Valutazione della guarigione delle fratture ossee mediante tomografia microcomputerizzata

Riepilogo

La microtomografia computerizzata (μCT) è uno strumento di imaging non distruttivo che è fondamentale per valutare la struttura ossea negli studi preclinici, tuttavia c'è una mancanza di consenso sulle procedure μCT per l'analisi del callo di guarigione ossea. Questo studio fornisce un protocollo μCT passo-passo che consente il monitoraggio della guarigione delle fratture.

Abstract

La tomografia microcomputerizzata (μCT) è la modalità di imaging più comune per caratterizzare la morfologia tridimensionale (3D) dell'osso e dell'osso di nuova formazione durante la guarigione delle fratture nelle indagini di scienza traslazionale. Gli studi sulla guarigione delle fratture delle ossa lunghe nei roditori comportano in genere una guarigione secondaria e la formazione di un callo mineralizzato. La forma del callo formato e la densità dell'osso appena formato possono variare sostanzialmente tra i punti temporali e i trattamenti. Mentre le metodologie standard per quantificare i parametri dell'osso corticale e trabecolare intatto sono ampiamente utilizzate e incorporate nei software disponibili in commercio, c'è una mancanza di consenso sulle procedure per l'analisi del callo in via di guarigione. Lo scopo di questo lavoro è quello di descrivere un protocollo standardizzato che quantifica la frazione di volume osseo e la densità minerale del callo nel callo in via di guarigione. Il protocollo descrive diversi parametri che devono essere considerati durante l'imaging e l'analisi, tra cui l'allineamento del campione durante l'imaging, la dimensione del volume di interesse e il numero di fette che vengono sagomate per definire il callo.

Introduzione

L'imaging con tomografia microcomputerizzata (μCT) è stato ampiamente utilizzato nella ricerca ossea preclinica, fornendo immagini non invasive e ad alta risoluzione per valutare la microstruttura delle ossa 1,2,3,4,5. La μCT coinvolge un gran numero di immagini a raggi X, ottenute da un campione rotante o utilizzando una sorgente di raggi X rotante e un rivelatore. Gli algoritmi vengono utilizzati per ricostruire i dati volumetrici 3D sotto forma di una pila di sezioni di immagine. La TC clinica è il gold standard per l'imaging 3D delle ossa umane e la μCT è una tecnica comunemente usata per valutare l'efficienza della guarigione ossea negli animali da esperimento 1,2,3,4,6,7. L'osso mineralizzato ha un eccellente contrasto ai raggi X, mentre i tessuti molli hanno un contrasto relativamente scarso a meno che non venga utilizzato un mezzo di contrasto. Nella valutazione della guarigione delle fratture, μCT genera immagini che forniscono informazioni dettagliate sulla struttura 3D e sulla densità del callo mineralizzato. La scansione μCT in vivo può essere utilizzata anche per la valutazione longitudinale e temporale della guarigione delle fratture.

La quantificazione dell'osso corticale e trabecolare intatto mediante μCT è generalmente ben consolidata e standardizzata⁸. Sebbene gli studi preclinici utilizzino una varietà di metodologie di quantificazione per analizzare la guarigione delle fratture 9,10,11^, non è stato ancora pubblicato un protocollo dettagliato di analisi delle immagini μCT per la quantificazione del callo. Pertanto, lo scopo di questo studio è quello di fornire un protocollo dettagliato passo dopo passo per l'imaging μCT e l'analisi del callo in guarigione ossea.

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Protocollo

Il seguente protocollo è stato sviluppato per caratterizzare il callo di guarigione delle ossa lunghe prelevato da topi sottoposti a eutanasia. Tuttavia, la maggior parte dei passaggi può essere applicata ai ratti e utilizzata anche per la scansione in vivo delle ossa fratturate. Il protocollo descrive un particolare sistema μCT e uno specifico software di elaborazione, analisi e visualizzazione delle immagini (vedere la tabella dei materiali), ma la metodologia è generalmente applicabile ad altri scanner e software. Il protocollo è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee del Pennsylvania State University College of Medicine. I topi utilizzati in questo studio erano topi maschi C57BL/6J di 16 settimane (peso medio 31,45 ± 3,2 g).

1. Prelievo e conservazione dei tessuti

NOTA: Utilizzare un modello di frattura murina adatto. Per questo studio è stato utilizzato il modello di frattura tibiale aperta medio-diafisaria secondo il protocollo standard descritto in^12,13.

1. Al termine dell'esperimento del modello di frattura, sopprimere il topo somministrando un'iniezione intraperitoneale di ketamina o xilazina (rispettivamente 500 mg/kg o 50 mg/kg).
2. Usando le forbici, prelevare l'osso fratturato dalla metà del femore all'articolazione tibioastragalica senza disturbare il sito della frattura. Rimuovere i muscoli che circondano l'osso lasciando solo i tessuti molli che sono a diretto contatto con l'osso per sostenere il sito di frattura durante le successive fasi di lavorazione. Rimuovere il perno intramidollare utilizzando una pinza emostatica diritta microzanzare.
3. Conservare i campioni in formalina a 4 °C o in soluzione salina a -20 °C. La scelta del veicolo di conservazione dipende dalle applicazioni previste a valle di μCT. In questo studio, i campioni sono stati conservati in soluzione salina a -20 °C.

2. Scansione μCT

1. Preparazione del campione
   1. Per la scansione simultanea di più campioni, posizionare fino a sei campioni in un dispositivo di scansione personalizzato e stampato in 3D (Figura 1 A, B) o simile. La scansione simultanea riduce i tempi e i costi di scansione. Il dispositivo personalizzato utilizzato in questo studio contiene sei fessure per contenere i campioni di ossa lunghe e un foro centrale per un fantoccio di idrossiapatite (HA) (Figura 1A,B; Tabella dei materiali).
      NOTA: Il fantoccio HA servirà come standard nel passaggio 4.2 (vedi sotto) per convertire le unità μCT (tipicamente Hounsfield) in densità HA (mgHA/ccm).
   2. Posizionare l'apparecchio preparato in una siringa o in un tubo conico simile al diametro del campo visivo (FOV; Figura 1C). In questo studio, è stata utilizzata una siringa da 20 mm per abbinare il campo visivo di 21,5 mm.
   3. Per evitare che i campioni si secchino durante il processo di scansione, riempire la siringa o la provetta canonica con il conservante utilizzato nella fase 1.3 (in questo studio è stata utilizzata soluzione fisiologica).
2. Scansione
   1. Prima di eseguire la scansione, verificare che la macchina μCT sia calibrata come segue: posizionare un fantoccio HA sulla linea centrale del campo visivo μCT, eseguire la scansione del fantoccio e misurare la densità di HA. Assicurarsi che la densità misurata sia coerente con la densità fornita dal produttore.
   2. Allineare la linea centrale del dispositivo di fissaggio del campione con la linea centrale approssimativa del FOV μCT. Ciò garantisce che i campioni si trovino all'interno del campo visivo e che i loro assi lunghi abbiano un orientamento approssimativamente coincidente con la direzione assiale delle immagini risultanti.
      NOTA: Questo orientamento standardizzato può in seguito contribuire a rendere la procedura di analisi meno soggetta a variabilità, ad esempio nella quantità di tessuto considerato all'interno del volume di interesse.
   3. Impostare i parametri di scansione del sistema μCT (Table of Materials). I parametri utilizzati in questo studio sono 10,5 μm (dimensione isotropa del voxel), 55 kVp (energia/intensità), 145 μA (corrente) e 300 ms (tempo di integrazione). Determinare la dimensione del voxel in base allo spessore approssimativo delle trabecole di topo (20-60 μm)⁸. Ispezionare visivamente la scansione in diverse viste per assicurarsi che copra l'intero volume di tutti i campioni di callo.

Figura 1: Struttura del dispositivo di scansione personalizzato. (A) Immagini del dispositivo di scansione (in alto), che mostrano i sei slot del campione e il fantoccio HA (in basso). (B) Immagini che mostrano il campione di osso lungo (in alto) e il fantoccio di HA (in basso) posizionati nelle fessure dedicate. (C) Immagini che mostrano il dispositivo di scansione inserito in una siringa da 20 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Segmentazione delle immagini

NOTA: le immagini raw vengono ricostruite automaticamente in base ai dati della sequenza di immagini.

1. Conversione di immagini: convertire i dati della sequenza di immagini ricostruite in sequenze di immagini DICOM utilizzando un software di elaborazione delle immagini (vedere la tabella dei materiali). Importare sequenze di immagini DICOM nel software (vedere Tabella dei materiali) per l'elaborazione, l'analisi e la visualizzazione delle immagini (Figura 2A).
2. Ritaglio dell'immagine: un campione alla volta, ritaglia ogni pila di immagini e assicurati che l'intero campione sia incluso nel volume ritagliato (Figura 2B). Salvare l'immagine ritagliata come segue: fare clic sulla scheda File nella parte superiore sinistra dello schermo, selezionare Salva progetto, quindi selezionare Riduci dimensioni progetto dalle opzioni visualizzate sullo schermo. Il file verrà salvato nel formato del software commerciale.
3. Riduzione del rumore dell'immagine: utilizzare un metodo di filtraggio per ridurre il livello di rumore ed evitare sfocature come segue.
   1. Fare clic sulla scheda File e scegliere l'immagine da elaborare utilizzando Open Data. L'immagine aperta apparirà nella finestra di visualizzazione del progetto nell'angolo in alto a sinistra dello schermo.
   2. Fare clic con il pulsante destro del mouse per selezionare Elaborazione immagini e quindi Sandbox filtro. Fai clic su Crea.
   3. Effettuate le seguenti operazioni nella finestra Proprietà (nell'angolo in basso a sinistra dello schermo): scegliete Dati come tipo di anteprima; selezionare il tipo di filtro dal menu a tendina accanto a Filtro; scegliere il 3D per l'interpretazione; selezionare Separabile dal menu a tendina accanto al tipo di kernel; inserire i valori da utilizzare per la deviazione standard e il fattore di dimensione del kernel nella casella vuota disponibile accanto a ciascuno di essi; selezionare Uguale all'input dal menu a discesa accanto all'output; fare clic su Applica.
      NOTA: La scelta del tipo di filtro (le opzioni disponibili sono bilaterale, parallelepipedo, gaussiano, mediana, esponenziale ricorsivo, delineata, diffusione anisotropa, media non locale, maschera di contrasto e filtro FFT) e dei parametri dipende dal livello di rumore e dalla dimensione del voxel delle immagini acquisite. Per il filtro gaussiano, 3 x 3 x 3 e 5 x 5 x 5 sono valori comunemente usati per il fattore di dimensione del kernel, mentre 0,5-2,0 è comunemente usato per la deviazione standard⁸. In questo studio, è stato applicato un filtro gaussiano e sono stati utilizzati 5 x 5 x 5 e 0,8 rispettivamente per il fattore di dimensione del kernel e la deviazione standard.
4. Riallineamento dell'immagine
   NOTA: questo è un passaggio facoltativo. Quando durante il processo di scansione si verifica un disallineamento dei campioni di ossa lunghe rispetto agli assi delle coordinate del sistema di imaging, è possibile applicare un metodo di allineamento digitale per correggere il disallineamento (Figura 2C).
   1. Creare un'immagine di rendering 3D dell'esempio come indicato di seguito. Nella finestra di visualizzazione del progetto, selezionare l'immagine filtrata e ritagliata (creata al punto 3.3). Fare clic con il pulsante destro del mouse per selezionare Visualizzazione , quindi Rendering volume dal menu a discesa, quindi fare clic su Crea. Controllare visivamente l'immagine renderizzata in 3D sul piano sagittale e frontale.
   2. Ruotate manualmente il volume di rendering per ottenere un buon allineamento nell'asse longitudinale. Applica la trasformazione alle immagini ruotate come segue: nella finestra delle proprietà, fai clic sull'editor di trasformazione, quindi vai su trasforma-manipolatore e seleziona Trasformatore dal menu a discesa. Ora il campione può essere ruotato e riallineato. Una volta terminato il processo di riallineamento, fai di nuovo clic sull'editor di trasformazione per bloccare l'immagine.
   3. Ricampionare l'immagine filtrata (creata nel passaggio 3.3) per creare nuove sezioni di immagine del piano trasversale (assiale) come segue: Nella finestra Vista progetto, selezionare l'immagine dal passaggio 3.4.2. Fare clic con il pulsante destro del mouse per selezionare Trasformazione geometria , quindi Ricampiona immagine trasformata dal menu a discesa e fare clic su Crea. Nella finestra delle proprietà, vai a Dati ed esegui le seguenti operazioni: per l'interpolazione, seleziona Standard dal menu a discesa; per modalità, scegli Esteso; per conservare, scegli Voxel Size; Per Valore di riempimento, immettere zero nella casella vuota disponibile. Quindi fare clic su Applica.
5. Definizione del volume di interesse (VOI)
   1. Esamina le sezioni trasversali dell'immagine e identifica il piano centrale del callo di frattura. Definire il VOI in base alle estremità prossimali e distali del callo. Nei casi in cui le estremità del callo sono difficili da definire, definire il VOI in base a una distanza standardizzata dal piano centrale del callo (Figura 2D).
      NOTA: Durante le fasi di guarigione che precedono il rimodellamento osseo, definire i bordi del callo mineralizzato è facile perché la struttura trabecolare dell'osso intrecciato di nuova formazione è distinta dalla struttura corticale dell'osso originale. Tuttavia, quando segue la fase di rimodellamento, l'osso appena formato acquisisce gradualmente la struttura corticale; Pertanto, definire i bordi del callo diventa sempre più difficile.

Figura 2: Segmentazione dell'immagine . (A) Un'immagine che mostra sei campioni all'interno di una scansione. (B) Ritaglio dell'immagine per isolare i singoli campioni. (C) Allineamento digitale per correggere un asse longitudinale disallineato (linea tratteggiata gialla). (D) Definizione del piano centrale del VOI e del callo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Analisi dell'immagine

1. Segmentazione del callo e dell'osso corticale
   1. Contorna il contorno esterno del callo in modo semiautomatico utilizzando lo strumento lazo di segmentazione con le opzioni di traccia automatica e traccia bordi (Figura 3A) come segue:
      1. Dopo aver riassemblato le immagini trasformate (passaggio 3.4.3), fare clic sulla scheda Segmentazione nella seconda riga della scheda nella parte superiore dello schermo. Nella finestra dell'editor di segmentazione, selezionare un'immagine trasformata (creata nel passaggio 3.4.3) dal menu a discesa accanto all'immagine.
      2. Nella finestra MATERIALI, fare doppio clic su Aggiungi; In questo modo, appariranno due schede denominate Material3 e Material4. Fare clic con il pulsante destro del mouse per rinominare il materiale3 in callo e il materiale4 in osso corticale.
      3. Nella finestra SELEZIONE, fare clic sull'icona del lazo; dalle opzioni visualizzate, selezionate Mano libera per la modalità 2D, Interno per la modalità 3D e Traccia automatica e Traccia spigoli per le opzioni. Usa il lazo per contrassegnare le regioni di interesse.
   2. Ripetere questa fase di contornatura con le fette campionate attraverso il VOI (Figura 3B). Le fette sagomate possono essere distanziate (ad esempio, separate da 20 fette).
      NOTA: Nelle regioni con strutture complesse del callo, l'utente può prendere in considerazione la possibilità di ridurre la spaziatura tra le fette sagomate per acquisire più frammenti (Figura 3A,B).
   3. Interpolare i contorni sagomati del callo per creare un'etichetta completa del callo (Figura 3C,D) come segue: nella finestra MATERIALI, scegliere il file Callus (creato nel passaggio 4.1.1.2.), fare clic sulla scheda Selezione nella parte superiore dello schermo e selezionare Interpola dal menu a discesa. Nella finestra SELEZIONE, fare clic sul segno più.
   4. Aprire il file Cortical Bone creato nel passaggio 4.1.1.2. Segmentare l'osso corticale, compresa la cavità midollare, come indicato per il callo nei passaggi 4.1.1 e 4.1.2. (Figura 4A,B). Interpolare la corteccia periostale sagomata per creare un'etichetta ossea corticale come delineato per il callo nel passaggio 4.1.3 (Figura 4C,D).
   5. Calcolare il volume sagomato e il valore medio del grigio del callo come segue: fare clic sulla scheda Segmentazione nella riga superiore dello schermo e selezionare Statistiche materiale dal menu a discesa. In questo modo verrà generata una tabella contenente tutti i valori calcolati. I valori dell'osso corticale e del callo (dopo aver sottratto l'osso corticale) sono forniti separatamente. Una volta generata la tabella, fare clic su Esporta in Workspace per salvare i dati.
2. Conversione delle unità in scala di grigi in densità minerale ossea
   1. Ritagliate l'immagine 3D del fantoccio HA da 4,5 mm (Figura 2B) dall'intera immagine e fate clic su Segmentazione (Segmentation). La resina del fantoccio di HA contiene cinque piccoli cilindri di HA (Figura 1A). Per il cilindro HA con la densità più elevata, definire la prima e l'ultima fetta mediante ispezione visiva.
   2. Disegnate due cerchi in corrispondenza della prima e dell'ultima sezione (evitando i bordi) utilizzando lo strumento pennello (Figura 5A) come indicato di seguito: nella finestra MATERIALI, fate clic su Aggiungi quattro volte. Fare clic con il pulsante destro del mouse per rinominare material3, material4, material5 e material6 rispettivamente in phantom1, phantom2, phantom3 e phantom4. Selezionare Phantom1, fare clic sull'icona del pennello nella finestra SELEZIONE e utilizzare il dispositivo di scorrimento per regolare la dimensione del pennello (tracciamento circolare) in base alle dimensioni del nascondiglio (la dimensione del cerchio deve essere inferiore a quella del nascosto).
   3. Applicate l'interpolazione tra i due cerchi per creare un volume per ogni cilindro HA (Figura 5B) come indicato di seguito: nella finestra MATERIALI (MATERIALS), selezionate Phantom1 ( Phantom1), fate clic sulla scheda Selezione (Selection ) nella riga superiore dello schermo e selezionate Interpola (Interpolate) dal menu a discesa. Nella finestra SELEZIONE, fare clic sul segno più.
   4. Ripetere il processo di segmentazione con tre dei cilindri di HA rimanenti, partendo dalla seconda densità di HA più alta e terminando con la seconda densità di HA più bassa (Figura 5B). Il cilindro con la densità HA più bassa può essere escluso perché spesso è difficile da segmentare.
   5. Utilizzare le etichette 3D generate per calcolare i valori medi di grigio dei quattro cilindri HA analizzati. Utilizzando un foglio di calcolo (vedere la tabella dei materiali) o simile, tracciare i valori medi di grigio e i corrispondenti valori di densità minerale ossea (BMD) forniti dal produttore del fantoccio. Generare un'equazione di correlazione tra BMD e i valori di grigio utilizzando la regressione lineare.
3. Segmentazione del callo mineralizzato e calcolo della BMD
   1. Sulla base dell'equazione di correlazione generata nel passaggio 4.2.5 e della soglia scelta che differenzia il callo mineralizzato da quello non mineralizzato, determinare la soglia del valore di grigio corrispondente. Di conseguenza, etichettare l'area del callo con valori di grigio superiori alla soglia come callo mineralizzato ed etichettare il resto come non mineralizzato (Figura 6A,B). In questo studio, 250 mgHA/ccm sono stati utilizzati come soglia per il callo mineralizzato^14,15.
   2. Calcola i volumi totali di callo e callo mineralizzato. Sulla base di questi valori, calcolare la frazione di volume osseo (volume mineralizzato del callo normalizzato al volume totale del callo = BV/TV). Utilizzare il valore medio di grigio misurato per il callo totale per calcolare la BMD del callo utilizzando l'equazione di correlazione generata in 4.2.5.
      NOTA: In base all'obiettivo dello studio e al software utilizzato per l'analisi, è possibile calcolare altri parametri come l'SMI (indice del modello di struttura), lo spessore trabecolare e il grado di anisotropia.

Figura 3: Segmentazione del contorno esterno del callo. (A) Un contorno del contorno esterno del callo (linea rossa). (B) Contorni in corrispondenza delle fette campionate attraverso il VOI (fette rosse). (C) Un'etichetta callosa 3D creata per interpolazione (volume rosso). (D) Una sezione trasversale dell'etichetta del callo mostrata in C (compreso l'osso corticale). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Segmentazione dell'osso corticale. (A) Un contorno della superficie periostale della corteccia (linea verde). (B) Contorni in corrispondenza delle fette campionate attraverso il VOI (fette verdi). (C) Un'etichetta 3D dell'osso corticale (contenente la cavità midollare; verde) e del callo (rosso) creata da etichette interpolate della corteccia periostale e del callo. (D) Una sezione trasversale del callo (rosso) e dell'osso corticale (contenente la cavità intramidollare; verde). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Conversione delle unità in scala di grigi in BMD. (A) Contorni del cilindro HA in corrispondenza della prima e dell'ultima fetta (cerchi rossi). (B) Cilindri HA interpolati 3D (a sinistra) e sezioni trasversali (a destra). Marrone: massima densità di HA; blu: seconda densità di HA più alta; viola: terza densità di HA; verde: quarta densità di HA più alta. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Segmentazione del callo mineralizzato. (A) Il callo mineralizzato (≥250 mgHA/ccm) è mostrato in blu, il resto del callo (<250 mgHA/ccm) è mostrato in rosso e lo spazio corrispondente all'osso originale è mostrato in verde. (B) Una vista 3D di ogni etichetta isolata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Risultati

Per monitorare la formazione ossea durante la guarigione delle fratture, è stata indotta una frattura tibiale aperta diafisaria media in topi maschi adulti C75BL/6J. La frattura è stata stabilizzata utilizzando un chiodo intramidollare, un modello consolidato di guarigione secondaria¹³. I tessuti del callo sono stati raccolti ai giorni 14, 21 e 28 dopo la frattura¹². Questi punti temporali rappresentano diverse fasi della guarigione. La formazione dell'osso endocondrale d...

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Discussione

Lo scopo di questo studio è quello di descrivere un protocollo dettagliato per l'analisi μCT con l'obiettivo di quantificare accuratamente la struttura del callo mineralizzato 3D, che è spesso fondamentale negli studi di guarigione delle ossa e delle fratture. Il protocollo utilizza una piattaforma software di analisi delle immagini 3D all'avanguardia che facilita la visualizzazione delle immagini, la segmentazione/etichettatura e le misurazioni che vanno dal semplice al complesso.

L'attivi...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutral buffered formalin	Fisher chemical	SF100-20	Used for bone tissue fixation
Avizo	Thermo Scientific		Image processing and analysis software
Hydroxyapatite phantom	Micro-CT HA D4.5, QRM	QRM-70128
Image Processing Language	Scanco		Used to convert raw images to DICOM images
Micro-Mosquito Straight Hemostatic Forceps	Medline		Used to remove the intramedullary pin
Microsoft Excel	Microsoft		Spreadsheet software
Scanco mCT system (vivaCT 40)	Scanco		Used for µCT imaging