Estrazione, etichettatura e purificazione di cellule specifiche del lignaggio da follicoli antrali umani

Riepilogo

Qui presentiamo protocolli per l'identificazione e la purificazione delle cellule ovariche dai follicoli antrali. Elaboriamo i metodi per l'elaborazione di ovaie intere per la crioconservazione di strisce corticali e allo stesso tempo raccogliamo follicoli antrali intatti che vengono trattati enzimaticamente per liberare più tipi di cellule residenti nel follicolo, tra cui granulosa, teca, endoteliale, ematopoietica e cellule stromali.

Abstract

L'attivazione, la crescita, lo sviluppo e la maturazione degli ovociti è un processo complesso che è coordinato non solo tra più tipi di cellule dell'ovaio, ma anche attraverso più punti di controllo all'interno del circuito ipotalamo / ipofisi / ovarico. All'interno dell'ovaio, più tipi di cellule specializzate crescono in stretta associazione con l'ovocita all'interno dei follicoli ovarici. La biologia di queste cellule è stata ben descritta nelle fasi successive, quando sono facilmente recuperate come sottoprodotti dei trattamenti di riproduzione assistita. Tuttavia, l'analisi approfondita di piccoli follicoli antrali isolati direttamente dall'ovaio non viene comunemente effettuata a causa della scarsità di tessuto ovarico umano e del limitato accesso all'ovaio nelle pazienti sottoposte a trattamenti di riproduzione assistita.

Questi metodi per il trattamento di ovaie intere per la crioconservazione di strisce corticali con la concomitante identificazione/isolamento delle cellule residenti nell'ovaio consentono l'analisi ad alta risoluzione delle prime fasi dello sviluppo del follicolo antrale. Dimostriamo protocolli per isolare tipi di cellule discrete trattando enzimaticamente i follicoli antrali e separando le cellule granulosa, teca, endoteliale, ematopoietica e stromale. L'isolamento delle cellule dai follicoli antrali a varie dimensioni e fasi di sviluppo consente l'analisi completa dei meccanismi cellulari e molecolari che guidano la crescita del follicolo e la fisiologia ovarica e fornisce una fonte di cellule vitali che possono essere coltivate in vitro per ricapitolare il microambiente follicolare.

Introduzione

Gli elementi funzionali primari dell'ovaio umano sono i follicoli, che governano la crescita e lo sviluppo degli ovociti. I protocolli per l'isolamento delle cellule follicolari sono stati ben stabiliti nel contesto della fecondazione in vitro , ma questi sono appropriati solo per la raccolta di cellule da follicoli luteinizzati nel punto di prelievo ovocitario¹. Abbiamo sviluppato un protocollo che consente l'isolamento di popolazioni cellulari discrete da follicoli antrali in diversi stadi di sviluppo che derivano da ovaie native o tessuto ovarico xenotrapiantato². Sebbene vi sia consenso sul fatto che i contributi delle cellule residenti nel follicolo alla coltivazione dell'ovocita siano molto importanti, pochi studi hanno identificato ed estratto prospetticamente i sottotipi fenotipici unici presenti nei follicoli dello stadio antrale. Una comprensione più profonda della gerarchia di differenziazione e della trasduzione del segnale tra cellule specializzate durante le diverse fasi di sviluppo potrebbe ampliare la nostra comprensione della fisiologia ovarica in condizioni omeostatiche e patologiche. Inoltre, la discriminazione dei sottotipi cellulari discreti e i loro contributi molecolari alla crescita/maturazione del follicolo possono fornire un mezzo per generare surrogati ex vivo che ricostruiscono la funzione ovarica per favorire la maturazione degli ovociti e/o trattare la disfunzione endocrina.

Ogni tipo di cellula unica all'interno dell'ovaio contribuisce alla complessa funzione del follicolo, che funziona efficacemente come un mini-organo discreto per favorire la crescita e la maturazione dell'ovocita che contiene. L'ovocita, il fulcro del follicolo, è direttamente avvolto da uno strato continuo di cellule della granulosa (GC), con le cellule della teca (TC) che formano uno strato secondario di cellule che si combinano con l'ovocita e i GC per comporre l'unità follicolare. Sebbene classificati in due gruppi, GC e TC contengono numerosi sottotipi. I GC sono classificati in base alla loro posizione all'interno del follicolo; I GC che circondano l'ovocita rispetto a quelli adiacenti alla membrana basale sono designati rispettivamente come GC oophorous e murali e questi sottotipi mostrano firme trascrittomiche uniche. I TC hanno numerosi sottotipi che funzionano per fornire supporto steroidogenico, metabolico e strutturale. Le cellule endoteliali, perivascolari e immunitarie svolgono un ruolo centrale nel mantenimento della normale fisiologia ovarica. Lo stroma ovarico serve non solo come substrato per la crescita del follicolo, ma probabilmente fornisce anche una fonte di progenitori che danno origine ai TC. Questo complesso multistrato di sottotipi cellulari all'interno dell'ovaio è ciò che consente la sua funzione sia come organo endocrino che riproduttivo.

Questo articolo presenta un protocollo per l'identificazione e la purificazione di cellule granulosa, teca, stromale, endoteliali ed ematopoietiche dai follicoli antrali. Abbiamo utilizzato questo protocollo per isolare queste cellule ovariche e analizzarle utilizzando il sequenziamento a singola cellula, seguito da colorazioni specifiche nei follicoli di diversi stadi di sviluppo. Il protocollo fornisce una metodologia semplice che è replicabile e consentirà l'analisi ad alta risoluzione sia della fisiologia che della patologia dell'ovaio.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono i topi sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso Weill Cornell Medicine. Tutti gli esperimenti di xenotrapianto, utilizzando tessuto ovarico, sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti. Entrambe le ovaie sono state isolate da un donatore di organi cerebralmente morto di 14 anni senza storia di radio / chemioterapia e nessuna storia documentata di condizioni endocrine o riproduttive. Il comitato di revisione istituzionale (IRB) della Weill Cornell Medicine ha approvato la raccolta di tessuti e l'approvazione da parte della famiglia del donatore di organi è stata ottenuta a seguito del consenso informato sull'uso del tessuto.

1. Raccolta e manipolazione del tessuto ovarico

1. Raccogliere le ovaie intere e il tessuto associato e risciacquare in soluzione salina sterile.
2. Usando una pinzetta sterile, posizionare le ovaie in un contenitore sterile. Versare una soluzione fredda sterile, tamponata e tamponata (ad esempio, terreno L-15 di Leibovitz) nel contenitore. Assicurarsi che il tessuto sia completamente coperto con il liquido.
3. Chiudere il contenitore e sacchettarlo due volte con sacchetti di plastica sterili. Trasportare il contenitore sul ghiaccio all'interno di una scatola isolata (ad esempio, polistirolo). Trasferire i campioni al laboratorio che elaborerà le ovaie il prima possibile, preferibilmente in un tempo non superiore a 5 h ^3,4.

2. Elaborazione del tessuto ovarico

NOTA: Assicurarsi che tutti i reagenti e gli strumenti siano preparati prima che il tessuto arrivi in laboratorio per ridurre il più possibile l'intervallo ischemico. I tamponi possono essere preparati fino a 1 settimana prima del congelamento e refrigerati fino all'uso.

1. Preparazioni per la lavorazione ovarica e il congelamento
   1. Impostare strumenti chirurgici sterilizzati nell'armadio di biosicurezza in preparazione per la lavorazione dei tessuti: un bisturi numero 21; un bisturi numero 11; forbici curve sottili e affilate; una pinza lunga (~ 150 mm di lunghezza); e due pinze medie (~ 110 mm di lunghezza).
   2. Preparare 100 ml di terreno di trattamento tissutale (vedere la tabella dei materiali): terreno L-15 di Leibovitz contenente soluzione antibiotico-antimicotica e filtrato utilizzando un filtro da 0,2 μm. Mantenere il mezzo refrigerato.
   3. Etichettare i crioviali, aggiungere 1,5 mL di soluzione congelante (vedere la Tabella dei materiali) a ciascun flaconcino e conservarlo a 4 °C.
   4. Avere a disposizione una piastra a 6 pozzetti a portata di mano per l'uso.
2. All'arrivo del tessuto
   1. Spruzzare il contenitore con una soluzione di etanolo al 70%, pulire accuratamente e posizionarlo all'interno dell'armadio di biosicurezza.
   2. Indossando guanti sterili, aprire il contenitore. Porre l'ovaia in una capsula di Petri sterile e versare un mezzo refrigerato (dal punto 2.1.2) per idratare il tessuto. Assicurarsi che l'ovaio sia semi-immerso nel mezzo.
   3. Rimuovere eventuali punti di sutura o altro materiale e sezionare il tessuto circostante residuo lontano dall'ovaio.

3. Isolamento dei follicoli antrali

1. Identificare i singoli follicoli per l'isolamento. Nella scelta dei follicoli sani, escludere eventuali follicoli pieni di sangue, scuri o non simmetrici, poiché è probabile che siano atretici.
2. Isolare i follicoli antrali scelti da tutto l'ovaio usando bisturi, mantenendo intatto l'antro asportando il tessuto corticale che comprende il follicolo.
3. Posizionare ciascun follicolo antrale intatto asportato in un pozzetto della piastra a 6 pozzetti. Se necessario per scopi descrittivi, utilizzare un righello posto sotto il piatto per determinare il diametro del follicolo.
4. Usando un bisturi, taglia in due il follicolo antrale intatto per accedere alla cavità antrale e aggiungi 4 ml di mezzo di distacco enzimatico delle cellule. Incubare la piastra in un incubatore umidificato al 5% di CO₂ e 37 °C per 10 minuti.
5. Ripetere l'estrazione di ulteriori follicoli antrali, se necessario.

4. Isolamento delle cellule residenti del follicolo

1. Dopo l'incubazione, aggiungere 4 ml di terreno disponibile contenente il 20% di FBS e lavare mediante pipettaggio ripetuto e vigoroso del mezzo sui follicoli bisecati con una micropipetta P1.000.
2. Raccogliere il mezzo e passarlo attraverso un filtro da 100 μm.
3. Centrifugare il surnatante filtrato a 300 × g e 4 °C per 3 min. Aspirare il surnatante e riservare il pellet cellulare (arricchito con GC) sul ghiaccio per l'etichettatura e la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS).
4. Porre il tessuto rimanente in una miscela di collagenasi (100 U/mL) e dispasi (1 U/mL) diluita in una soluzione salina bilanciata (ad esempio, Hanks) e incubare per 30 minuti al 5% di CO₂ e 37 °C, interrompendo meccanicamente il tessuto mediante triturazione e pipettaggio vigoroso (cioè 10-15 passaggi attraverso la punta del pipet) due volte dopo 10 minuti e 20 minuti.
5. Recuperare i fluidi contenenti il tessuto, lavare tramite pipettaggio attraverso una punta di micropipetta P1.000 e filtrare attraverso un filtro da 100 μm.
6. Centrifugare a 300 × g e 4 °C per 3 min. Aspirare il surnatante e mettere da parte il pellet cellulare (arricchito con TC e cellule di stroma) sul ghiaccio per l'etichettatura e FACS.

5. Selezione cellulare attivata dalla fluorescenza

1. Risospendere i pellet cellulari in soluzione bloccante (PBS + 0,1% FBS) e incubare per 10 minuti a 4 °C.
2. Centrifugare a 300 × g e 4 °C per 3 minuti e aspirare il surnatante.
3. Risospendere i pellet cellulari in soluzione bloccante contenente anticorpi direttamente coniugati (vedere Tabella 1 per le combinazioni di anticorpi appropriate per identificare GC e TC) e incubare su ghiaccio per 10 minuti.
4. Lavare e centrifugare le celle a 300 × g e 4 °C per 3 min. Risospendere le cellule in tampone FACS contenente 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) ed eseguire la sospensione cellulare attraverso uno strumento FACS per catturare una piccola popolazione di cellule (500-1.000) utilizzando l'intensità di fluorescenza degli anticorpi coniugati con fluorofori per il gating.
5. Per l'identificazione di sottopopolazioni uniche, utilizzare le seguenti strategie di gating:
   1. Per la purificazione dei GC, disegnare un cancello attorno alle cellule CD45+ (Figura 1B) ed escludere questa popolazione dalla popolazione CD99⁺ (Figura 1A e Figura 1C); quindi, suddividere ulteriormente la frazione CD99+ rimanente in frazioni PVRL^+/- (Figura 1A e Figura 1C).
   2. Per la purificazione di TC e stroma, eliminare la popolazione totale ENG+ (Figura 1A) o CD55+ (Figura 1D) per escludere la frazione endoteliale CD34+ (Figura 1E) e distinguere le cellule steroidogeniche (ANPEP⁺) e non steroidogeniche (^ANPEP-). Fare attenzione a compensare il sanguinamento tra i fluorofori che sono vicini negli spettri di emissione.
6. Per convalidare la purezza della frazione cellulare ordinata, eseguire il 5% del volume totale acquisito attraverso lo strumento FACS e assicurarsi che le celle popolino le porte previste e siano presenti con una purezza del >95%.

6. Elaborazione del tessuto corticale ovarico

1. Taglia in due il resto dell'ovaio e asporta il midollo usando forbici sottili e bisturi curvi, facendo attenzione a evitare danni alla corteccia ovarica.
2. Continuare a elaborare e assottigliare la corteccia ovarica raschiando delicatamente fino a quando rimane un midollo minimo. Assicurarsi di utilizzare la forza minima necessaria.
   NOTA: Lo spessore del tessuto corticale deve essere compreso tra 1 mm e 1,5 mm.
3. Dividere il tessuto corticale in strisce larghe 2-3 mm lungo la lunghezza dell'ovaio.

7. Congelamento lento del tessuto ovarico

1. Preparazione per il congelamento
   1. Introdurre una striscia corticale in ciascun flaconcino criogenico refrigerato contenente una soluzione congelante.
   2. Agitare i flaconcini criogenici contenenti le strisce corticali su una piastra rotante per 20 minuti a 4 °C.
2. Congelamento lento del tessuto ovarico⁵
   1. Introdurre i crioviali contenenti tessuto ovarico in un congelatore programmabile impostato a partire da 0 °C.
   2. Raffreddare ad una velocità di 2 °C/min fino a -7 °C.
   3. Mantenere i crioviali a questa temperatura per 10 minuti.
   4. Formazione di cristalli di ghiaccio nucleati toccando ogni crioviale con una punta di cotone che è stata brevemente immersa nell'azoto liquido (LN₂).
   5. Raffreddare ad una velocità di 0,3 °C/min fino a quando la temperatura del campione raggiunge -40°C.
   6. Aumentare la velocità di raffreddamento a 10 °C/min fino a quando la temperatura del campione raggiunge -140 °C.
   7. Trasferire i crioviali per la conservazione in LN₂.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Abbiamo isolato i follicoli dalla superficie dell'ovaio e li abbiamo trattati enzimaticamente per isolare i GC e le cellule di teca e stroma che circondano la cavità antrale. Le cellule sono state raccolte e le frazioni cellulari sono state selezionate dai follicoli antrali (diametri compresi tra 0,5 mm e 4 mm) mediante FACS a purezza del >95% (Figura 1).

Per etichettare e purificare frazioni cellulari uniche all'interno dei follicoli antrali umani, abbiamo combi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

Una migliore risoluzione della diversità cellulare all'interno dei follicoli ovarici è clinicamente importante per diversi motivi. Nell'applicare il protocollo di cui sopra all'isolamento dei sottotipi fenotipici unici che risiedono all'interno dei follicoli dello stadio antrale, devono essere considerati diversi fattori. In primo luogo, la salute e la vitalità del tessuto ovarico da cui deriva il follicolo antrale è fondamentale per determinare la qualità delle cellule e il successo delle applicazioni a valle. Ques...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, reagents
Antibiotic-Antimycotic 100x	Thermo Fisher Scientific	15240062	Anti-Anti
Antifade Mountant solution	Thermo Fisher Scientific	P36930	ProLong Gold
Collagenase from Clostridium histolyticum	Millipore Sigma	C 2674
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306
Dispase II, powder	Thermo Fisher Scientific	17105041
DMSO	Millipore Sigma	D 2650	Dimethyl sulfoxide
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14190144
Enzyme Cell Detachment Medium	Thermo Fisher Scientific	00-4555-56	Accutase
Fetal Bovine Serum, heat-inactivated	Thermo Fisher Scientific	10438026
Hanks′ Balanced Salt solution	Thermo Fisher Scientific	14175079	no calcium, no magnesium, no phenol red
Leibovitz’s L-15 medium	Thermo Fisher Scientific	11415064
Normal Saline	Quality Biological	114-055-101
Sucrose	Millipore Sigma	S 1888
Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter)
- 69.64 mL of Leibovitz's L-15
- 17.66 mL of fetal bovine serum
- 3.42 g of sucrose
- 10.65 mL of DMSO
- 1 mL of antibiotic-antimycotic
Lab Plasticware and Supplies
6-well Clear Flat Bottom Not Treated	Corning	351146	Falcon
Cell Strainer 100 µm	Fisher scientific	352360	Corning, Falcon
Cryovials	Thermo Fisher Scientific	377267	CryoTube 1.8 mL
Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm	Millipore Sigma	CLS430599	60EA
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL	Fisher scientific	352235	Corning, Falcon
Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 µm	Corning	431154
Antibodies
ANPEP	BioLegend	301703
CD34	R&D Systems	FAB7227A
CD45	BioLegend	304019
CD55	BioLegend	311306
CD 99	BioLegend	371308
PVRL	BioLegend	340404
Surgical tools
long forceps (~150 mm length)	Fisherbrand	12-000-128	Fisher Scientific
medium forceps (~110 mm length)	Fisherbrand	12-000-157	Fisher Scientific
number 21 scalpel	Andwin Scientific	EF7281H	Fisher Scientific
number 11 scalpel	Andwin Scientific	FH/CX7281A	Fisher Scientific
sharp fine curved scissors	Roboz Surgical	RS-5881
Instruments
FACSJazz Flourescence activated cell sorter	BD
LSM 710 META Confocal microscope	Zeiss