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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Una nanoparticella peptide-poloxamina autoassemblata (PP-sNp) viene sviluppata utilizzando un dispositivo di miscelazione microfluidica per incapsulare e fornire RNA messaggero trascritto in vitro . L'mRNA/PP-sNp descritto potrebbe trasfettare efficacemente le cellule in coltura in vitro.

Abstract

I vaccini a RNA messaggero trascritto in vitro (mRNA) hanno mostrato un enorme potenziale nella lotta contro la pandemia di coronavirus 2019 (COVID-19). Sistemi di somministrazione efficienti e sicuri devono essere inclusi nei vaccini mRNA a causa delle fragili proprietà dell'mRNA. Un sistema di rilascio genico autoassemblato di nanoparticelle peptide-poloxamina (PP-sNp) è specificamente progettato per la consegna polmonare di acidi nucleici e mostra capacità promettenti nel mediare la trasfezione di mRNA di successo. Qui, viene descritto un metodo migliorato per preparare PP-sNp per elaborare come il PP-sNp incapsula l'mRNA della Metridia luciferasi (MetLuc) e trasfetta con successo le cellule in coltura. L'mRNA MetLuc è ottenuto mediante un processo di trascrizione in vitro da un modello lineare di DNA. Un PP-sNp viene prodotto mescolando peptide sintetico / poloxamina con soluzione di mRNA utilizzando un miscelatore microfluidico, consentendo l'auto-assemblaggio di PP-sNp. La carica di PP-sNp viene successivamente valutata misurando il potenziale zeta. Nel frattempo, la polidispersità e la dimensione idrodinamica delle nanoparticelle di PP-sNp vengono misurate utilizzando la diffusione dinamica della luce. Le nanoparticelle di mRNA/PP-sNp vengono trasfettate in cellule in coltura e i surnatanti della coltura cellulare vengono analizzati per l'attività della luciferasi. I risultati rappresentativi dimostrano la loro capacità di trasfezione in vitro. Questo protocollo potrebbe far luce sullo sviluppo di sistemi di rilascio del vaccino mRNA di prossima generazione.

Introduzione

La vaccinazione è stata annunciata come uno degli interventi medici più efficaci per ridurre la morbilità e la mortalità causate da malattie infettive1. L'importanza dei vaccini è stata dimostrata dallo scoppio della malattia da coronavirus 2019 (COVID-19). A differenza del concetto tradizionale di iniezione di agenti patogeni inattivati o vivi attenuati, gli approcci vaccinali all'avanguardia, come i vaccini a base di acidi nucleici, si concentrano sulla conservazione delle proprietà immunostimolatorie dei patogeni bersaglio, evitando i potenziali problemi di sicurezza associati ai vaccini convenzionali a base di virus interi o batteri. Sia i vaccini basati sul DNA che sull'RNA (cioè l'RNA messaggero trascritto in vitro, l'mRNA IVT) mostrano un potenziale profilattico terapeutico contro una varietà di malattie, comprese le malattie infettive e i tumori 2,3. In linea di principio, il potenziale dei vaccini a base di acidi nucleici si riferisce alla loro produzione, efficacia e sicurezza4. Questi vaccini possono essere prodotti in modo privo di cellule per consentire una produzione economica, scalabile e rapida.

Un singolo vaccino a base di acido nucleico può codificare più antigeni, consentendo il bersaglio di numerose varianti virali o batteri con un numero ridotto di inoculazioni e rafforzando la risposta immunitaria contro i patogeni resilienti 5,6. Inoltre, i vaccini a base di acidi nucleici potrebbero imitare il naturale processo di invasione del virus o dell'infezione batterica, portando risposte immunitarie mediate da cellule B e cellule T. A differenza di alcuni vaccini basati su virus o DNA, i vaccini basati su mRNA IVT offrono un enorme vantaggio in termini di sicurezza. Possono esprimere rapidamente l'antigene desiderato nel citosol e non sono integrati nel genoma ospite, ovviando alle preoccupazioni sulla mutagenesi inserzionale7. IVT-mRNA viene automaticamente degradato dopo una traduzione riuscita, quindi la sua cinetica di espressione proteica può essere facilmente controllata 8,9. Catalizzata dalla pandemia di sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2), gli sforzi di aziende / istituzioni di tutto il mondo hanno permesso il rilascio sul mercato di molti tipi di vaccini. La tecnologia dei vaccini basati su mRNA IVT mostra un grande potenziale e, per la prima volta, ha dimostrato il successo precedentemente previsto, grazie alla sua rapida progettazione e alla capacità flessibile di adattarsi a qualsiasi antigene bersaglio entro diversi mesi. Il successo dei vaccini mRNA IVT contro COVID-19 nelle applicazioni cliniche non solo ha aperto una nuova era di ricerca e sviluppo del vaccino mRNA IVT, ma ha anche accumulato una preziosa esperienza per il rapido sviluppo di vaccini efficaci per affrontare epidemie di malattie infettive10,11.

Nonostante il potenziale promettente dei vaccini mRNA IVT, l'efficiente consegna intracellulare di mRNA IVT al sito d'azione (cioè citoplasma) continua a rappresentare un ostacolo importante12, specialmente per quelli somministrati attraverso le vie aeree4. L'mRNA IVT è intrinsecamente una molecola instabile con un'emivita estremamente breve (~7 h)13, che rende l'mRNA IVT altamente incline alla degradazione da parte dell'ubiquitaria RNasi14. I linfociti del sistema immunitario innato tendono a fagocitare l'mRNA IVT riconosciuto nei casi di applicazione in vivo . Inoltre, l'elevata densità di carica negativa e il grande peso molecolare (1 x 104-1 x 106 Da) dell'mRNA IVT compromettono la sua permeazione efficace attraverso il doppio strato lipidico anionico delle membrane cellulari15. Pertanto, è necessario un sistema di rilascio con determinati materiali biofunzionali per inibire la degradazione delle molecole di mRNA IVT e facilitare l'assorbimento cellulare16.

A parte alcuni casi eccezionali in cui l'mRNA IVT nudo è stato utilizzato direttamente per indagini in vivo, vari sistemi di rilascio sono utilizzati per trasportare l'mRNA IVT al sito terapeutico di azione17,18. Studi precedenti hanno rivelato che solo pochi mRNA IVT sono rilevati nel citosol senza l'assistenza di un sistema di consegna19. Sono state sviluppate numerose strategie per migliorare il rilascio dell'RNA con continui sforzi sul campo, che vanno dalla condensazione della protamina all'incapsulamento lipidico20. Le nanoparticelle lipidiche (LNP) sono le più clinicamente avanzate tra i veicoli di rilascio di mRNA, come dimostrato dal fatto che tutti i vaccini mRNA COVID-19 approvati per uso clinico impiegano sistemi di rilascio basati su LNP21. Tuttavia, le LNP non possono mediare un'efficace trasfezione di mRNA quando le formulazioni vengono somministrate attraverso la via respiratoria22, il che limita notevolmente l'applicazione di queste formulazioni nell'indurre risposte immunitarie della mucosa o nell'affrontare malattie polmonari come la fibrosi cistica o il deficit di α1-antitripsina. Pertanto, è necessario sviluppare un nuovo sistema di consegna per facilitare la consegna efficiente e la trasfezione dell'mRNA IVT nelle cellule correlate alle vie aeree per risolvere questo bisogno insoddisfatto.

È stato confermato che il sistema di rilascio di nanoparticelle autoassemblate peptide-poloxamina (PP-sNp) può mediare l'efficiente trasfezione degli acidi nucleici nel tratto respiratorio dei topi23. Il PP-sNp adotta un approccio di progettazione modulare multifunzionale, che può integrare diversi moduli funzionali nelle nanoparticelle per uno screening e un'ottimizzazione rapidi23. I peptidi sintetici e i copolimeri a blocchi anfifilici elettricamente neutri (poloxamina) all'interno del PP-sNp possono interagire spontaneamente con l'mRNA IVT per generare nanoparticelle uniformemente distribuite con una struttura compatta e una superficie liscia23. PP-sNp può migliorare l'effetto di trasfezione genica delle molecole di mRNA IVT nelle cellule in coltura e nel tratto respiratorio dei topi23. Il presente studio descrive un protocollo per la generazione di PP-sNp contenente mRNA IVT che codifica per Metridia luciferasi (MetLuc-mRNA) (Figura 1). In questo protocollo viene utilizzata una miscelazione controllata e rapida tramite un dispositivo di miscelazione microfluidica, che impiega il design di miscelazione a spina di pesce sfalsata. La procedura è facile da eseguire e consente la generazione di PP-sNp con dimensioni più uniformi. L'obiettivo generale della produzione di PP-sNp utilizzando il miscelatore microfluidico è quello di creare PP-sNp per la complessazione dell'mRNA in modo ben controllato, consentendo così una trasfezione cellulare efficiente e riproducibile in vitro. Il presente protocollo descrive la preparazione, l'assemblaggio e la caratterizzazione di PP-sNp contenente MetLuc-mRNA.

Protocollo

1. Trascrizione in vitro di mRNA chimicamente modificato

NOTA: È necessario utilizzare tubi privi di nucleasi, reagenti, vetreria, punte per pipette, ecc., perché le RNasi sono onnipresenti nell'ambiente, come soluzioni di laboratorio, superfici di strumenti, capelli, pelle, polvere, ecc. Pulire accuratamente le superfici del banco e le pipette prima dell'uso e indossare guanti per evitare la contaminazione da RNasi.

  1. Eseguire la linearizzazione del modello di DNA.
    1. Sintetizzare il frame di lettura aperto (ORF) di Metridia luciferasi (MetLuc) affiancato da un promotore della polimerasi T7, 5' regione non tradotta (UTR), 3'UTR e code di poli (A) e clonarlo nel vettore PUC57, che è espresso nei batteri (vedi Tabella dei materiali).
      NOTA: la sequenza di codifica del modello di DNA è fornita nel file supplementare 1.
    2. Coltura batterica, lisare i batteri e purificare il DNA plasmidico mediante la colonna corrispondente (vedere il kit di estrazione del DNA plasmidico nella Tabella dei materiali).
    3. Eseguire una singola reazione da 50 μL che contenga 2 μL di BamHI, 2 μL di KpnI (vedi Tabella dei materiali) e 2 μg di DNA plasmidico a 37 °C per 1 ora e ottenere la linearizzazione del modello di DNA.
  2. Eseguire la trascrizione in vitro per generare mRNA IVT senza cappuccio.
    1. Eseguire la sintesi dell'mRNA mediante una singola reazione da 20 μL utilizzando un kit di trascrizione T7 e pseudouridina (vedere Tabella dei materiali): 10 μL (0,8-1 μg) di modello di DNA linearizzato, 1,5 μL (150 mM) di ATP, pseudo-UTP, GTP e CTP, 2 μL di tampone di trascrizione 10x, 1 μL di enzima T7 e 1 μL di acqua priva di nucleasi (NF-water). Mescolare accuratamente i suddetti componenti e incubare a 37 °C per 3 ore.
  3. Rimuovere il modello DNA.
    1. Aggiungere 1 μL (1 U) di DNasi (senza RNasi) dopo il processo di trascrizione e incubare a 37 °C per 15 minuti.
  4. Eseguire la purificazione dell'mRNA IVT senza cappuccio utilizzando la precipitazione del cloruro di litio.
    1. Purificare l'mRNA IVT senza cappuccio usando cloruro di litio (vedi Tabella dei materiali) con una concentrazione operativa di 10 mM. Aggiungere 50 μL di cloruro di litio 10 mM a 20 μL di soluzione di mRNA IVT senza cappuccio.
    2. Mescolare accuratamente l'intero volume e raffreddare a -20 °C per 1 ora. Raccogliere l'mRNA IVT senza cappuccio per 12 minuti a 12.000 x g, che produce abitualmente 80-120 μg di mRNA IVT senza cappuccio da ogni singola reazione di 20 μL.
  5. Eseguire il capping dell'mRNA IVT.
    1. Eseguire il capping dell'mRNA IVT utilizzando il sistema di tappatura cap 1 (vedere Tabella dei materiali). In breve, rimuovere la struttura secondaria di 50 μg di mRNA IVT senza cappuccio riscaldando a 65 °C per 10 minuti, quindi collegare l'estremità 5' dell'mRNA IVT senza cappuccio con il cappuccio 1, che viene preparato modificando la struttura del tappo m7G utilizzando 2,5 μL di s-adenosilmetionina (SAM) (20 mM) e 4 μL di 2'-O-metiltransferasi (100 U) in una reazione di 100 μL a 37 °C per 30-60 minuti.
    2. Purificare 100 μL dell'mRNA IVT rivestito utilizzando 250 μL di cloruro di litio 10 mM e diluire in 50 μL di acqua NF.
  6. Determinare la purezza e la dimensione molecolare dell'mRNA IVT con cappuccio.
    1. Misurare la concentrazione di mRNA IVT con cappuccio con uno spettrofotometro UV-visibile. Utilizzando un marcatore di RNA (vedi Tabella dei materiali), analizzare la dimensione molecolare dell'mRNA IVT con cappuccio in un gel di agarosio denaturante formaldeide all'1% contenente il 18% di formaldeide (la tensione è 120 V). Assicurarsi che l'mRNA IVT senza cappuccio e l'mRNA IVT con cappuccio siano conservati a -80 °C.
      NOTA: L'mRNA IVT è stato considerato avere una buona purezza in un rapporto A 260/A280 di 1,8-2,1 e un rapporto A260/A230 di 2,0 o leggermente superiore.

2. Generazione di mRNA/PP-sNp IVT

  1. Preparare la soluzione madre di poloxamina 704 (T704) solubilizzando il T704 (vedere la tabella dei materiali) in acqua NF per ottenere una soluzione madre da 10 mg/ml. Conservare la soluzione preparata a 4 °C.
    NOTA: T704 contiene una struttura a forma di X costituita da un gruppo centrale etilendiammina legato a quattro catene di blocchi di poli (ossido di propilene) (PPO) e blocchi di poli (ossido di etilene) (PEO)24. Il peso molecolare (Mw) di T704 è 5500.
  2. Preparare la soluzione madre di peptide sintetico (sPep, vedere Tabella dei materiali) solubilizzando il sPep (sequenza: KETWWETWWTEWWTEWKKKKRRRRRKKKKGACSE
    RSMNFCG) in acqua NF per ottenere una soluzione madre di 2 mg/mL e conservare a 4 °C.
  3. Preparare la soluzione di mRNA IVT scongelando l'mRNA IVT (fase 1) su ghiaccio e centrifugando brevemente per 3 s a 300 x g a temperatura ambiente prima di aprire il tubo. Diluire la soluzione di mRNA IVT a 0,04 μg/μL con acqua NF.
    NOTA: Si raccomanda di lavorare in un armadio di biosicurezza quando possibile con l'mRNA IVT.
  4. Preparare la soluzione di miscela T704 e sPep diluendo la soluzione di sPep a 0,555 μg/μL e la soluzione di T704 a 8 μg/μL con acqua NF. Incubare la soluzione miscelata per 15 minuti a temperatura ambiente prima di un ulteriore utilizzo.
    NOTA: calcolare il componente sPep richiesto in base al rapporto N/P desiderato. Il rapporto N/P è il numero totale di residui di azoto (N) all'interno dello sPep rispetto al numero totale di gruppi fosfato (P) caricati negativamente all'interno dell'mRNA IVT. Calcolare il T704 richiesto in base al rapporto peso/peso (w/w) tra T704 e mRNA IVT. È necessario che il rapporto N/P sia 5 e il rapporto w/w sia 100.
  5. Preparare la formulazione di mRNA/PP-sNp IVT seguendo i passaggi seguenti.
    1. Aspirare la soluzione di mRNA IVT (fase 3) in una siringa da 1 ml, assicurandosi che non vi siano vuoti d'aria o bolle nella punta della siringa. Caricare la siringa in un lato della cartuccia accanto al blocco rotante.
    2. Riempire una siringa da 1 mL con la soluzione di miscela T704 e sPep (fase 4). Rimuovere eventuali bolle o vuoti d'aria sulla punta della siringa e inserire la siringa nell'altro ingresso della pompa (vedere la tabella dei materiali).
    3. Impostare la pompa con un rapporto di flusso di 1:1 e una portata totale di 4-10 ml/min.
      NOTA: Una portata totale di 6 ml/min è ottimale negli studi qui presentati.
    4. Posizionare un tubo conico privo di RNasi da 10 mL (vedere Tabella dei materiali) per raccogliere la soluzione mista IVT-mRNA/PP-sNp alla fine del percorso di flusso del dispositivo di miscelazione.
    5. Far funzionare la pompa per avviare la miscelazione, assicurandosi che i parametri siano inseriti correttamente. Dopo che la pompa ha finito di funzionare per 6 s, raccogliere il campione IVT-mRNA/PP-sNp dal tubo conico.
      NOTA: PP-sNp sono stati generati utilizzando un miscelatore microfluidico (Figura supplementare 1). Il dispositivo comprende una pompa a flusso costante, un dispositivo di collegamento, un chip e un dispositivo fisso. Nel processo di miscelazione, la pompa a flusso costante collegata al chip fornisce liquido al chip in base alla portata preimpostata. La pompa a flusso costante collegata può essere collegata a più canali di ingresso del chip con un singolo canale di uscita. I componenti del dispositivo, incluso il chip, sono stati ottenuti da fonti commerciali e assemblati razionalmente (vedi Tabella dei materiali). I parametri, come la portata e il volume della soluzione di mRNA IVT e della soluzione mista T704-sPep, possono differire da quelli visualizzati nel protocollo corrente se viene utilizzata una configurazione diversa e devono essere ottimizzati di conseguenza.

3. Misura del diametro idrodinamico e della polidispersione di IVT-mRNA/PP-sNp

  1. Diluire un'aliquota della soluzione di mRNA/PP-sNp IVT (fase 2) con acqua NF per ottenere un volume finale di 1 ml.
  2. Misurare la dimensione idrodinamica e l'indice di polidispersione (PDI) utilizzando una cuvetta semi-micro25. Aggiungere la soluzione di mRNA/PP-sNp IVT nella cuvetta e inserirla nel misuratore di dimensioni delle particelle (vedere Tabella dei materiali). Impostare una procedura operativa standard e cliccare su Start per iniziare l'acquisizione dei dati.

4. Preparazione delle cellule per la trasfezione

  1. Placcare cellule epiteliali bronchiali umane (16HBE) e una linea cellulare dendritica (DC2.4) in piastre a 96 pozzetti ad una densità di 3,5 x 104 cellule/pozzetto 24 ore prima della trasfezione. Coltivare le cellule in un terreno di coltura integrato con il 10% di siero fetale bovino inattivato dal calore e l'1% di penicillina / streptomicina.
    NOTA: Le celle sono state ottenute da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).
  2. Incubare le cellule in un incubatore (37 °C e 5% di CO2 atmosfera) per 24 ore per garantire che le cellule siano confluenti al 60%-80% prima della trasfezione.

5. Trasfezione delle cellule in coltura

  1. Dopo aver rimosso il terreno di coltura, lavare le cellule placcate con 0,2 ml / pozzetto 1x PBS.
  2. Aggiungere 170 μL di terreno di coltura privo di siero a ciascun pozzetto contenente le colture cellulari placcate.
  3. Aggiungere la formulazione IVT mRNA/PP-sNp contenente 0,4 μg di mRNA MetLuc (preparato al punto 2) goccia a goccia con una quantità di 30 μL/pozzetto.
  4. Incubare le cellule con la formulazione IVT mRNA/PP-sNp a 37 °C in atmosfera umidificata arricchita con CO2 al 5% per 4 ore.
  5. Sostituire il terreno di trasfezione con 0,2 ml di terreno di coltura fresco integrato con il 10% di siero fetale bovino inattivato dal calore e l'1% (v/v) di penicillina/streptomicina.
    NOTA: Il siero fetale bovino è stato riscaldato a 56 °C per 30 minuti per l'inattivazione.
  6. Incubare le cellule trasfettate a 37 °C e in atmosfera arricchita di CO2 al 5% per 24 ore e raccogliere i surnatanti da rilevare da ciascun pozzetto.

6. Analisi dell'efficacia della trasfezione cellulare mediante saggio Metridia luciferasi (MetLuc)

  1. Analizzare il surnatante da ciascun pozzetto per l'attività di MetLuc utilizzando il substrato di celenterazina (vedere la tabella dei materiali) seguendo i passaggi seguenti.
    1. Preparare una nuova soluzione di analisi aggiungendo 1x PBS al substrato di celenterazina (la concentrazione di celenteraszina è di 15 mM).
    2. Vortex la soluzione di celenterazina per 10 s per una miscelazione accurata.
    3. Aggiungere 50 μL di surnatante (raccolto al punto 5) in una piastra da 96 pozzetti.
    4. Impostare il lettore di micropiastre (vedere Tabella dei materiali) con un tempo di lettura di 1.000 ms prima di aggiungere 30 μL di soluzione di celenterazina (15 mM) a ciascun pozzetto manualmente o mediante iniezione automatica.
    5. Fare clic su Start per misurare il segnale di luminescenza immediatamente dopo aver aggiunto la soluzione di celenterazina al surnatante.
      NOTA: Il segnale di luminescenza viene misurato utilizzando un lettore di micropiastre e la sua attività è espressa in unità di luce relative. I valori ottenuti dai pozzi trasfettati PBS saranno utilizzati come controlli in bianco.

Risultati

Il plasmide ricombinante è stato digerito per produrre il modello di DNA linearizzato (Figura 2A). Utilizzando il protocollo descritto, il kit di trascrizione in vitro T7 può produrre fino a 80-120 μg di MetLuc-mRNA senza cappuccio per reazione di 20 μL e 50-60 μg di MetLuc-mRNA limitato per 100 μL di reazione. Quando analizzato con elettroforesi, l'mRNA MetLuc intatto con alta qualità dovrebbe mostrare una banda singola e chiara, come mostrato in Figura ...

Discussione

Il protocollo qui descritto non solo consente la produzione economica e rapida di formulazioni di vaccini mRNA IVT con proprietà definite, ma offre anche la possibilità di personalizzare la formulazione PP-sNp in base a specifici scopi terapeutici, come la terapia genica. Al fine di garantire il successo della generazione di mRNA / PP-sNp IVT, si suggerisce di prestare particolare attenzione ad alcuni passaggi critici. Quando si lavora con l'mRNA, ricordare sempre che le condizioni libere da RNasi devono essere mantenu...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (NSFC, Grant No. 82041045 and 82173764), dal grande progetto di Study on Pathogenesis and Epidemic Prevention Technology System (2021YFC2302500) del Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina, dal Chongqing Talents: Exceptional Young Talents Project (CQYC202005027) e dalla Natural Science Foundation di Chongqing (cstc2021jcyj-msxmX0136). Gli autori sono grati al Dr. Xiaoyan Ding per aver misurato il diametro idrodinamico (nm) e l'indice di polidispersità (PDI).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
BamHITakara1010
cap 1 capping systemJinanM082
Dendritic cell-lineSigmaSCC142
DNA sequenceGenescript
Human bronchial epithelial cellsSigmaSCC150
KpnITakara1068
LPBeyotimeC0533
Lithium chlorideAPEXBioB6083
Malvern Zetasizer Nano ZS90MalvernNB007605
Microfluidic chipZHONGXINQIHENGStandard PDMS chip
Microplate readersThermoFisherVarioskan lux
NanoDrop OneThermoFisherND-ONE-W (A30221)
Nuclease-free waterThermoFisherAM9932
OptiMEMGibco31985070
Penicillin-streptomycinGibco15140122
PseudouridineAPE×BioB7972
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106
Quanti-LucInvivoGenRep-qlc2
RiboRuler High Range RNA LadderThermoFisherSM1821
RNase-free conical tubeBiosharpBS-100-M
RPMI Medium 1640ThermoFisherC11875500BT
Syringe pumpChemyxFusion 101
T7 transcription KitJinanE131

Riferimenti

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