Quantificazione di RNA circolari mediante Digital Droplet PCR

Riepilogo

Questo protocollo descrive il metodo dettagliato della PCR digitale a goccia (dd-PCR) per una quantificazione precisa dei livelli di RNA circolare (circRNA) nelle cellule utilizzando primer divergenti.

Abstract

La reazione a catena della polimerasi a goccia digitale (dd-PCR) è uno dei metodi di quantificazione più sensibili; fraziona la reazione in quasi 20.000 goccioline d'acqua in olio e la PCR si verifica nelle singole goccioline. La dd-PCR presenta diversi vantaggi rispetto alla qPCR convenzionale in tempo reale, tra cui una maggiore precisione nel rilevare bersagli a bassa abbondanza, omettendo geni di riferimento per la quantificazione, eliminando le repliche tecniche per i campioni e mostrando un'elevata resilienza agli inibitori nei campioni. Recentemente, la dd-PCR è diventata uno dei metodi più popolari per quantificare accuratamente il DNA o l'RNA bersaglio per l'analisi e la diagnostica dell'espressione genica. Gli RNA circolari (circRNA) sono una grande famiglia di molecole di RNA recentemente scoperte covalentemente chiuse prive di estremità 5' e 3'. È stato dimostrato che regolano l'espressione genica agendo come spugne per le proteine leganti l'RNA e i microRNA. Inoltre, i circRNA sono secreti nei fluidi corporei e la loro resistenza alle esonucleasi li rende utili come biomarcatori per la diagnosi della malattia. Questo articolo ha lo scopo di mostrare come eseguire la progettazione di primer divergenti, l'estrazione dell'RNA, la sintesi del cDNA e l'analisi dd-PCR per quantificare accuratamente specifici livelli di RNA circolare (circRNA) nelle cellule. In conclusione, dimostriamo la quantificazione precisa dei circRNA utilizzando dd-PCR.

Introduzione

I recenti progressi nelle tecnologie di sequenziamento dell'RNA e nuovi algoritmi computazionali hanno scoperto un nuovo membro della crescente famiglia di RNA non codificanti, chiamato RNA circolare (circRNA)¹. Come suggerisce il nome, i circRNA sono una famiglia di molecole di RNA a singolo filamento senza estremità libere. Sono formati da splicing testa-coda non canonico chiamato back-splicing, in cui il sito accettore di giunzione a monte si unisce covalentemente con il sito donatore di giunzione a valle per formare un cerchio stabile di RNA ^1,2. Questo processo potrebbe essere mediato da diversi fattori, tra cui elementi ripetitivi invertiti di Alu presenti a monte e a valle degli esoni circolarizzati o può essere mediato da alcuni fattori di splicing o proteine leganti l'RNA (RBP)^2,3. Gli RNA circolari generati esclusivamente dalla sequenza esonica o intronica sono classificati come circRNA esonico e RNA intronici circolari o ci-RNA, mentre alcuni circRNA esonici trattengono l'introne e sono chiamati circRNA esone-introne (EIcircRNAs)^3,4. Le funzioni dei circRNA sono molteplici, tra cui la spugnatura di miRNA e/o RBP, la regolazione della trascrizione e la regolazione della funzione cellulare traducendo in peptidi 3,5,6,7. Diversi rapporti hanno evidenziato il significato dei circRNA in varie malattie e processi fisiologici⁸. Inoltre, i modelli di espressione tessuto-specifici e la resistenza alla digestione esonucleasica lo rendono un biomarcatore funzionale per la diagnosi della malattia e può anche essere utilizzato come bersaglio terapeutico adatto⁸. Considerando la sua importanza nella regolazione della salute e delle malattie, la quantificazione accurata dell'espressione del circRNA è la necessità del momento.

Sono stati sviluppati diversi metodi biochimici per quantificare i circRNA in campioni biologici⁹. Uno dei metodi più convenienti e ampiamente accettati per la quantificazione del circRNA è la trascrizione inversa seguita dalla reazione a catena della polimerasi quantitativa (RT-qPCR) utilizzando coppie di primer divergenti¹⁰. Tuttavia, la maggior parte dei circRNA sono in bassa abbondanza rispetto agli mRNA lineari, il che rende difficile quantificarli¹¹. Per superare questo problema, abbiamo cercato di utilizzare la PCR digitale a goccia (dd-PCR) per quantificare accuratamente il numero di circRNA in un determinato campione. La dd-PCR è una tecnologia PCR avanzata che segue il principio della microfluidica; genera più goccioline acquose nell'olio e la PCR si verifica in ogni goccia come reazione individuale¹². La reazione avviene nelle singole goccioline e viene analizzata utilizzando un lettore di goccioline, che fornisce il numero di goccioline positive o negative per il gene di interesse¹². È la tecnica più sensibile per quantificare con precisione un gene di interesse, anche se c'è solo una singola copia in un dato campione. La diminuzione della sensibilità verso gli inibitori, la migliore precisione e l'omissione del gene di riferimento per la quantificazione lo rendono più vantaggioso rispetto alla qPCR convenzionale^13,14,15. È stato ampiamente utilizzato come strumento di ricerca e diagnostica per la quantificazione assoluta di un gene di interesse^16,17. Qui, descriviamo il protocollo dd-PCR dettagliato per la quantificazione del circRNA nella differenziazione dei miotubi C2C12 di topo e dei mioblasti C2C12 di topo proliferanti utilizzando primer divergenti.

Protocollo

L'RNA è sensibile alle RNasi; pertanto, tutti i reagenti, gli strumenti e gli spazi di lavoro devono essere privi di RNasi e maneggiati con cura.

1. Disegno di primer divergente per circRNA (vedi Figura 1)

1. Recuperare la sequenza matura dai dati di annotazione del circRNA utilizzando BEDTools o dal browser del genoma UCSC unendo la sequenza esone/introne presente tra le coordinate di giunzione retrosplicare^18,19.
2. Preparare una sequenza modello PCR di 200 nucleotidi di lunghezza unendo gli ultimi 100 nucleotidi della lunghezza totale della sequenza circRNA ai primi 100 nucleotidi della sequenza circRNA¹⁰.
   NOTA: Se la lunghezza del circRNA è inferiore a 200 nucleotidi, dividerla in due metà uguali e unire i nucleotidi dall'ultima metà all'inizio della prima metà.
3. Utilizzare la sequenza di modelli sopra per la progettazione del primer utilizzando lo strumento web Primer3 e impostando una lunghezza del prodotto PCR compresa tra 120-180 nucleotidi in lunghezza²⁰.
4. Utilizzare le impostazioni predefinite di Primer3 per altri parametri come Tm e lunghezza del primer. Le sequenze di primer per circBnc2 sono elencate nella Tabella 1.
5. Ordina le sequenze di primer divergenti per la sintesi da qualsiasi azienda di oligosintesi.

2. Isolamento dell'RNA

NOTA: Isolare l'RNA totale dalle cellule C2C12 del topo utilizzando qualsiasi kit disponibile in commercio o metodo di isolamento dell'RNA interno. Il metodo interno di isolamento dell'RNA utilizzato qui è stato descritto in precedenza²¹. Le sfere di silice magnetica sono preparate in laboratorio utilizzando il protocollo²² precedentemente pubblicato. Queste sfere magnetiche possono anche essere acquistate da vari fornitori.

1. Prendi un piatto da 10 cm contenente circa 5 x 10⁶ cellule di mioblasti C2C12 proliferanti e un miotubo C2C12 differenziato di 4 giorni per l'isolamento dell'RNA.
2. Lavare le celle con 10 ml di 1x PBS tre volte ed eliminare il PBS utilizzando una pipetta.
3. Raschiare le cellule in 1 mL di 1x PBS usando un raschietto cellulare, centrifugarle a 4 °C per 5 minuti a 750 x g ed eliminare il PBS usando una pipetta.
4. Aggiungere 1 mL di reagente di isolamento dell'RNA (RIR) e lisare le cellule mediante pipettaggio vigoroso²¹.
5. Aggiungere 200 μL (1/5 del volume di RIR) di cloroformio e vortice per 15 s. Centrifugare il tubo a 4 °C per 10 minuti a 12.000 x g.
6. Prelevare 400 μL dello strato acquoso superiore, caricarlo su una colonna di silice e centrifugare per 1 minuto a 12.000 x g a temperatura ambiente. Portare il flusso in un nuovo tubo e aggiungere 600 μL di etanolo al 100%.
7. Aggiungere 20 μL di sfere di silice magnetica e posizionare il tubo su un termomixer impostato a 25 °C e 1.200 giri/min per 5 minuti.
   NOTA: Il volume delle perle può essere aumentato o diminuito a seconda del numero iniziale di cellule prelevate per la lisi. Le sfere di silice magnetica possono essere acquistate da venditori commerciali.
8. Posizionare il tubo su un supporto magnetico per 30 secondi o fino a quando la soluzione diventa limpida. Scartare il surnatante con cautela usando una pipetta.
9. Risospendere le sfere di silice magnetica in un tampone di lavaggio da 500 μL contenente il 90% di etanolo. Posizionare il tubo sul supporto magnetico per 30 s. Ruotare il tubo due volte sul supporto magnetico per lavare le perline. Lasciare che le perline si depositino verso il magnete e gettare il tampone usando una pipetta.
10. Ripetere il passaggio 2.9 due volte. Dopo il lavaggio, ruotare brevemente il tubo e riposizionarlo sul supporto magnetico per 30 secondi. Eliminare il tampone di lavaggio rimanente. Asciugare all'aria il tubo a 50 °C per 3 minuti su un termomiscelatore, mantenendo il coperchio aperto.
11. Aggiungere 20 μL di acqua priva di nucleasi e risospendere le perle.
    NOTA: Il volume di eluizione dell'RNA può essere ridotto fino a 10 μL per aumentare la concentrazione di RNA.
12. Posizionare i tubi per 2-3 minuti a temperatura ambiente. Riposizionare il tubo sul supporto magnetico e lasciarlo riposare per 30 secondi. Raccogliere l'RNA disciolto in una nuova provetta per la valutazione della quantità e della qualità utilizzando uno spettrofotometro.
    NOTA: L'RNA può essere conservato a -20 °C o -80 °C per la conservazione a lungo termine. Per ottenere un risultato ottimale, si consiglia di procedere con la fase di sintesi del cDNA il giorno successivo.

3. Sintesi del cDNA

1. Misurare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro e prendere 1 μg di RNA per la sintesi del cDNA.
2. Mescolare 1 μg di RNA totale con 1 μL di miscela dNTP (10 mM ciascuno di dATP, dTTP, dGTP e dCTP), 4 μL di tampone 5x di trascrittasi inversa (RT), 2 μL di 10x RT random primer, 0,25 μL di enzima trascrittasi inversa (200 U/μL) e 0,5 μL di inibitore della RNasi (40 U/μL) e portare il volume fino a 20 μL utilizzando acqua priva di nucleasi.
   NOTA: Il volume dell'enzima trascrittasi inversa può essere alterato a seconda della concentrazione iniziale di RNA prelevata per la sintesi del cDNA.
3. Tocca il tubo per mescolare la reazione e ruotare brevemente. Posizionare il tubo a 25 °C per 10 minuti e poi a 50 °C per 1 ora.
4. Per inattivare l'enzima, posizionare il tubo a 85 °C per 5 minuti.
5. Raffreddare il tubo per 2 minuti e aggiungere 480 μL di acqua priva di nucleasi al tubo per ottenere la concentrazione di cDNA a 2 ng/μL.
   NOTA: il cDNA può essere conservato a -20 °C o utilizzato immediatamente per l'analisi dd-PCR.

4. Flusso di lavoro Digital droplet PCR (dd-PCR)

NOTA: Il flusso di lavoro della dd-PCR prevede più fasi, a partire dalla preparazione del campione, seguita dalla generazione di goccioline, dall'amplificazione PCR, dal conteggio delle gocce e dall'analisi dei dati. Ogni fase è cruciale per la generazione accurata dei dati in quanto la dd-PCR comporta la quantificazione assoluta dei prodotti e non richiede alcuna curva standard. Quindi, ciascuna delle diverse fasi della dd-PCR è stata descritta di seguito.

1. Preparazione della reazione dd-PCR.
   1. Impostare la reazione PCR di 22 μL in provette o strisce PCR da 0,2 mL insieme a un tubo di controllo negativo e tubi NTC (non-template control).
      NOTA: Ogni diversa coppia di primer divergenti per la rilevazione di diversi circRNA deve avere una reazione NTC insieme a campioni di prova.
   2. Aggiungere 11 μL di miscela master dd-PCR (ad es. EvaGreen Supermix) e 11 μL di acqua priva di nucleasi per impostare il tubo di reazione di controllo negativo.
      NOTA: Scongelare la miscela master dd-PCR a temperatura ambiente seguita da un breve vortice per ottenere una miscela omogenea. Utilizzare la stessa acqua priva di nucleasi per impostare il tubo di reazione di controllo negativo e i tubi NTC utilizzati per diluire il cDNA.
   3. Aggiungere 11 μL di med-master mix dd-PCR, 5,5 μL di primer forward e reverse primer specifici per circRNA con concentrazione di 1 μM e 5,5 μL di acqua priva di nucleasi per impostare i tubi di reazione NTC.
      NOTA: Diluire i primer divergenti circolari RNA-specifici diretti e inversi di 100 μM e miscelare per preparare una concentrazione di lavoro di 1 μM di miscela di primer circRNA diretta e inversa; quindi, la concentrazione finale del primer è 250 nM nella reazione da 22 μL.
   4. Aggiungere 11 μL di med-master dd-PCR, 5,5 μL di primer forward e reverse primer specifici per circRNA con concentrazione di 1 μM e 5,5 μL di cDNA (2 ng/μL) per impostare le provette di reazione.
   5. Vortex accuratamente seguito centrifugando brevemente tutti i tubi di reazione per ottenere una miscela di reazione omogenea sul fondo dei tubi.
2. Generazione di goccioline.
   1. Trasferire i 20 μL di miscela PCR da provette PCR da 0,2 mL ai pozzetti del campione della cartuccia del generatore di gocce.
   2. Aggiungere 70 μL di olio per la generazione di goccioline ai pozzetti dell'olio della cartuccia del generatore di gocce con attenzione utilizzando una pipetta multicanale.
      NOTA: Incubare l'olio di generazione di goccioline a temperatura ambiente per 15 minuti prima dell'uso.
   3. Coprire la cartuccia del generatore di gocce con la guarnizione in gomma e posizionarla nella macchina del generatore di gocce per ottenere la miscela di gocce di olio campione, generata nei pozzetti delle gocce della cartuccia.
3. Amplificazione PCR.
   1. Trasferire 40 μL della miscela di gocce di olio campione dai pozzetti delle gocce della cartuccia del generatore di gocce a una piastra PCR a 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale.
      NOTA: trasferire con attenzione la miscela di gocce di olio campione mentre si fa un angolo verso i pozzetti attraverso le punte della pipetta multicanale per evitare di rompere le goccioline durante il trasferimento sulla piastra dd-PCR a 96 pozzetti.
   2. Sigillare la piastra PCR a 96 pozzetti con il sigillante a fogli di alluminio, posizionarla nel blocco macchina sigillante preriscaldato a 80 °C e fare clic sul sigillo per sigillare la piastra PCR.
   3. Ora, posizionare la piastra nel termociclatore dd-PCR e impostare il programma come indicato nella Tabella 2 con la temperatura del coperchio impostata a 105 °C e una velocità di rampa di 2 °C/s.
4. Conteggio delle goccioline.
   1. Una volta terminata la PCR, posizionare la piastra sulla macchina contagocce dd-PCR con il supporto della piastra nella posizione corretta per il conteggio delle goccioline.
   2. Aprire il software di analisi delle gocce e impostare l'esecuzione fornendo input per le informazioni di esempio.
   3. Fare clic sull'opzione di configurazione. Quindi, fai clic sull'opzione del modello per aprire un nuovo modello.
   4. Definisci ogni pozzetto inserendo i dettagli dell'esperimento, come il nome del campione (cDNA usato o controllo negativo o NTC), il nome del bersaglio (nome del primer circRNA) e il tipo (sconosciuto) e il tipo di esperimento come ABS (quantificazione assoluta) e Supermix (dd-PCR EvaGreen Supermix) utilizzati, ecc.
   5. Infine, salva il modello e avvia la corsa facendo clic sull'opzione di esecuzione e seleziona il conteggio per riga o colonna. Consentire alla macchina di completare il conteggio delle gocce, che richiede circa 1 minuto / pozzetto.
   6. Fare clic sul pulsante Analizza per analizzare i dati dopo il completamento della lettura del droplet.
   7. Fare clic sul pulsante Ampiezza 1D per visualizzare le goccioline positive e negative
   8. Per separare le goccioline positive dalle goccioline negative, inserire una linea di soglia comune per tutti i campioni con lo stesso target.
      NOTA: Le goccioline totali in ciascun campione devono essere superiori a 10.000 per essere considerate per la quantificazione assoluta. Il NTC non dovrebbe mostrare conteggi di goccioline positivi. La presenza di goccioline positive nel NTC indica la contaminazione dei reagenti o l'amplificazione dei dimeri di primer. È difficile scoprire se le goccioline positive hanno dimeri primer o prodotti non specifici in NTC. Si consiglia di controllare i primer ed evitare qualsiasi contaminazione dei reagenti come pratica generale per qualsiasi PCR incluso dd-PCR.
   9. Fare clic sul pulsante Esporta per esportare i dati del conteggio circRNA come file .csv. I dati esportati mostrano il numero di circRNA presenti in ciascun campione.
   10. Calcolare manualmente il numero di circRNA in ciascun campione per nanogrammo di RNA considerando la quantità totale di cDNA utilizzata in ciascuna reazione.

Risultati

Il numero assoluto di circRNA in ciascun campione può essere derivato dai dati dd-PCR esportati. L'analisi PCR quantitativa in tempo reale ha suggerito l'espressione differenziale di circBnc2 nei miotubi C2C12 differenziati (dati non mostrati). Qui, abbiamo voluto verificare il numero assoluto di copie di circBnc2 nei mioblasti e nei miotubi C2C12 proliferanti. Poiché l'espressione di circBnc2 viene confrontata in due condizioni, è molto importante elaborare tutti i campioni per l'isolamento...

Discussione

La ricerca sul CircRNA è cresciuta nell'ultimo decennio con la scoperta di tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento. Di conseguenza, è stata considerata una potenziale molecola per le future terapie a RNA. Inoltre, è noto per agire come biomarcatore in diverse malattie, tra cui il cancro e le malattie cardiovascolari ^4,8. Tuttavia, l'identificazione del circRNA è difficile a causa della sua bassa abbondanza e ha solo una specifica sequenza di giunzione...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentifuge tube	Tarson	500010
0.2 ml tube strips with cap	Tarson	610020, 510073
Filter Tips	Tarson	528104
DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977023
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma	P4417
Cell scrapper	HiMedia	TCP223
Chloroform	SRL	96764
DNA diluent	HiMedia	MB228
Random primers	Thermo Fisher Scientific	48190011
dNTP set	Thermo Fisher Scientific	R0181
Murine RNase inhibitor	NEB	M0314S
Maxima reverse transcriptase	Thermo Fisher Scientific	EP0743
QX200 dd-PCR Evagreen Supermix	Bio-Rad	1864033
Droplet generation oil for Evagreen	Bio-Rad	1864006
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable	Bio-Rad	1814040
DG8 Cartridges and Gaskets	Bio-Rad	1864007
DG8 Cartridge holder	Bio-Rad	1863051
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	1864002
ddPCR 96-Well Plates	Bio-Rad	12001925
PX1 PCR Plate Sealer	Bio-Rad	1814000
C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module	Bio-Rad	1851197
QX200 Droplet Reader	Bio-Rad	1864003
Quantasoft Software	Bio-Rad	1864011
Silica column	Umbrella Life Science	38220090
UCSC Genome Browser		https://genome.ucsc.edu/
Primer 3		https://primer3.ut.ee/