Diffusione e assemblaggio di singole molecole su membrane lipidiche affollate di polimeri

Riepilogo

Qui viene presentato un protocollo per eseguire e analizzare il legame, la mobilità e l'assemblaggio di singole molecole su membrane lipidiche affollate artificiali utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale a singola molecola (smTIRF).

Abstract

Le membrane cellulari sono ambienti molto affollati per le reazioni biomolecolari e la segnalazione. Tuttavia, la maggior parte degli esperimenti in vitro che sondano l'interazione proteica con i lipidi impiegano membrane nude a doppio strato. Tali sistemi mancano delle complessità dell'affollamento da parte di proteine e glicani incorporati nella membrana ed escludono gli effetti di volume associati incontrati sulle superfici della membrana cellulare. Inoltre, la superficie di vetro caricata negativamente su cui si formano i doppi strati lipidici impedisce la libera diffusione delle biomolecole transmembrana. Qui, presentiamo una membrana polimero-lipidica ben caratterizzata come imitazione per membrane lipidiche affollate. Questo protocollo utilizza lipidi coniugati con glicole polietilenico (PEG) come approccio generalizzato per incorporare i crowder nel doppio strato lipidico supportato (SLB). In primo luogo, viene presentata una procedura di pulizia dei vetrini microscopici e dei vetrini per l'esecuzione di esperimenti a singola molecola. Successivamente, vengono discussi i metodi per caratterizzare i PEG-SLB ed eseguire esperimenti a singola molecola del legame, della diffusione e dell'assemblaggio di biomolecole utilizzando il tracciamento di singole molecole e il fotosbiancamento. Infine, questo protocollo dimostra come monitorare l'assemblaggio di nanopori della tossina batterica che forma i pori Citolisina A (ClyA) su membrane lipidiche affollate con analisi di fotosbiancamento a singola molecola. Sono inclusi anche codici MATLAB con set di dati di esempio per eseguire alcune delle analisi comuni come il tracciamento delle particelle, l'estrazione del comportamento diffusivo e il conteggio delle subunità.

Introduzione

Le membrane cellulari sono sistemi altamente affollati e complessi¹. L'affollamento molecolare può avere un impatto considerevole sulla diffusione di entità legate alla membrana come proteine e lipidi ^2,3,4. Allo stesso modo, le reazioni bimolecolari sulle membrane lipidiche come la dimerizzazione dei recettori o l'oligomerizzazione dei complessi di membrana sono influenzate dall'affollamento ^5,6,7. La natura, la configurazione e la concentrazione dei crowder possono governare il legame di membrana, la diffusività e l'interazione proteina-proteina in diversi modi ^8,9. Poiché controllare l'affollamento delle membrane cellulari e interpretare la sua influenza sulle biomolecole incorporate è impegnativo, i ricercatori hanno cercato di stabilire sistemi alternativi in vitro ¹⁰.

Un approccio popolare per le membrane artificiali affollate è il drogaggio delle membrane a doppio strato con polimeri (come polietilenglicole, PEG) lipidi innestati^11,12. Durante la visualizzazione della dinamica proteica e lipidica su doppi strati lipidici supportati (SLB), questi polimeri schermano ulteriormente i componenti incorporati nella membrana dal substrato sottostante caricato negativamente (come il vetro) sollevando efficacemente il doppio strato lontano dal supporto sottostante. Variando la dimensione e la concentrazione del polimero, è possibile controllare l'estensione dell'affollamento molecolare, nonché la sua separazione dal supporto solido sottostante^13,14. Questo è chiaramente un vantaggio rispetto ai doppi strati lipidici supportati su substrati solidi senza cuscini polimerici^15,16, dove le biomolecole transmembrana possono perdere la loro attività^17,18,19. Ancora più importante, ci permette di ricapitolare l'ambiente affollato della membrana cellulare in vitro, che è fondamentale per molti processi di membrana.

Anche i polimeri innestati superficialmente sulle membrane subiscono cambiamenti nella loro configurazione a seconda della loro densità di innesto¹². A basse concentrazioni, rimangono in una configurazione a spirale entropica, nota come fungo, sopra la superficie della membrana. Con l'aumentare della concentrazione, iniziano a interagire e tendono a srotolarsi ed estendersi, producendo infine una densa formazione simile a una spazzola sulla membrana²¹. Poiché la transizione dal fungo al regime del pennello è altamente eterogenea e si manifesta in condizioni scarsamente caratterizzate del polimero, è importante utilizzare condizioni ben caratterizzate per l'affollamento su membrane innestate in polimero. Rispetto ad un recente studio²⁰, identifichiamo e riportiamo composizioni di membrana affollate che mantengono il trasporto diffusivo e l'attività delle biomolecole transmembrana.

In questo protocollo, discutiamo come generare membrane lipidiche PEGilate e forniamo raccomandazioni per le densità PEG che imitano l'affollamento in due diversi regimi di configurazione polimerica (vale a dire, funghi e spazzole). Il protocollo descrive anche il legame di singole molecole, il tracciamento delle particelle e l'acquisizione e l'analisi dei dati di photobleaching per le molecole incorporate in queste membrane affollate. In primo luogo, descriviamo le fasi di pulizia approfondite, l'assemblaggio della camera di imaging e la generazione di PEG-SLB. In secondo luogo, forniamo dettagli per il legame a singola molecola, il tracciamento delle particelle e gli esperimenti di fotosbiancamento. In terzo luogo, discutiamo i) estraendo le affinità di legame relative, ii) caratterizzando la diffusione molecolare e iii) contando le subunità in un assemblaggio proteico da film di singole molecole sulla membrana.

Mentre abbiamo caratterizzato questo sistema con l'imaging a singola molecola, il protocollo è utile per tutti i biofisici di membrana interessati a comprendere l'effetto dell'affollamento sulle reazioni biomolecolari sulle membrane lipidiche. Nel complesso, presentiamo una solida pipeline per la realizzazione di doppi strati lipidici affollati e supportati, insieme a vari saggi a singola molecola condotti su di essi e le corrispondenti routine di analisi.

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Protocollo

1. Pulizia del vetrino e del coprivetrino per esperimenti a singola molecola

1. Prima dell'assemblaggio della camera di imaging, pulire e preparare sia i vetrini che i vetrini. Praticare più coppie di fori sui vetrini utilizzando una perforatrice con punte diamantate (0,5-1 mm di diametro). Se si utilizzano fogli acrilici, utilizzare un taglio laser per praticare fori precisi (0,5 mm), come mostrato nella Figura 1.
   NOTA: Ogni coppia di fori fungerà da ingresso e uscita per lo scambio di flusso per una singola camera microfluidica. Un file CAD rappresentativo per i fori in un vetrino acrilico è disponibile nel file di codifica supplementare 1. I fori praticati su vetrini di solito finiscono per essere 1,5x-2x più grandi della dimensione della punta del trapano.
2. Pulire i vetrini e i vetrini con detergente. Risciacquarli accuratamente con acqua deionizzata. Posizionare i vetrini e i vetrini in un barattolo separato per la colorazione dei vetrini (Coplin) con acqua e sonicare in un sonicatore da bagno per 30 minuti. Per tutti i passaggi di sonicazione, utilizzare un'impostazione di potenza di 70 W.
3. Rimuovere l'acqua e riempire il barattolo Coplin contenente i vetrini e i vetrini con acetone fino all'orlo (50-100 ml a seconda del volume del barattolo). Nel caso di fogli acrilici, utilizzare lo stesso volume di soluzione di acetone premiscelata al 50% (v/v), altrimenti i vetrini diventeranno gelidi. Agitare il barattolo Coplin per assicurarsi che tutti i vetrini e i vetrini siano completamente immersi nella soluzione e sonicare in un sonicatore da bagno per 30 minuti.
4. Rimuovere l'acetone e gettarlo in un contenitore per rifiuti, versare il metanolo nei barattoli Coplin (50%, v / v per vetrini acrilici) e sonicare per 30 minuti. Sia l'acetone che il metanolo vengono utilizzati per rimuovere le particelle organiche sui vetrini.
5. Risciacquare i vetrini e i coprivetrini con abbondanti quantità di acqua di tipo 1 e metterli in un barattolo di vetro Coplin. Versare la soluzione 1 M KOH nel barattolo e sonicare per 1 ora. Per i vetrini acrilici, utilizzare 0,5 M di KOH.
6. Gettare il KOH in un contenitore per rifiuti inorganici. Risciacquare il barattolo con abbondante acqua e posizionare i barattoli Coplin in una cappa aspirante per il trattamento piranha. Non eseguire il trattamento piranha per vetrini acrilici; Procedere direttamente al passaggio 1.9.
   ATTENZIONE: Il trattamento con Piranha deve essere effettuato in una cappa aspirante con guanti adeguati, occhiali di sicurezza e un grembiule per la manipolazione degli acidi. La soluzione di Piranha è un forte agente ossidante e rimuove eventuali particelle organiche residue dai vetrini e dai vetrini.
7. Per preparare la soluzione di piranha, versare delicatamente un volume di 2/3 di acido solforico (98%, v/v) in un bicchiere di vetro e riempire il resto con perossido di idrogeno (30%, v/v). Mescolare accuratamente la soluzione con una bacchetta di vetro, versarla nel barattolo Coplin e lasciare il barattolo Coplin nella cappa aspirante per almeno 1 ora.
8. Decantare la soluzione di piranha dal barattolo Coplin in un contenitore di scarto per rifiuti acidi conservati all'interno della cappa aspirante. Risciacquare il barattolo Coplin con una quantità abbondante di acqua di tipo 1.
9. Asciugare i vetrini e i vetrini in un getto delicato di azoto gassoso e metterli in un barattolo Coplin pulito. I vetrini e i vetrini essiccati sono ora pronti per il trattamento al plasma. Prendi un paio di vetrini e coprivetrini e mettili nella macchina al plasma.
10. Crea un vuoto nella camera. Ruotare la manopola sulla frequenza radio di 8-12 MHz per generare plasma nella camera. Un bagliore viola all'interno della camera indicherà la formazione di un plasma nella camera.
11. Eseguire il trattamento al plasma per 8-10 min. Rilasciare delicatamente il vuoto dopo aver spento il plasma e procedere al passaggio 2 per l'assemblaggio della camera di imaging microfluidica.

2. Assemblaggio della camera microfluidica

NOTA: la camera di imaging viene creata inserendo del nastro biadesivo tra un vetrino e una slitta pre-puliti del passaggio precedente, come descritto di seguito.

1. Montare i vetrini e il coprislip dopo il trattamento al plasma, come mostrato nella Figura 1. Posizionare il vetrino su una carta velina pulita. Tagliare il nastro biadesivo in strisce larghe ~ 2-3 mm e posizionarle su ciascun lato di un paio di fori sul vetrino. Utilizzare una punta del pipet per appiattire il nastro o causerà perdite da un canale all'altro.
   NOTA: In alternativa, tagliare il nastro per l'intera diapositiva utilizzando un laser o una taglierina plotter automatica (Figura 1).
2. Posizionare il vetrino di copertura trattato al plasma sul vetrino con nastro adesivo per chiudere la camera. Utilizzare una punta del pipet per premere delicatamente il coperchio sulle regioni con nastro adesivo per rendere il canale impermeabile.
3. Se si utilizzano vetrini, sigillare i bordi con resina epossidica. Infine, ogni camera di imaging costituita da una diapositiva e da una copertina ha una dimensione di 10 mm x 2 mm x 0,1 mm (lunghezza x larghezza x profondità). Conservare le camere di imaging microfluidico preparate per 1-2 settimane in condizioni essiccate (preferibilmente tra 10-25 °C).
   NOTA: Per i nastri tagliati al laser utilizzati con vetrini acrilici, non è necessario utilizzare resina epossidica poiché i bordi del nastro formano una tenuta ermetica a prova di perdite.

3. Realizzazione di due strati supportati su substrato di vetro mediante fusione di vescicole

NOTA: I doppi strati lipidici supportati affollati sono generati sulle pareti della camera di imaging dalla fusione di vescicole lipidiche preparate con lipidi PEG drogati.

1. Prenda una fiala di vetro pulita, preferibilmente pre-pulita con la soluzione di piranha. Aggiungere la soluzione di cloroformio di 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina (POPC) e 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[ammino(polietilenglicole)-2000] (DOPE-PEG2000) alla frazione mole desiderata dei lipidi PEG2000 in modo tale che la concentrazione finale dopo l'aggiunta del tampone sia di 3 mM lipidi nella fase 3.4. Preparare altre composizioni di membrana di lipidi in modo simile.
2. Asciugare il cloroformio dal flaconcino usando un leggero getto di azoto con un piccolo vortice in modo che i lipidi essiccati siano uniformemente rivestiti sulla superficie del flaconcino. Mettere il flaconcino in un essiccatore sottovuoto per 1 ora. Questo rimuoverà qualsiasi residuo di cloroformio nel flaconcino di vetro. Aggiungere 1 mL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) e incubare per una notte a 37 °C.
3. Preparare piccole vescicole unilamellari (SUV) come descritto di seguito.
   1. Vortice delicatamente per 1-2 minuti dopo l'incubazione durante la notte fino a quando la soluzione diventa torbida e lattiginosa.
   2. Prelevare 100 μL di questa soluzione in una piccola provetta da centrifuga da 500 μL e sonicare per circa 1 ora in un sonicatore da bagno (impostato su una regolazione di potenza di 70 W). La soluzione diventerà chiara; In caso contrario, sonicare per altri 30 minuti. Questo passaggio genererà SUV di 50-100 nm di diametro.
      NOTA: Se ci si prepara per la prima volta, caratterizzare i SUV utilizzando la diffusione dinamica della luce^22,23 (DLS) o un metodo equivalente.
4. Aggiungere cloruro di calcio (CaCl_2, 3 M stock) alle vescicole sonicate in modo tale che la sua concentrazione finale sia di 30 mM nella soluzione lipidica.
5. Tagliare una punta di micropipetta per iniettare la soluzione campione in modo che si adatti perfettamente al foro. Mescolare la soluzione lipidica e iniettare attraverso uno dei fori nella camera di imaging realizzati al punto 2. Pulire la soluzione in eccesso che esce dalla camera dall'uscita con un fazzoletto pulito per prevenire la contaminazione dei canali adiacenti.
6. Lasciare questo assemblaggio in una camera umidificata per 90 minuti. Preparare una camera umidificante ponendo un fazzoletto umido all'estremità di una provetta da centrifuga da 50 ml. Posizionare la slitta lateralmente all'interno del tubo con i tappi del tubo chiusi. Le vescicole si fonderanno e genereranno un doppio strato uniforme sulla superficie del vetro.
7. Lavare accuratamente la camera con una quantità abbondante di tampone PBS (circa 5 volte il volume della camera di imaging). Impedire l'ingresso di bolle d'aria nella camera durante il lavaggio in quanto ciò può generare difetti nella membrana.

4. Configurazione del microscopio e misurazioni di imaging a singola particella

NOTA: Gli esperimenti a singola molecola sono condotti su una configurazione al microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale^24,25,26 (TIRF) basata su obiettivi (Figura 2). L'imaging TIRF fornisce un migliore rapporto segnale-rumore per l'imaging a singola molecola, sebbene i microscopi a epifluorescenza possano essere utilizzati anche in determinate condizioni (specialmente quando le biomolecole fluorescenti possono essere rimosse dalla soluzione di massa mediante lavaggio). Il tipo a prisma TIRF può essere utilizzato, ma il tipo obiettivo è preferibile per la facilità di impostazione della microfluidica²⁷. Per il TIRF di tipo obiettivo, si raccomanda un obiettivo ad apertura numerica elevata (ingrandimento 100x, di solito disponibile in commercio come obiettivo TIRF).

1. Prima di condurre qualsiasi esperimento sulla mobilità e l'assemblaggio, allineare il microscopio TIRF per garantire un rapporto segnale-rumore ottimale grazie all'illuminazione del campo evanescente. Durante l'allineamento, mantenere bassa la potenza del laser, tra 100 μW e 1 mW.
   ATTENZIONE: Gli occhiali di sicurezza laser devono essere utilizzati durante l'allineamento del raggio laser.
   1. Per allineare il microscopio, preparare un campione di perline fluorescenti aggiungendole nel canale microfluidico a basse concentrazioni (a ~ 100 pM) in modo che le macchie fluorescenti delle singole perle non si sovrappongano nelle immagini.
   2. Innanzitutto, visualizza le perle in modalità epifluorescenza. Mentre l'illuminazione è in modalità epifluorescenza, spostare lo stadio di traslazione dello specchio M5 (lo specchio che riflette il laser al dicroico) in modo tale che il raggio che esce dall'obiettivo si pieghi fino a quando alla fine è in una configurazione di riflessione interna totale.
   3. Verificare se l'illuminazione TIR è stata raggiunta. Quando il campo evanescente TIR illumina il campione di perline, controllare che siano visibili solo le perle sulla superficie e che non si osservino sfere fluttuanti dalla superficie.
2. All'inizio dell'esperimento, impostare la potenza del laser sul piano focale posteriore dell'obiettivo a 5-10 mW per prevenire la fotodistruzione (fotosbiancamento) dei fluorofori.
3. Tenere il vetrino sul palco del microscopio e concentrarsi prima sulla membrana nuda (senza fluorofori). Di solito, piccole tracce di impurità nelle membrane lipidiche sono sufficienti per farlo. Facoltativo: incorporare un piccolo numero di sfere fluorescenti o punti quantici (gamma sub picomolare) durante il passaggio 3.1, in modo tale che solo da due a cinque particelle fluorescenti siano presenti nel campo visivo per facilitare l'identificazione della messa a fuoco corretta.
4. Iniettare il campione (proteine di membrana, ecc.) utilizzando una micropipetta nella camera di imaging rivestita con PEG-SLB realizzata al punto 3.7.
5. Per misurare la cinetica di legame di una singola molecola, utilizzare una pompa a siringa per far fluire le biomolecole marcate attraverso i fori di ingresso nella camera microfluidica (Figura 3). Utilizzare una portata di 50-500 μL/min.
   1. Avviare l'acquisizione del filmato prima di aggiungere la soluzione nella camera di imaging. Acquisire >5.000 fotogrammi a un frame rate di 25-50 fotogrammi/s sotto flusso continuo fino a quando non vi è un ulteriore aumento della comparsa di nuove macchie sulla superficie della membrana (Video 1). Per l'analisi della cinetica di legame, seguire i passaggi di 6.1.
6. Per il tracciamento di singole particelle, aggiungere le biomolecole marcate a basse concentrazioni (rispetto alla costante di legame) al canale utilizzando una micropipetta. Ottimizzare la concentrazione a una densità di <0,1 particelle/μm 2 in modo che le singole particelle raramente si incrocino (Video 2). Ciò garantisce l'alta fedeltà delle tracce recuperate dai set di dati. Incubare se necessario (in caso di scarso legame della membrana da parte di biomolecole, ~10 min) in un ambiente umidificante e lavare la camera con il tampone.
   NOTA: Il lavaggio è necessario nel caso in cui il legame sia scarso sulla membrana e la maggior parte delle molecole fluorescenti rimangano nella soluzione. In caso contrario, ciò potrebbe interferire con l'imaging e causare uno scarso rapporto segnale-rumore.
7. Per l'analisi della traiettoria di singole particelle, acquisire 200-500 fotogrammi a 10-100 fotogrammi/s. Mantenere l'obiettivo focalizzato sul piano a doppio strato con una deriva minima dello stadio durante l'intervallo di acquisizione.

5. Acquisizione di immagini per il conteggio di subunità in un assemblaggio proteico

NOTA: L'acquisizione di immagini per la stima della stechiometria richiede lo sbiancamento continuo dei fluorofori e il rilevamento del numero di passaggi fino a quando non emettono più fluorofori fluorescenza.

1. Per misurare le subunità, aggiungere la concentrazione rilevante di biomolecole marcate (esempio: vedi risultati; ClyA è stato aggiunto a una concentrazione di 25 nM) alla camera di imaging microfluidico e incubato (lavare se necessario). Incubare il vetrino in una camera umidificante alla temperatura desiderata per il tempo richiesto (esempio: 37 °C e 60 minuti per il montaggio di ClyA).
2. Eseguire l'acquisizione di immagini per il fotosbiancamento a singola molecola come descritto di seguito.
   1. Lavare la camera di imaging con un tampone prima di eseguire l'imaging (se necessario). Posizionare il vetrino sul microscopio e regolare la messa a fuoco per visualizzare le molecole etichettate.
   2. Impostare la potenza del laser a un livello in cui lo sbiancamento del fluoroforo avvenga gradualmente (~1-5 min). Idealmente, per ogni biomolecola assemblata, mantenere la velocità di passo del fotosbiancamento >10-20 fotogrammi di imaging. Acquisire le immagini fino a quando tutte le molecole sono completamente fotosbiancate (Video 3).
      NOTA: per determinare la durata totale della traiettoria di fotosbiancamento richiesta, tracciare l'intensità media dei singoli punti con il numero di fotogrammi di imaging e determinare la costante di tempo adattando una funzione di decadimento esponenziale. La durata totale dell'acquisizione può essere impostata su 5-10 volte la costante di tempo.
3. Eseguire una misurazione di assemblaggio dipendente dal tempo avviando l'acquisizione del filmato non appena il campione viene introdotto nella camera e acquisendo nuovi filmati fotosbiancanti a intervalli di tempo fissi dopo il legame della membrana da diversi segmenti del PEG-SLB.

6. Analisi di immagini e dati

1. Eseguire il legame e il tracciamento di singole particelle come descritto di seguito.
   1. Estrarre traiettorie a singola particella dai filmati acquisiti sopra, come mostrato nella Figura 4. Per rilevare singole particelle e tracciarle, utilizzare il pacchetto MATLAB, u-track²⁸ o Trackmate²⁹, un plug-in di ImageJ, che fornisce anche un robusto algoritmo di tracciamento di singole particelle. Seguire i passaggi per impostare l'analisi u-track come mostrato nel file supplementare 1.
      NOTA: I parametri critici per il tracciamento di singole particelle sono la deviazione standard della dimensione delle particelle (in pixel) e la lunghezza di chiusura dello spazio. Utilizzare 1 e 0, rispettivamente, per questi parametri come criteri più rigorosi per il monitoraggio.
   2. Per calcolare le costanti della velocità di legame, stimare prima il numero di particelle che si legano alla superficie della membrana nel tempo. Utilizzare il file MATLAB binding_SPT (Supplementary Coding File 2) con la cartella di output u-track per identificare e tracciare il numero di particelle che appaiono sulla membrana ottenuta dal passaggio 6.1. Adattare la cinetica osservata a modelli cinetici appropriati (esempio: singolo adattamento esponenziale per determinare la costante di tempo, il cui inverso può essere assegnato alla costante di velocità apparente)³⁰ per estrarre le costanti di velocità (vedere risultati, Figura 5).
   3. Lo spostamento quadratico medio (MSD) delle particelle diffuse (come il tracciante del DNA nelle SLB PEG, Figura 6) indica la natura della diffusione. Utilizzare il pacchetto MATLAB MSD_ISD (Supplementary Coding File 2) con la cartella di output u-track per ottenere il grafico MSD in funzione del tempo di ritardo (Figura 6B).
   4. Per identificare specie eterogenee a diffusione, calcolare le distribuzioni di spostamento istantaneo al quadrato (ISD) come mostrato nella Figura 6C. ISD2, definito come (X t+τ - X t)2 + (Y_t+τ− Y_t)2, dove il tempo di ritardo, _τ = ², è preferito in quanto riduce il rumore. Filtra le traiettorie brevi con meno di tre fotogrammi per ridurre il rumore.
   5. Usa ISD_analyzer (Supplementary Coding File 2) in MATLAB con l'output u-track per tracciare gli ISD delle particelle tracciate (Figura 6C).
2. Eseguire l'analisi di fotosbiancamento a singola molecola come descritto di seguito.
   1. Per stimare la stechiometria dei complessi di membrana, eseguire un'analisi di fotosbiancamento sulle intensità dipendenti dal tempo dei complessi fluorescenti (Video 3). Per questo, applicare un algoritmo di correzione della deriva (drift_correct_images, Supplementary Coding File 2) basato sull'autocorrelazione dei fotogrammi del filmato per estrarre la deriva della traslazione. Ciò presuppone che le strutture assemblate siano in gran parte immobili durante l'acquisizione dell'immagine. Esegui il pacchetto MATLAB Extract_traces_1C (Supplementary Coding File 2) per rilevare le tracce temporali di intensità delle particelle dai filmati.
   2. Utilizza il codice MATLAB Stepcount_immobile (Supplementary Coding File 2) per eseguire il rilevamento dei passi per le tracce temporali di intensità. Nel caso in cui le particelle non siano immobili, utilizzare il pacchetto u-track per estrarre la posizione delle particelle in movimento. Questo insieme di coordinate xy può essere mappato sui filmati grezzi per estrarre i valori di intensità della particella in movimento mentre si diffonde lateralmente sulla membrana. Utilizza il pacchetto MATLAB utrack_Int (Supplementary Coding File 2) con l'output dell'analisi u-track per questa opzione.
   3. Eseguire una correzione per l'etichettatura incompleta delle biomolecole con tag fluorofori per stimare la corretta stechiometria del complesso proteico. Determinare l'efficienza di marcatura con uno spettrofotometro UV-VIS misurando l'assorbimento di colorante e proteine per stimare la concentrazione. Calcola l'efficienza di etichettatura come rapporto molare tra il colorante e la proteina.
      NOTA: Alcuni coloranti assorbono anche a lunghezze d'onda vicine a 280 nm e, quindi, questo contributo di assorbimento da parte del colorante deve essere considerato durante il calcolo della concentrazione.
   4. Eseguire una correzione binomiale per tenere conto dell'efficienza di etichettatura incompleta del fluoroforo nel modo seguente utilizzando il codice MATLAB Step_correction (Supplementary Coding File 2) con i dati ottenuti dal conteggio dei passi nel passaggio 6.2.2. Ad esempio, per una tossina che forma pori come la citolisina A, che forma una struttura ad anello dodecamerica, applicare una correzione binomiale utilizzando la seguente formula:
      n_k
      dove = efficienza di etichettatura, n = numero di passaggi di fotosbiancamento e s = conteggi effettivi. Usa il Stepcount_immobile di routine MATLAB per recuperare le specie oligomeriche corrette. Convertire la frequenza degli oligomeri (s_i) in frazioni di massa (Figura 7C; File di codifica supplementare 2).
      NOTA: un insieme di file analizzati è incluso nel file di codifica supplementare 3. I codici MATLAB nel Supplementary Coding File 2 possono essere eseguiti con questi set di dati.

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Risultati

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Discussione

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.5 ml Syringes	HMD Healthcare	Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin	Plastic syringe
Acetone	Finar Chemicals	10020LL025
Acrylic Sheet			2 mm thick
Acrylic Sheet	BigiMall		2 mm, Clear
Bath Sonicator	Branson	CPX-1800
Calcium Chloride
Chloroform	Sigma	528730	HPLC grade
Cholesterol	Avanti	700100
Coplin Jar	Duran Wheaton Kimble	S6016	8 Slide Jar with Glass Cover
Coverslips	VWR	631-1574	24 mm X 50 mm
Cy3-DNA Strand	IDT		GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT GGTGTGGTTGG-Cy3
Cyanine Dye (Cy3)	Cytiva Life Sciences	PA23001
DiI	Invitrogen	D3911	Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))
DNA Connector Strand 1	Sigma Aldrich		GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC T
DNA Connector Strand 2	Sigma Aldrich		CGGACGCAATAGCAGCTCACAG TCGGTCACAT
DNA Tocopherol Strand	Biomers		Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA
DOPE-PEG2000	Avanti	880130	1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)
Double Sided Tape	3M	LF93010LE
Drill Bits (Diamond Coated)			0.5 - 1 mm
Drilling Machine	Dremel	220	Workstation
EMCCD	Andor	DU-897U-CS0-#BV
Fluorescence Beads	Invitrogen	F10720
Glass Slides	Blue Star		Micro Slides, PIC-1
Glass Vials	Sigma	854190
Hydrogen Peroxide	Lobachemie	00182	30% Solution, AR Grade
Labolene	Thermo-Fischer Scientific		Detergent
Laser 532 nm	Coherent	Sapphire
Laser Cutter	Universal Laser Systems	ILS12.75
Lissamine Rhodamine DOPE	Avanti	810150	1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)
Methanol	Finar Chemicals	30932LL025
Microscope	Olympus	IX81
Phosphate Buffer Saline (PBS)			1X
Plasma Cleaner	Harrick Plasma Inc	PDC-002
POPC	Avanti	850457	1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine
Programmable Syringe Pump	New Era Pump Systems	NE1010	High Pressure Syringe Pump
PTFE Caps	Sigma	27141
PTFE Tubing	Cole-Parmer	WW-06417-21	Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD
Sulphuric Acid	SD Fine Chemicals		98%, AR Grade
TIRF Objective	Olympus	UPLAPO100XOHR
Vacuum Desiccator	Tarsons
Vortex Mixer	Tarsons