Colture cellulari IDG-SW3 in una matrice extracellulare tridimensionale

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per la coltura di cellule IDG-SW3 in una matrice extracellulare tridimensionale (3D).

Abstract

Gli osteociti sono considerati cellule non proliferative che si differenziano terminalmente dagli osteoblasti. Gli osteoblasti incorporati nella matrice extracellulare ossea (osteoide) esprimono il gene Pdpn per formare dendriti cellulari e trasformarsi in preosteociti. Successivamente, i preosteociti esprimono il gene Dmp1 per promuovere la mineralizzazione della matrice e quindi trasformarsi in osteociti maturi. Questo processo è chiamato osteocitogenesi. IDG-SW3 è una linea cellulare ben nota per studi in vitro sull'osteocitogenesi. Molti metodi precedenti hanno utilizzato il collagene I come componente principale o unico della matrice di coltura. Tuttavia, oltre al collagene I, l'osteoide contiene anche una sostanza di base, che è un componente importante nel promuovere la crescita, l'adesione e la migrazione cellulare. Inoltre, la sostanza della matrice è trasparente, il che aumenta la trasparenza del gel di collagene formato da I e, quindi, aiuta l'esplorazione della formazione di dendriti attraverso tecniche di imaging. Pertanto, questo documento descrive in dettaglio un protocollo per stabilire un gel 3D utilizzando una matrice extracellulare insieme al collagene I per la sopravvivenza di IDG-SW3. In questo lavoro, la formazione dei dendriti e l'espressione genica sono state analizzate durante l'osteocitogenesi. Dopo 7 giorni di coltura osteogenica, un'estesa rete di dendriti è stata chiaramente osservata al microscopio confocale a fluorescenza. La PCR in tempo reale ha mostrato che i livelli di mRNA di Pdpn e Dmp1 sono aumentati continuamente per 3 settimane. Alla settimana 4, lo stereomicroscopio ha rivelato un gel opaco pieno di particelle minerali, coerente con il test di fluorescenza a raggi X (XRF). Questi risultati indicano che questa matrice di coltura facilita con successo la transizione dagli osteoblasti agli osteociti maturi.

Introduzione

Gli osteociti sono cellule terminalmente differenziate derivate dagli osteoblasti ^1,2. Una volta che l'osteoblasto è sepolto dall'osteoide, subisce osteocitogenesi ed esprime il gene Pdpn per formare i preosteociti, il gene Dmp1 per ^{mineralizzare l'osteoide e i} geni Sost e Fgf23 per funzionare come un osteocita maturo nel tessuto osseo³. Qui, viene introdotto un sistema di coltura 3D per identificare l'estensione dei dendriti e l'espressione genica dei marcatori nel processo di osteocitogenesi.

Le cellule IDG-SW3 sono una linea cellulare primaria immortalizzata derivata da topi transgenici e possono espandere o replicare l'osteoblasto alla differenziazione tardiva degli osteociti quando coltivate in terreni diversi⁴. Rispetto a MLO-A5, MLO-Y4 e altre linee cellulari, il profilo di espressione delle proteine funzionali, la capacità di eseguire la deposizione di sali di calcio e le risposte a vari ormoni nelle cellule IDG-SW3 hanno maggiori probabilità di essere le stesse di quelle degli osteociti primari nel tessuto osseo⁴.

Rispetto ai sistemi 2D, i sistemi di coltura 3D sono più in grado di imitare l'ambiente di crescita cellulare in vivo, compreso il gradiente di nutrienti, la bassa rigidità meccanica e l'intervallo meccanico circostante (Tabella 1). La maggior parte dei metodi precedenti per la coltura di cellule osteoblastiche in un sistema 3D utilizzava il collagene I come componente unico nelle formulazioni ^4,5,6, perché le fibre di collagene I fungono da sito di deposizione di calcio e fosforo. Tuttavia, un costituente indispensabile nell'osteoide, la matrice extracellulare, contiene un ampio gruppo di fattori cellulari che promuovono la crescita, l'adesione e la migrazione cellulare ^7,8 ed è trasparente e conveniente per l'osservazione di imaging. Pertanto, questo protocollo utilizza Matrigel (di seguito denominato matrice di membrana basale) come componente secondario per lo studio dell'osteocitogenesi.

Protocollo

Questo protocollo è adatto per la coltura di cellule in quattro pozzetti di piastre da 24 pozzetti. Se si preparano più campioni o piastre, le quantità dei reagenti devono essere aumentate di conseguenza.

1. Preparazione della miscela di collagene I

NOTA: Il collagene I e la matrice della membrana basale gelificano rapidamente a temperatura ambiente. Pertanto, il collagene deve essere maneggiato con ghiaccio (da 2 °C a 8 °C). Tutti i puntali e le provette utilizzate devono essere preraffreddati se non diversamente indicato. Tutte le procedure devono essere eseguite in una cappa di sicurezza.

1. Mettere tutti i reagenti e le provette da centrifuga sul ghiaccio.
2. Pipettare lentamente 0,48 mL di collagene I (5 mg/mL) e 0,1 mL di terreno minimo essenziale (MEM) 10x (con rosso fenolo) in una provetta da centrifuga sterile da 15 mL tenuta in ghiaccio. Mescolare bene pipettando su e giù delicatamente.
3. In base alla tavolozza dei colori dell'indicatore rosso fenolo, utilizzare un volume appropriato di NaHCO₃ al 7,5% (p/v) (circa 0,2 mL) per regolare l'indicatore rosso fenolo su arancione, che indica che il valore del pH è compreso tra 7,0 e 7,4.
   NOTA: A seconda del pH del mezzo, viene utilizzato un volume di NaHCO₃ per portare il pH a circa 7,0-7,4. Inoltre, NaOH viene utilizzato per la neutralizzazione del pH.
4. Portare il volume finale della miscela a 1 mL aggiungendo un volume appropriato di ddH₂O. Mescolare bene pipettando delicatamente su e giù per preparare l'uso.
   NOTA: Il volume finale di ddH₂O dipenderà dalla quantità di NaHCO 3 o NaOH utilizzata nel passaggio_1.3 .

2. Preparazione della miscela cellula-matrice

1. Pipettare lentamente 0,9 mL di matrice di membrana basale in una nuova provetta da centrifuga da 15 mL sul ghiaccio.
2. Coltura delle cellule IDG-SW3 in un matraccio T25 con 4 mL di terreno completo (alfa-MEM contenente il 10% di siero fetale bovino [FBS]) integrato con 50 U/mL di INF-γ a 33 °C.
3. Una volta che le cellule IDG-SW3 raggiungono il 90% di confluenza, rimuovere il terreno e lavare le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4 per tutto il protocollo) con una pipetta. Digerire le cellule con 0,5 mL di acido tripsina-etilendiamminotetraacetico (EDTA) allo 0,25% a 37 °C per 30 s.
4. Inattivare la tripsina aggiungendo 3,5 mL di terreno completo (alfa-MEM contenente il 10% di siero fetale bovino [FBS]). Trasferire la sospensione cellulare da 4 mL in una provetta da centrifuga da 15 mL.
5. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL del terreno completo su ghiaccio.
6. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e regolare la densità cellulare finale con il terreno completo su 4 × 10⁵ cellule/mL. Aggiungere 0,1 mL della sospensione cellulare preparata a 0,9 mL della matrice extracellulare del passaggio 2.1. Mescolare bene pipettando delicatamente su e giù.
   NOTA: Se è necessario un controllo senza cellule, aggiungere 0,1 mL del terreno completo a 0,9 mL di matrice extracellulare come controllo negativo.

3. Placcatura della miscela cellula-gel

1. Mescolare delicatamente le due miscele dal passaggio 2.6 e dal passaggio 1.4 a 2 mL pipettando su e giù sul ghiaccio. Pipettare 0,5 mL della miscela finale in ciascun pozzetto (quattro pozzetti di una piastra da 24 pozzetti). Incubare a 37 °C per 1 ora fino a formare una miscela cellula-gel.
2. Aggiungere 0,5 mL di terreno osteogenico (terreno completo contenente 50 μg/mL di acido ascorbico e 4 mM di β-glicerofosfato, noto anche come mezzo di induzione osteogenico)⁴ alla miscela cellula-gel in ciascun pozzetto per avviare la differenziazione osteogenica a 37 °C. Consideralo come il giorno 0.
3. Ogni 2 giorni, sostituire metà del terreno con terreno osteogenico fresco mantenuto a 37 °C. Continuare la coltivazione per 35 giorni.

4. Identificazione della vitalità cellulare e dei dendriti cellulari mediante microscopio confocale

1. Colorazione cellulare
   NOTA: L'estere acetossimetilico di calceina (calceina AM) è un colorante permeabile cellulare che può essere utilizzato per determinare la vitalità cellulare. L'omodimero di etidio-I (EthD-1) non attraversa la membrana delle cellule intatte/vitali⁹. Pertanto, la calceina AM/EthD-1 può essere utilizzata per identificare la vitalità cellulare e i dendriti cellulari.
   1. Il giorno 1 e il giorno 7 della coltura, rimuovere la soluzione madre di calceina AM (4 mM in DMSO) e la soluzione madre EthD-1 (2 mM in DMSO/H₂O 1:4 [v/v]) dal congelatore e lasciarle riscaldare a temperatura ambiente.
      NOTA: La matrice mineralizzata ha un forte segnale di autofluorescenza, quindi lo stadio preosteocitario senza espressione di Dmp1 entro 7 giorni dalla coltura⁴ è più adatto per l'osservazione della colorazione cellulare.
   2. Aggiungere 4 μL della soluzione madre 2 mM di EthD-1 e 5 μL della soluzione madre AM di calceina 4 mM a 2 mL di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (D-PBS) e mescolare bene. Questo dà circa 2 μM calceina AM e 4 μM EthD-1 come soluzioni di lavoro.
   3. Pipettare 0,5 mL della soluzione di lavoro nei pozzetti della piastra a 24 pozzetti. Incubare per 30-45 minuti a temperatura ambiente per colorare la matrice cellula-gel.
   4. Dopo l'incubazione, aggiungere circa 0,5 mL di D-PBS fresco in una nuova piastra di coltura con fondo di vetro da 35 mm. Coprire la piastra per evitare la contaminazione o l'essiccazione dei campioni.
   5. Utilizzando una pinza con punta a gomito, trasferire con cautela la matrice di gel cellulare colorata dal punto 4.1.3 nel piatto di coltura da 35 mm dal punto 4.1.4. Evitare di danneggiare o tranciare la matrice cellula-gel.
   6. Visualizzare le cellule marcate con un microscopio laser a fluorescenza confocale.
2. Set di scansione per microscopio
   1. Posizionare il piatto da 35 mm sul palco. Selezionare le regioni della matrice cellula-gel da scansionare attraverso l'oculare utilizzando un obiettivo 10x. Gli obiettivi con ingrandimenti più elevati non sono raccomandati a causa delle dimensioni dei dendriti estesi.
   2. Selezionare i filtri ottici. La calceina può essere vista come verde con un filtro passa-banda standard della fluoresceina e l'EthD-1 può essere visto come rosso con i filtri per lo ioduro di propidio o il colorante rosso del Texas. Selezionare la "modalità linea" per la scansione e impostare il "foro stenopeico" su 2 μm.
   3. Selezionare una profondità di dati di 8 bit e una risoluzione dell'immagine di 1.024 x 1.024 pixel.
   4. Immagine utilizzando la scansione lineare sequenziale con le impostazioni ottimali del laser e del rivelatore (mantenere un'energia laser minima per evitare potenziali fotosbiancamenti).
      NOTA: L'impostazione ottimale del rivelatore dipende dai segnali di fluorescenza finali.
3. Raccolta di uno "z-stack" di immagini
   1. In base al segnale del canale verde, definire le posizioni superiore e inferiore della matrice cellula-gel da scansionare mettendo a fuoco il campione durante la scansione continua, .
   2. Una volta specificati la parte superiore e inferiore del campione, selezionare il fotogramma di scansione desiderato. Avviare la scansione. Il campione verrà scansionato dall'alto verso il basso con le impostazioni selezionate dal punto 4.2, generando una galleria di immagini.
4. Identificazione della vitalità cellulare.
   1. Selezionare una sezione dal passaggio 4.3. I canali verde e rosso indicano rispettivamente le cellule vive e morte.
5. Identificazione dei dendriti cellulari.
   1. Selezionare il singolo canale verde per generare ricostruzioni 3D con il software di acquisizione immagini. Le informazioni sulla profondità vengono visualizzate come una serie di immagini pseudocolore arcobaleno. I dendriti situati nella parte inferiore del gel sono visualizzati in rosso, mentre quelli nella parte superiore sono visualizzati in blu.

5. Identificazione dell'aspetto con uno stereomicroscopio

1. Il giorno 1, il giorno 7, il giorno 21 e il giorno 35 della coltura, rimuovere il terreno di coltura e lavare i gel nella piastra due volte con D-PBS. Aggiungere 0,5 mL di paraformaldeide al 4% (v/v) in D-PBS al pozzetto per fissare la matrice cellula-gel nella piastra per 10 minuti a temperatura ambiente.
2. Rimuovere la paraformaldeide nel pozzetto e lavare la matrice cellula-gel altre due volte con D-PBS nella piastra. Lasciare 0,5 mL di D-PBS in ciascun pozzetto per l'imaging.
3. Posizionare la piastra sul tavolino e selezionare la posizione ottimale attraverso l'oculare utilizzando un obiettivo 0.5x. Visualizzare individualmente la vista a tutto campo della matrice cellula-gel nella lastra utilizzando l'"esposizione automatica" in campo chiaro.

6. Identificazione della deposizione minerale con un saggio XRF

1. Il giorno 35 della coltura, controlla se l'azoto liquido è sufficiente. Avviare il sistema XRF. Aprire la stanza dei campioni e trasferire i gel con una pinza a gomito dalla piastra al centro della fase di campionamento dello strumento. Chiudere la stanza del campione e attendere 30 minuti per consentire allo strumento di raffreddarsi prima dell'uso.
2. Impostare il "Tempo di esposizione" su 35 ms, il "Range di spettro" su 0-40 keV e la "Corrente elettrica" su 770 μA per l'impostazione dell'acquisizione.
3. È possibile scegliere da tre a cinque siti di scansione per l'analisi spostando la fase di campionamento.
4. Selezionare gli elementi (Ca e P) per il rilevamento. Avviare il rilevamento ed esportare i risultati.
   NOTA: Ca e P sono gli elementi più abbondanti nell'idrossiapatite.

7. Identificazione dell'espressione genica funzionale

1. Il giorno 1, il giorno 7, il giorno 21, il giorno 28 e il giorno 35 della coltura, rimuovere il terreno di coltura e lavare due volte la matrice cellula-gel con D-PBS ghiacciato nella piastra.
2. Trasferire i gel con una pinza a gomito dalla piastra a una provetta da 2,0 mL (a seconda del tempo di coltura, la matrice cellula-gel si restringerà gradualmente a circa 0,1 mL il giorno 35). Assicurati che un gel sia inserito in un tubo. Aggiungere 1 mL di fenolo-cloroformio e due perle sterili di battitura in acciaio inossidabile (4 mm, come matrice lisante) in ciascuna provetta. Posizionare le provette simmetricamente nella fessura del campione preraffreddato dell'omogeneizzatore meccanico a battimento.
3. Impostare il battito su una frequenza di 55 Hz e un'ampiezza di 1 cm in ogni 1 minuto di battitura meccanica con una pausa di 10 s, con sei cicli in totale. Inizia a battere le perline.
4. Estrarre l'RNA totale dalla matrice cellula-gel utilizzando il metodo fenolo-cloroformio-isoamilachohol. Trascrivere inversamente 2 μg di RNA totale in cDNA con primer per esameri casuali.
5. Primer di progettazione mirati a β-actina, Pdpn, Dmp1, Sost e Fgf23 per la PCR in tempo reale (Tabella 2). β-actina è il gene housekeeping utilizzato per la normalizzazione. I geni Pdpn¹⁰ e Dmp1 11 sono espressi principalmente nei pre-osteociti e negli osteociti mineralizzati, mentre Sost¹² e Fgf23 ¹³ sono espressi principalmente negli osteociti maturi.
6. Posizionare la provetta su un termociclatore con il coperchio riscaldato impostato a 105 °C ed eseguire l'amplificazione PCR utilizzando le seguenti impostazioni di ciclo PCR: 95 °C per 5 s e 60 °C per 30 s per 35 cicli con una fase iniziale di denaturazione a 95 °C per 5 min e una fase di estensione finale a 60 °C per 30 s. Analizza i cambiamenti di piega con il metodo ΔΔCt.

Risultati

Dopo la colorazione delle cellule vive/morte, le cellule sono state visualizzate utilizzando un microscopio laser confocale. Tutte le cellule erano calceina AM-positiva (colore verde) e non c'erano quasi cellule EthD-1-positive (colore rosso) nel campo, indicando che il sistema di gel realizzato con questo metodo è altamente adatto per l'osteocitogenesi (Figura 1A, a sinistra). Per determinare meglio la distribuzione spaziale delle cellule, è stata scelta un'immagine pseudocolorata per vis...

Discussione

Un punto critico di questo protocollo è che le fasi 1 e 2 devono essere eseguite su ghiaccio per prevenire la coagulazione spontanea. In questo metodo, la concentrazione finale di collagene I era di 1,2 mg/mL. Pertanto, è necessario calcolare un volume ottimale di ddH₂O per abbinare i diversi collageni di vari produttori.

In vivo, l'osteocitogenesi comporta un movimento polare degli osteoblasti dalla superficie all'interno dell'osso trabecolare¹⁴. ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid	Hyclone	SH30042.01
15 mL tubes	Corning, NY, USA	430791
7.5% (w/v) Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, MO, USA	S8761
ascorbic acid	Sigma-Aldrich, MO, USA	A4544
Collagen I	Thermo Fisher Scientific	A10483-01
fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	10099141
homogenizer	BiHeng  Biotechnology, Shanghai, China	SKSI
laser confocal fluorescence microscopy	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	LSM 800
Live/Dead Cell Imaging kit	Thermo Fisher Scientific	R37601
Matrigel matrix	Corning, NY, USA	356234
MEM (10X), no glutamine	Thermo Fisher Scientific	21430079
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, MO, USA	158127
phosphate buffered saline	Hyclone	SH30256.FS
stereo microscope	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Zeiss Axio ZOOM.V16
Trizol	Thermo Fisher Scientific	15596026
X-ray fluorescence	EDAX, USA	EAGLE III
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich, MO, USA	G9422