Sintesi proteica priva di cellule da estratti cellulari carenti di esonucleasi utilizzando modelli di DNA lineare

Riepilogo

Presentato qui un protocollo per la preparazione e la calibrazione tampone di estratti cellulari da ceppi knockout di esonucleasi V di Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD e ΔrecB). Questo è un approccio rapido, facile e diretto per l'espressione in sistemi di sintesi proteica privi di cellule utilizzando modelli lineari di DNA.

Abstract

La sintesi proteica priva di cellule (CFPS) è recentemente diventata molto popolare nel campo della biologia sintetica grazie ai suoi numerosi vantaggi. L'utilizzo di modelli di DNA lineare per CFPS consentirà inoltre alla tecnologia di raggiungere il suo pieno potenziale, riducendo il tempo sperimentale eliminando le fasi di clonazione, trasformazione ed estrazione del plasmide. Il DNA lineare può essere rapidamente e facilmente amplificato mediante PCR per ottenere alte concentrazioni del modello, evitando potenziali tossicità di espressione in vivo . Tuttavia, i modelli lineari di DNA sono rapidamente degradati dalle esonucleasi che sono naturalmente presenti negli estratti cellulari. Ci sono diverse strategie che sono state proposte per affrontare questo problema, come l'aggiunta di inibitori della nucleasi o la modifica chimica delle estremità lineari del DNA per la protezione. Tutte queste strategie costano tempo e risorse extra e devono ancora ottenere livelli di espressione proteica vicini al plasmide. Un protocollo dettagliato per una strategia alternativa è presentato qui per l'utilizzo di modelli di DNA lineare per CFPS. Utilizzando estratti cellulari da cellule knockout carenti di esonucleasi, i modelli lineari di DNA rimangono intatti senza richiedere alcuna modifica finale. Presentiamo le fasi di preparazione del lisato cellulare da Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD ceppo mediante lisi sonicazione e calibrazione tampone per Mg-glutammato (Mg-glu) e K-glutammato (K-glu) specificamente per DNA lineare. Questo metodo è in grado di raggiungere livelli di espressione proteica paragonabili a quelli del DNA plasmidico in E. coli CFPS.

Introduzione

I sistemi di sintesi proteica priva di cellule (CFPS) sono sempre più utilizzati come metodo rapido, semplice ed efficiente per l'ingegneria dei biosensori, la produzione decentralizzata e la prototipazione di circuiti genetici¹. Grazie al loro grande potenziale, i sistemi CFPS sono utilizzati regolarmente nel campo della biologia sintetica. Tuttavia, finora i sistemi CFPS si basano su plasmidi circolari che possono limitare la tecnologia dal raggiungere il suo pieno potenziale. La preparazione del DNA plasmidico dipende da molti passaggi che richiedono molto tempo durante la clonazione e grandi quantità di isolamento del DNA. D'altra parte, l'amplificazione PCR da un plasmide, o un modello di DNA sintetizzato, può essere utilizzata per preparare semplicemente modelli CFPS entro poche ore ^2,3. Pertanto, l'applicazione del DNA lineare offre una soluzione promettente per la CFPS. Tuttavia, il DNA lineare viene rapidamente degradato dalle esonucleasi naturalmente presenti negli estratti cellulari⁴. Esistono soluzioni che affrontano questo problema, come l'uso della proteina GamS λ-fago⁵ o il DNA contenente siti Chi⁶ come agenti protettivi, o proteggere direttamente il DNA lineare modificando chimicamente le sue estremità 2,7,8,9. Tutti questi metodi richiedono integrazioni per l'estratto cellulare, che sono costosi e richiedono tempo. È noto da tempo che il complesso esonucleasi V (RecBCD) degrada il DNA lineare nei lisati cellulari⁴. Recentemente, abbiamo dimostrato che il DNA lineare può essere protetto molto meglio nei lisati da cellule eliminate per i geni esonucleasi (recBCD)¹⁰.

In questo protocollo, i passaggi per la preparazione di lisati privi di cellule dal ceppo E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD mediante lisi sonicazione sono descritti in dettaglio. La lisi sonicazione è una tecnica comune e conveniente impiegata da diversi laboratori^11,12. Gli estratti prodotti da questo ceppo non hanno bisogno dell'aggiunta di alcun componente aggiuntivo o modifica del modello di DNA per supportare l'espressione da modelli lineari di DNA. Il metodo si basa sulla fase essenziale dell'ottimizzazione del tampone per gli estratti cellulari specificamente per l'espressione lineare del DNA da promotori nativi di E. coli. È stato dimostrato che questa specifica ottimizzazione del tampone per l'espressione lineare del DNA è la chiave per i promotori nativi σ70 per produrre un'elevata produzione di proteine senza l'integrazione di proteina GamS o DNA Chi, evitando anche la purificazione dei prodotti PCR¹⁰. La concentrazione ottimale di Mg-glu per l'espressione lineare del DNA è risultata simile a quella del DNA plasmide. Tuttavia, la concentrazione ottimale di K-glu ha mostrato una differenza sostanziale tra DNA lineare e plasmide, probabilmente a causa di un meccanismo correlato alla trascrizione¹⁰. La funzionalità delle proteine espresse con questo metodo è stata dimostrata per diverse applicazioni, come lo screening rapido degli interruttori e la valutazione dell'attività delle varianti enzimatiche¹⁰.

Questo protocollo fornisce una soluzione semplice, efficiente ed economica per l'utilizzo di modelli di DNA lineare in sistemi privi di cellule di E. coli semplicemente utilizzando estratti cellulari ΔrecBCD mutanti e calibrazione specifica per DNA lineare come modello.

Protocollo

1. Preparazione dei supporti e del buffer

1. Preparazione del mezzo 2xYT+P (solido e liquido)
   1. Preparare fluidi liquidi e solidi come descritto nella Tabella 1, quindi sterilizzare mediante autoclave.
      NOTA: Questo protocollo richiede una piastra di agar 2xYT+P contenente cloramfenicolo (10 μg/ml). Il volume dei mezzi liquidi è proporzionale al volume del lisato richiesto. Qui viene utilizzato un volume iniziale di 5 L di fluido liquido 2xYT+P. Tuttavia, il volume può essere regolato secondo necessità, sapendo che 1 L della coltura cellulare si traduce in 2-3 ml del lisato cellulare finale.
2. Preparazione di cloramfenicolo (34 mg/ml)
   1. Pesare 0,34 g di cloramfenicolo, aggiungere etanolo a 10 ml e sciogliere mescolando. Aliquot 1 mL ciascuno in più provette e conservare a -20 °C per utilizzarlo in seguito.
3. Preparazione del buffer S30A
   1. Preparare il tampone S30A secondo la Tabella 2, puntando a 2 L di questo tampone.
      Nota : ancora una volta, il volume di questo buffer è proporzionale al volume del lisato richiesto.
   2. Prima dell'autoclave, regolare il pH del tampone a 7,7 utilizzando acido acetico glaciale.
   3. Autoclavare il buffer.
   4. Mantenere questo tampone a 4 °C dopo l'autoclave.
   5. Prima dell'uso, aggiungere DTT (filtrato da un filtro a membrana da 0,22 μm) al tampone S30A per raggiungere una concentrazione finale di 2 mM (2 mL di stock da 1 M DTT a 1 L di tampone S30A).
      Nota : ancora una volta, il volume di questo buffer è proporzionale al volume del lisato richiesto.
4. Preparazione della soluzione energetica
   NOTA: Questa soluzione energetica si basa sul documento Sun et al. ¹³ (concentrazione di stock 14x). La tabella 3 riassume i componenti necessari per la preparazione del materiale di soluzione energetica, con numeri di catalogo per tutte le sostanze chimiche utilizzate in questo protocollo.
   1. Preparare le soluzioni madre secondo la Tabella 3 e tenerle in ghiaccio.
   2. Calibrare il pH come richiesto per i componenti indicati, con tampone Tris 2 M (60,57 g di Tris base in un volume di 250 mL di acqua sterile) o KOH 15% (15 g di KOH in un volume di 100 mL di acqua sterile) come indicato nella Tabella 3.
   3. In una provetta da 15 ml, aggiungere il volume di ciascun componente nell'ordine indicato nella tabella 3.
   4. Aliquot la soluzione energetica, 150 μL per tubo.
   5. Congelare le aliquote su ghiaccio secco e conservare a -80 °C.
5. Preparazione della soluzione di aminoacidi (AA)
   NOTA: La soluzione di aminoacidi è preparata dal kit RTS Amino Acid Sampler. Ciascuno dei 20 aminoacidi è fornito in questo kit come volume di 1,5 ml a 168 mM, ad eccezione della leucina che è a 140 mM. Qui, la soluzione madre preparata è concentrata 4x, piuttosto che la soluzione di lavoro richiesta. La concentrazione finale della soluzione di amminoacidi è di 6 mM per tutti gli amminoacidi, ad eccezione della leucina che è a 5 mM.
   1. Scongelare i 20 tubi di amminoacidi mediante vortice e incubare a 37 °C fino a completa dissoluzione.
      NOTA: Cys potrebbe non dissolversi completamente.
   2. In una provetta da 50 ml, aggiungere 12 ml di acqua sterile e 1,5 ml ciascuno degli amminoacidi nell'ordine indicato nella tabella 4.
   3. Vortice fino a quando la soluzione è abbastanza limpida, incubare a 37 °C se necessario.
      NOTA: Cys potrebbe non dissolversi completamente.
   4. Aliquot 500 μL della soluzione di amminoacidi per provetta su ghiaccio.
   5. Congelare le aliquote su ghiaccio secco e conservare a -80 °C.
6. Preparazione di soluzioni per la calibrazione del buffer
   1. Preparare la soluzione madre per Mg-glu (100 mM) e K-glu (3 M) come indicato nella Tabella 5. Effettuare una diluizione seriale (in volume di 1 ml) da questi materiali di partenza per Mg-glu (da 0 a 20 mM) e K-glu (da 20 a 300 mM) come indicato nel file supplementare 1 per le fasi di taratura.
      NOTA: Queste concentrazioni di stock sono per la fase di calibrazione e potrebbe essere necessario modificare durante l'impostazione dell'esperimento finale. Le concentrazioni più elevate degli stock testati per questo protocollo sono 1 M e 4,5 M rispettivamente per Mg-glu e K-glu.
7. Preparazione del brodo di soluzione PEG8000
   1. Preparare 50 ml di soluzione di PEG8000 al 40% (20 g di PEG8000 in un volume di 50 ml di acqua sterile).

2. Coltura cellulare e preparazione del lisato (esperimento di 4 giorni)

1. Giorno 1
   1. Streak ceppo BL21 Rosetta2 ΔrecBCD (Tabella 6) da -80 °C di glicerolo su una piastra di agar 2xYT+P contenente 10 μg/mL di cloramfenicolo. In alternativa, BL21 Rosetta2 ΔrecB (Tabella 6) può essere utilizzato anche¹⁰.
   2. Incubare per una notte a 37 °C.
2. Giorno 2
   1. Inoculare una singola colonia dalla piastra di agar di cui sopra in 10 mL di 2xYT+P integrato con 10 μg/mL di cloramfenicolo.
   2. Incubare per una notte a 37 °C con agitazione a 200 giri/min.
3. Giorno 3
   1. Fare una sottocoltura diluendo la coltura notturna 100 volte in 4 L di mezzo fresco 2xYT+P contenente 10 μg/ml di cloramfenicolo.
      NOTA: Ad esempio, 40 ml di coltura notturna vengono aggiunti a 3960 ml di terreno fresco. Dopo la diluizione, il mezzo da 4 L viene diviso in 4 matraccio (volume 5 L) in modo che ogni matraccio contenga 1 L.
   2. Incubare a 37 °C, 200 giri/min per circa 3-4 ore di crescita per raggiungere un OD₆₀₀ di 1,5-2,0. Diluire la coltura di 4x se si misura OD₆₀₀ > 0,8.
      NOTA: Il tempo esatto di incubazione può variare a seconda del ceppo, dell'inoculo iniziale, degli oggetti da laboratorio e degli strumenti utilizzati. I ceppi knockout ΔrecB/ΔrecBCD hanno tassi di crescita paragonabili a quelli del parente BL21 Rosetta2 (Figura supplementare 1).
   3. Metti la cultura sul ghiaccio.
   4. Ruotare le cellule a 5.000 x g per 12 minuti a 4 °C, quindi scartare il surnatante mediante decantazione.
   5. Risospendere i pellet di cella in 800 ml di S30A+DTT refrigerato.
      NOTA: il volume di S30A+DTT è 5 volte inferiore al volume originale della coltura cellulare. Ad esempio, per un volume iniziale di 1 L della coltura cellulare, risospendere i pellet cellulari in 200 mL di S30A+DTT. Si consiglia inoltre di eseguire questo passaggio in una cella frigorifera a 4 °C, oltre a mantenere tutti i materiali sul ghiaccio.
   6. Ruotare le cellule a 5.000 x g per 12 minuti a 4 °C, quindi scartare il surnatante mediante decantazione.
   7. Ripetere i passaggi 2.3.5 e 2.3.6.
   8. Risospendere i pellet cellulari in 160 ml di S30A+DTT refrigerato.
      NOTA: questa volta il volume di S30A+DTT è 25 volte inferiore al volume originale della coltura cellulare. Ad esempio, per un volume iniziale di 1 L della coltura cellulare, risospendere i pellet cellulari in 40 ml di S30A + DTT. Anche in questo caso, si consiglia di eseguire questo passaggio in una cella frigorifera a 4 °C, nonché di mantenere i materiali sul ghiaccio.
   9. Trasferire le celle in provette refrigerate e prepesate da 50 ml.
   10. Ruotare le cellule a 2.000 x g per 8 minuti a 4 °C, quindi scartare il surnatante mediante decantazione.
   11. Ruotare le celle a 2.000 x g per 4 minuti a 4 °C, quindi rimuovere con cautela il surnatante rimanente utilizzando una pipetta.
   12. Rimisurare il peso del tubo per calcolare il peso del pellet cellulare.
   13. Mantenere il pellet cellulare a -80 °C.
4. Giorno 4
   1. Prelevare i pellet cellulari da -80 °C e scongelarli su ghiaccio per 1-2 ore.
   2. Risospendere i pellet cellulari in 0,9 ml di tampone S30A + DTT per grammo del peso del pellet. Pipettare lentamente per risospendere le cellule, evitando il più possibile la schiuma superiore, se presente.
   3. Introdurre 1 mL di aliquote delle celle risospese in microtubi da 1,5 mL e conservarli su ghiaccio o su un blocco freddo pre-refrigerato a 4 °C (è preferibile utilizzare blocchi metallici).
      NOTA: Se l'ultima aliquota è molto inferiore a 1 ml, è meglio scartarla piuttosto che sonicare un volume sub-ottimale. Il volume ottimale (1 ml) per la sonicazione è stato determinato per questa configurazione (tubo, sonicatore e sonda) e può variare per uno diverso.
   4. Sonicare ogni tubo in un sonicatore (sonda da 3 mm, frequenza 20 kHz), con una configurazione del 20% di ampiezza per tre cicli (sonicazione di 30 s, pausa di 1 minuto).
      NOTA: L'energia totale erogata nei tre cicli è stata di ~ 266 Joule (~ 80-110 Joule per ciclo). Durante questa fase, tenere i tubi sul blocco freddo che è circondato da ghiaccio. Alternare tra due blocchi freddi per evitare il surriscaldamento della sonda (anche il blocco freddo di standby viene mantenuto freddo sul ghiaccio). Entrambi i blocchi freddi sono stati pre-raffreddati in frigo il giorno prima della sonicazione.
   5. Girare il lisato a 12.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
   6. Raccogliere il surnatante (lisato cellulare) con una pipetta e trasferirlo in una provetta da 50 ml.
   7. Incubare il lisato cellulare a 37 °C a 200 giri/min agitando per 80 min.
   8. Girare il lisato a 12.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
   9. Raccogliere il surnatante e l'aliquota 30 μL ciascuno in microtubi da 1,5 mL pre-raffreddati, mantenendo tutti i tubi su ghiaccio.
   10. Congelare le aliquote di lisato su ghiaccio secco e conservare a -80 °C.

3. Calibrazione del tampone senza cellule per il DNA lineare

NOTA: Il tampone privo di cellule è stato calibrato per concentrazioni ottimali di Mg-glu e K-glu come descritto in Sun et ^al.13. Il file supplementare 1 è necessario per le fasi di calibrazione. Le reazioni sono state impostate su un volume finale di 10,5 μL ciascuno. Gli estratti sono stati calibrati utilizzando 1 nM di DNA lineare (vedere la sezione 4 sotto) o plasmide. Gli esperimenti possono essere eseguiti lo stesso giorno in cui vengono preparati i tamponi, oppure i tamponi preparati possono essere congelati a -80 °C per eseguire l'esperimento in un altro giorno. Per tutte le fasi di calibrazione, ogni componente è stato scongelato sul ghiaccio prima di miscelare e pipettare in una piastra da 384 pozzetti.

1. Preparare un Master Mix, secondo la scheda 'Preparazione buffer' nel file Excel Supplementary File 1, contenente: (a) estratto cellulare (33% del volume totale di reazione), (b) DNA reporter (come DNA lineare e/o plasmide) ad una concentrazione finale di 1 nM, (c) tampone privo di cellule (PEG8000, soluzione AA e soluzione energetica) e (d) K-glu ad una concentrazione finale di 80 mM.
2. Per un volume di reazione di 10,5 μL, prelevare 1,05 μL (reazione totale al 10%) di diverse concentrazioni di scorte concentrate di Mg-glu 10x (intervalli di concentrazione finali: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 e 20 mM) e aggiungere 9,45 μL (reazione totale al 90%) del Master Mix. Mescolare delicatamente.
   NOTA: Utilizzare tubi a otto strisce PCR per preparare le diluizioni e miscelare con una pipetta multicanale. Se necessario, può essere utilizzato un diverso intervallo di concentrazioni di Mg-glu.
3. Pipettare 10 μL delle reazioni di cui sopra in una micropiastra a fondo quadrato da 384 pozzetti, coprirla con un sigillo adesivo e misurare l'espressione genica come output di fluorescenza. Registrare i dati di fluorescenza con un lettore di piastre (Es: 485 nm; Em: 528 nm) a intervalli regolari (ad esempio, 5 min) per 8 ore di incubazione a 30 °C con scuotimento orbitale continuo a 307 cpm.
   NOTA: Se necessario, ruotare la micropiastra da 384 pozzetti (<2.500 x g, 1 min, temperatura ambiente) prima di iniziare l'acquisizione dei dati. Le misurazioni dell'end-point sono state utilizzate per confrontare l'espressione GFP nelle diverse composizioni del buffer. I valori di fluorescenza possono essere convertiti in unità standardizzate per il plotting (vedi sotto).
4. Identificare la concentrazione di Mg-glu che si traduce nel più alto valore di fluorescenza al punto finale.
   NOTA: Se non si è sicuri della concentrazione ottimale di Mg-glu ottenuta, ripetere il punto 3.2 con intervalli di concentrazione più diversi.
5. Con la concentrazione ottimizzata di Mg-glu, procedere alla calibrazione K-glu per un intervallo di concentrazioni (20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 e 240 mM), utilizzando gli stessi volumi indicati al punto 3.2. Esegui l'esperimento e identifica il più alto valore di fluorescenza tra le concentrazioni di K-glu testate. Questo indica la composizione tampone ottimale per Mg-glu e K-glu per questo lisato.
   NOTA: Se non si è sicuri della concentrazione ottimale di K-glu ottenuta, ripetere il passaggio con intervalli di concentrazione più diversi.
6. Una volta stabiliti i valori di Mg-glu e K-glu, preparare provette stock della composizione tampone ottimizzata in base al volume del lotto ottenuto. Utilizzare la scheda «Preparazione tampone» nel file supplementare 1 per calcolare il numero di tubi tampone necessari, ovvero 38 μL per provetta, e conservare a -80 °C.

4. Preparazione lineare del DNA

NOTA: Per la calibrazione del lisato, viene utilizzato il plasmide P70a-deGFP. Questo plasmide è stato mantenuto in E. coli KL740 cl857+ (Tabella 6) per miniprep utilizzando il Plasmid Miniprep Kit, o maxiprep usando il Plasmid Maxiprep Kit. I frammenti lineari di DNA utilizzati come modelli di espressione nelle reazioni libere da cellule sono stati amplificati con PCR utilizzando i primer e i modelli elencati nella Tabella 7 e nella Tabella 8.

1. La PCR si amplifica dal plasmide P70a-deGFP utilizzando DNA polimerasi con oligo primer elencati nella Tabella 7. Impostare le reazioni PCR in un volume di 50 μL, secondo il protocollo del produttore, utilizzando il programma del termociclatore: [98 °C per 2 min; 40 cicli x (98 °C per 30 s → 66 °C per 30 s → 72 °C per 60 s); 72 °C per 10 min; 4 °C per ∞].
2. Digerire il DNA modello nelle reazioni PCR aggiungendo 1 μL di enzima di restrizione DpnI per 50 μL di reazione PCR e incubare a 37 °C per 1 ora. Quindi, purificare la reazione PCR utilizzando un kit di pulizia PCR e DNA ed eluire in acqua priva di nucleasi.
3. Verificare i prodotti PCR su un gel di agarosio all'1% (1x TAE) prima dell'uso.
4. Quantificare i prodotti PCR purificati (o i preparati plasmidici) utilizzando Nanodrop (ND-1.000).
   NOTA: Se si utilizza una DNA polimerasi/tampone direttamente compatibile con la reazione cellulare a valle, la fase di purificazione (fase 2) può essere saltata completamente e la concentrazione di DNA non purificato misurata mediante un saggio fluorometrico con colorante legante il DNA (vedi Batista et ^al.10).

5. Esecuzione sperimentale

NOTA: oltre a utilizzare il file supplementare 1 per calibrare lo stock tampone per ciascun lotto di lisato preparato (sopra), si consiglia di utilizzare la scheda "Preparazione della reazione" nel file per impostare le successive reazioni prive di cellule. Come in precedenza, il volume delle reazioni è fissato a 10,5 μL per reazione, di cui solo 10 μL vengono infine pipettati nella piastra a 384 pozzetti per l'acquisizione dei dati. Qui, 5 nM di ogni modello vengono utilizzati per l'espressione senza celle. È importante essere coerenti quando si pipettano le reazioni: utilizzare la stessa pipetta e il tipo di puntali. Erogare con attenzione per evitare bolle nel pozzo o liquidi che si attaccano alle pareti del pozzo. Se necessario, girare verso il basso il piatto (<2.500 x g, 1 min, temperatura ambiente).

1. Calcolare i volumi da pipettere inserendo le descrizioni e le repliche necessarie per campione nella scheda "Preparazione della reazione" del file supplementare 1.
   NOTA: se è richiesto un volume di reazione diverso da 10,5 μL, questo può essere inserito anche nel file supplementare 1. Il file calcolerà il numero di provette di scorte tampone precedentemente ottimizzate e le provette di estrazione cellulare da scongelare sul ghiaccio.
2. Etichettare un microtubo da 1,5 mL per la preparazione della miscela master ottimale (separatamente per DNA lineare e plasmide), aggiungere i volumi corretti del tampone e del lisato e mescolare delicatamente.
   NOTA: A causa delle differenze nelle concentrazioni ottimali di K-glu nei loro tamponi, è necessario utilizzare separatamente copie della scheda "Preparazione della reazione" per il DNA lineare e plasmide.
3. Pipettare prima i campioni di DNA, poi con acqua priva di nucleasi e infine con l'Optimal Master Mix (MM) dal punto 5.2. Mescolare delicatamente la reazione priva di cellule con la pipetta appena prima di aggiungerla al lettore di piastre ed evitare eventuali bolle.
   NOTA: Utilizzare un tubo a otto strisce PCR per miscelare il volume di reazione per una replica aggiuntiva. Ad esempio, se si prevedono triplicati tecnici, preparare una miscela per quattro reazioni e lasciare un volume morto nella provetta per ridurre gli errori di pipettaggio durante l'aggiunta dei campioni alla piastra.
4. Impostare le reazioni nel lettore di piastre (Ex 485 nm; Em 528 nm). Le corse cinetiche hanno registrato dati di fluorescenza a intervalli regolari (ad esempio, 5 minuti) per 8 ore di incubazione a 30 °C, con scuotimento orbitale continuo a 307 cpm.
   NOTA: le misurazioni dell'end-point sono state riportate come punto temporale di 8 ore. I valori di fluorescenza raccolti sono in unità arbitrarie (u.a.), ma possono essere convertiti in unità standardizzate per il plotting (vedi sotto).

6. Quantificazione relativa di FITC e GFP

NOTA: l'espressione di GFP viene esportata dal lettore di piastre in unità di fluorescenza arbitrarie (u.a.). Tuttavia, si consiglia di utilizzare unità di misura standardizzate per confrontare i valori di fluorescenza tra diverse impostazioni (lotti, apparecchiature, utenti e laboratori). Di seguito sono presentati i passaggi dettagliati per convertire i valori di fluorescenza (u.a.) in valori equivalenti a FITC ed eGFP (μM), utilizzando curve standard di NIST-FITC e eGFP ricombinante. Conservare la soluzione madre NIST-FITC a 4 °C e conservare l'eGFP ricombinante a -20 °C. Assicurarsi che la soluzione madre e le diluizioni seriali siano protette dalla luce. Al momento della consegna, si raccomanda di aliquote l'eGFP ricombinante in volumi più piccoli per evitare cicli multipli di congelamento-scongelamento.

1. Preparare una soluzione di 100 mM di borato di sodio, pH 9,5, e conservare a temperatura ambiente o a 4 °C.
2. Preparare 12 diluizioni (70 μL ciascuna) per la curva standard, 2x per passo (50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,562, 0,781, 0,390, 0,195, 0,097, 0,048 e 0 μM) dello standard FITC tracciabile NIST dal materiale madre da 50 μM utilizzando la soluzione di borato di sodio. Preparare la serie di diluizione in triplice copia.
3. Analogamente al punto 6.2, preparare diluizioni seriali (70 μL ciascuna) dall'eGFP ricombinante utilizzando la soluzione di borato di sodio (1,2, 0,3, 0,075, 0,0188, 0,0047, 0,0012, 0,0003, 0,00007 e 0 μM). Per il calcolo della molarità, considerare l'intera dimensione della proteina (28 kDa) e la concentrazione dell'eGFP purificato (1 g/L). Preparare la serie di diluizione in triplice copia.
4. Aggiungere 20 μL di ogni diluizione (nove pozzetti ciascuno = tre serie di diluizioni x tre repliche tecniche) in una micropiastra a fondo quadrato da 384 pozzetti, coperta da un sigillo adesivo, e incubare in un lettore di piastre per la misurazione.
   NOTA: Qui, le impostazioni utilizzate erano Eccitazione: 485/20, Emissione: 528/20, con guadagno 50. Tuttavia, ulteriori combinazioni di lunghezza d'onda/guadagno possono essere utilizzate anche per calibrare altre molecole fluorescenti e/o impostazioni di guadagno. Per calcolare il fattore di conversione, sono necessarie le stesse impostazioni di lunghezza d'onda e guadagno per acquisire i dati di fluorescenza GFP dagli esperimenti senza celle e dai dati della curva standard.
5. Utilizzare l'intervallo di segnale lineare (qui, ad esempio, [FITC] ≤ 0,781 μM) per adattare la pendenza [y = ax e R²] per ogni condizione.
   NOTA: La gamma può differire per le diverse macchine e soluzioni standard utilizzate.
6. Salvare i dati per la calibrazione FITC ed eGFP per calcolare le misure relative per il laboratorio seguendo l'esempio nella Tabella 9. Dividere i valori ottenuti in unità arbitrarie di fluorescenza (u.a.) per il valore della pendenza della curva "a" (y = ax) per stimare la produzione di GFP in termini di FITC o eGFP.

Risultati

Risultati rappresentativi sono mostrati qui dopo la calibrazione del lisato per i livelli ottimali di Mg-glutammato e K-glutammato separatamente per DNA lineare e plasmidico (Figura 1). La concentrazione ottimale di Mg-glutammato è simile tra gli estratti di Δ recB e ΔrecBCD a 8 mM (Figura 1B). Tuttavia, la concentrazione ottimale di K-glutammato per il DNA plasmidico è di 140 mM, mentre la concentrazione ottimale di K-glutammato per il DNA...

Discussione

Qui, mostriamo che il lisato cellulare preparato da E. coli BL21 Rosetta2 con un knockout genomico per l'operone recB o recBCD supporta un'elevata espressione proteica da modelli lineari di DNA. Questo protocollo elabora una procedura di calibrazione del lisato passo-passo specifica per i modelli di DNA lineare (Figura 2), che è un passo critico che porta all'alta espressione da promotori σ70 nel DNA lineare, raggiungendo livelli vicini al plasmide per concentraz...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-YT Broth	Invitrogen	22712020
1.5 mL Safe-Lock tubes	Eppendorf	30120086	1.5 mL microtube
384-well square-bottom microplate	Thermo Scientific Nunc	142761
3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium)	Sigma-Aldrich	P8877
adhesive plate seal	Thermo Scientific Nunc	232701
Agar	Invitrogen	30391023
ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate)	Sigma-Aldrich	A8937
BL21 Rosetta2	Merck Millipore	71402
BL21 Rosetta2 ΔrecB	Addgene	176582
BL21 Rosetta2 ΔrecBCD	Addgene	176583
cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate)	Sigma-Aldrich	A9501
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
CoA (Coenzyme A hydrate)	Sigma-Aldrich	C4282
Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile	Corning	430790	15 mL tube
Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile	Corning	430828	50 mL tube
CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate)	Alfa Aesar	J62238
DpnI	NEB	R0176S
DTT (DL-Dithiothreitol)	Sigma-Aldrich	D0632
Folinic acid (solid folinic acid calcium salt)	Sigma-Aldrich	F7878
GTP (Guanosine 5?-Triphosphate,  Disodium Salt)	Sigma-Aldrich	371701
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
K phosphate dibasic (K2HPO4)	Carl Roth	231-834-5
K phosphate monobasic (H2KO4P)	Sigma-Aldrich	P5655
K-glutamate	Alfa Aesar	A17232
Mg-glutamate	Sigma-Aldrich	49605
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone	Merck Millipore	SLGP033RB	membrane filter 0.22 µm
Monarch PCR & DNA Cleanup Kit	NEB	T1030S	PCR & DNA cleanup Kit
Monarch Plasmid Miniprep Kit	NEB	T1010S	Plasmid Miniprep Kit
NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate)	Sigma-Aldrich	N6522
NIST-traceable FITC standard	Invitrogen	F36915	NIST-FITC
NucleoBond Xtra Maxi kit	Macherey-Nagel	740414.1	Plasmid Maxiprep Kit
PEG 8000	Sigma-Aldrich	89510
plate reader	Biotek	Synergy HTX
Purified Recombinant EGFP Protein	Chromotek	egfp-250	recombinant eGFP
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix	NEB	M0492S	DNA polymerase
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix	New England Biolabs	M0492L	DNA polymerase
Qubit dsDNA BR Assay Kit	Thermo	Q32850	fluorometric assay with DNA-binding dye
RTS Amino Acid Sampler	biotechrabbit	BR1401801
Spermidine	Sigma-Aldrich	85558
Sterile water			Purified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving.
Tris base	Life Science products Cytiva	17-1321-01
tRNA	Roche	10109550001
Ultrasonic processor Vibra cell VC-505	SONICS	VC505	sonicator
UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate)	Acros Organics	226310010
Water, nuclease-free	Thermo	R0581	nuclease-free water