 minuti.
    2. Filtrare il surnatante con un filtro a membrana da 0,22 μm, quindi concentrarlo utilizzando una membrana di ultrafiltrazione da 100 kD o una colonna di fibra cava (vedi Tabella dei materiali).
    3. Filtrare il concentrato attraverso un filtro a membrana da 0,22 μm, quindi centrifugarlo a 150.000 x g a 4 °C per 2 ore utilizzando un'ultracentrifuga (vedere Tabella dei materiali) ed eliminare il surnatante con una pipetta.
    4. Risospendere la precipitazione con PBS e conservarla a -80 °C. La soluzione può mantenere la stabilità a lungo termine a -80 °C.

3. Preparazione RBD-ST

  1. Eseguire la trasfezione RBD-ST seguendo i passaggi seguenti.
    1. Selezionare un sistema di espressione eucariotica appropriato (ad esempio, HEK293F) e coltivare le cellule durante la notte a 130 rpm a 37 °C dopo il recupero.
    2. Aggiungere 20 μL di soluzione cellulare HEK293F nel contatore automatico delle celle (vedere Tabella dei materiali), registrare il numero di celle, regolare la concentrazione a 1 x 106 celle/ml e quindi coltivare le celle a 130 giri/min a 37 °C per 4 ore.
    3. Filtrare il plasmide RBD-ST attraverso un filtro a membrana da 0,22 μm e aggiungere 300 μg di plasmidi nel terreno di coltura cellulare (vedere Tabella dei materiali) fino a quando il volume finale è di 10 ml; agitare per 10 s.
    4. Riscaldare il PEI (1 mg/ml; vedere tabella dei materiali) a 65 °C a bagnomaria, mescolare 0,7 mL di PEI con 9,3 mL di terreno di coltura cellulare e agitare a intermittenza per 10 s.
      NOTA: Non agitare vigorosamente la soluzione. In caso contrario, le bolle risultanti possono influire sull'efficienza della trasfezione.
    5. Aggiungere la soluzione di plasmide alla soluzione PEI, agitare la miscela in modo intermittente per 10 s e incubarla a 37 °C per 15 minuti.
    6. Aggiungere la miscela a 280 ml di terreno di coltura cellulare e coltivare a 130 giri/min a 37 °C per 5 giorni.
  2. Eseguire la purificazione RBD-ST.
    1. Centrifugare le celle a 6.000 x g a 25 °C per 20 minuti e utilizzare una pipetta per raccogliere il surnatante.
    2. Riempire la colonna con 2 mL di agarosio Ni-NTA (vedi Tabella dei materiali) e lavarla 3 volte con 3x PBS.
    3. Aggiungere imidazolo (vedere Tabella dei materiali) nel surnatante cellulare per ottenere la concentrazione finale di 20 mM e caricare il surnatante cellulare 2x.
    4. Aggiungere 3 volumi di colonna (CV) di PBS contenenti 20 mM di imidazolo per il lavaggio e raccogliere la frazione di lavaggio.
    5. Eluizione a gradiente con 3 CV di PBS contenenti concentrazioni da basse ad alte (ad esempio, 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M) di imidazolo; eluire 2x per ogni concentrazione.
    6. Utilizzare SDS-PAGE21 per identificare RBD-ST in diversi gradienti di concentrazione.

4. Bioconiugazione e purificazione OMV-RBD

  1. Determinare la concentrazione proteica con il metodo BCA (vedi Tabella dei materiali).
    1. Diluire serialmente la soluzione proteica standard di BSA da 2 mg/ml a 0,0625 mg/ml, diluire OMV-SC e RBD-ST 10x purificati, quindi miscelare le soluzioni di lavoro BCA A e B (fornite nel kit di analisi) con un rapporto di 50:1 (v/v).
    2. Aggiungere una soluzione proteica diluita (25 μL/pozzetto) e mescolare con una soluzione di lavoro BCA (200 μL/pozzetto); incubare a 37 °C per 30 min.
    3. Misurare l'assorbanza (OD) a 562 nm di ciascun pozzetto e calcolare la concentrazione proteica dalla curva standard22.
  2. Eseguire la bioconiugazione di OMV-SC e RBD-ST seguendo i passaggi seguenti.
    1. Combinare OMV-SC e RBD-ST in PBS con un rapporto di 40:1 (w/w).
    2. Ruotare verticalmente per frullare la miscela durante la notte a 15 giri/min a 4 °C.
      NOTA: Antigeni diversi possono reagire in proporzioni diverse. Si potrebbero provare diversi rapporti di reazione in base alle caratteristiche dell'antigene.
  3. Verificare l'efficienza di reazione.
    1. Preparare 10 μL di OMV-SC, RBD-ST e il prodotto di reazione (punto 4.2.). Aggiungere 2,5 μL di tampone di carico 5x (vedere Tabella dei materiali) e riscaldare i campioni a 100 °C per 5 minuti. Caricare i campioni nel gel (10 μL/pozzetto). Eseguire l'elettroforesi a 60 V per 20 minuti e modificare la condizione a 120 V per 1 ora.
    2. Trasferire la proteina dal gel alle membrane tampone occidentali PVDF (vedi Tabella dei materiali) a 100 V per 70 minuti.
    3. Mettere la membrana in latte in polvere senza grassi al 5% / TBST e agitare per 1 ora. Quindi, lavare 3 volte con TBST per 5 minuti per lavaggio con agitazione.
    4. Inserire la membrana in anticorpi His-Tag/TBST allo 0,1% (vedere la tabella dei materiali) e agitare per 1 ora, quindi lavare 3 volte con TBST per 5 minuti per lavaggio agitando.
    5. Mettere la membrana in uno 0,02% di anticorpi IgG1 anti-topo (HRP)/TBST (vedere la tabella dei materiali) e agitare per 40 minuti, quindi lavare 3 volte con TBST per 5 minuti per lavaggio agitando.
    6. Aggiungere una soluzione di chemiluminescenza potenziata (vedere la tabella dei materiali) ed esporre la membrana.
  4. Eseguire la purificazione di OMV-RBD.
    1. Diluire 1 mL di soluzione di OMV-RBD reagito a 10 mL e centrifugare la diluizione a 150.000 x g a 4 °C per 2 ore.
    2. Utilizzare una pipetta per eliminare il surnatante e sospendere il residuo con 10 ml di PBS. Centrifugare la sospensione a 150.000 x g a 4 °C per 2 ore.
    3. Scartare il surnatante e sospendere il residuo con 1 mL di PBS.
      NOTA: Se la solubilità dell'antigene è molto più bassa, lo stesso effetto di separazione può essere ottenuto mediante cromatografia ad esclusione dimensionale19.

5. Caratterizzazione

  1. Eseguire la diffusione dinamica della luce (DLS).
    1. Diluire i campioni ad una concentrazione di 100 μg/mL e aggiungere 1 mL di campione nella cella del campione.
    2. Scegliere "Dimensioni" per "Tipo di misurazione", "Proteine" per "Materiale campione", "Acqua" per "Disperdente", "25 °C" per "Temperatura", quindi caricare i campioni e misurare automaticamente23.
  2. Acquisire immagini utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM).
    1. Diluire i campioni a 100 μg/ml. Prendi una griglia di rame a 200 maglie, aggiungi 20 μL di campione e lascia che venga assorbita per 10 minuti.
    2. Utilizzare carta da filtro per rimuovere la soluzione, aggiungere 20 μL di acetato di uranile al 3% al film di supporto e colorare per 30 s.
    3. Togliere l'acetato di uranile e asciugare il film naturalmente a temperatura ambiente per 1 ora.
    4. Caricare i campioni nel sistema TEM (vedere Tabella dei materiali) e acquisire immagini a 80 kV.

Risultati

Il diagramma di flusso per questo protocollo è illustrato nella Figura 1. Questo protocollo potrebbe essere un approccio generale all'utilizzo di OMV come piattaforma vaccinale; Basta scegliere i sistemi di espressione appropriati in base al tipo di antigeni.

La Figura 2 fornisce uno schema di progettazione plasmidica fattibile. Il gene SC è collegato con il gene ClyA tramite un linker flessibile, mentre ST si collega al terminale 5...

Discussione

Per creare una piattaforma di vaccino a nanoparticelle "Plug-and-Display", ClyA fuso SC è stato espresso in ceppi BL21 (DE3), che è uno dei modelli più utilizzati per la produzione di proteine ricombinanti a causa dei suoi vantaggi nell'espressione proteica24, in modo che ci sarebbe abbastanza frammento SC visualizzato sulla superficie degli OMV durante il processo di proliferazione batterica. Allo stesso tempo, è stato preparato un antigene bersaglio fuso ST per l'accoppiamento chimico tra gl...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal Key Program of Chongqing Natural Science Foundation (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) e il progetto della Chinese National Natural Science Foundation (n. 31670936, 82041045).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Ampicillin sodiumSangon BiotechA610028
Automated cell counterCountstarBioTech
BCA protein quantification Kitcwbiocw0014s
ChemiDoc Touching Imaging SystemBio-rad
Danamic Light ScatteringMalvernZetasizer Nano S90
Electrophoresis apparatusCavoyPower BV
EZ-Buffers H 10X TBST BufferSangon BiotechC520009
Goat pAb to mouse IgG1Abcamab97240
High speed freezing centrifugeBioridgeH2500R
His-Tag mouse mAbCell signaling technology2366s
ImidazoleSangon BiotechA600277
Isopropyl beta-D-thiogalactopyranosideSangon BiotechA600118
Ni-NTA His-Bind SuperflowQiagen70691
Non-fat powdered milkSangon BiotechA600669
OPM-293 cell culture mediumOpm biosciences81075-001
pcDNA3.1 RBD-ST plasmidWuhan genecreat biological techenology
Phosphate buffer salineZSGB-bioZLI-9061
Polyethylenimine LinearPolysciences23966-1
Prestained protein ladderThermo26616
pThioHisA ClyA-SC plasmidWuhan genecreat biological techenology
PVDF Western Blotting MembranesRoche03010040001
Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column)GE healthcare
SDS-PAGE loading buffer (5x)BeyotimeP0015
Sodium chlorideSangon BiotechA100241
Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution)Thermo34577
Suspension instrumentLife TechnologyHula Mixer
Transmission Electron MicroscopeHitachiHT7800
TryptoneOxoidLP0042B
UltracentrifugeBeckman coulterXPN-100
Ultraviolet spectrophotometerHitachiU-3900
Yeast extractSangon BiotechA610961

Riferimenti

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