Resezione dei linfonodi vascolari poplitei nell'arto posteriore del coniglio per induzione del linfedema secondario

Riepilogo

Qui viene descritta l'induzione chirurgica del linfedema acquisito stabile nell'arto posteriore del coniglio. Questo animale da esperimento può essere utilizzato per studiare ulteriormente l'effetto del trattamento del linfedema mediante tecniche microchirurgiche.

Abstract

Il linfedema è una condizione comune spesso associata al cancro e al suo trattamento, che porta a danni al sistema linfatico, e i trattamenti attuali sono per lo più palliativi piuttosto che curativi. La sua alta incidenza tra i pazienti oncologici indica la necessità di studiare sia la normale funzione linfatica che la disfunzione patologica. Per riprodurre il linfedema cronico, è necessario scegliere un animale da esperimento adatto. I tentativi di stabilire modelli animali sono limitati dalla capacità rigenerativa del sistema linfatico. Tra i potenziali candidati, l'arto posteriore del coniglio è facile da maneggiare ed estrapolare allo scenario clinico umano, il che lo rende vantaggioso. Inoltre, le dimensioni di questa specie consentono una migliore selezione dei vasi linfatici per la resezione vascolarizzata dei linfonodi.

In questo studio, presentiamo una procedura di resezione linfonodale vascolare nell'arto posteriore del coniglio per indurre il linfedema secondario. Gli animali anestetizzati sono stati sottoposti a misurazione circonferenziale, infiltrazione di V blu pervio e linfografia con verde indocianina (ICG-L) utilizzando la fluorescenza nel vicino infrarosso in tempo reale, una tecnica che consente l'identificazione di singoli linfonodi poplitei e canali linfatici. L'accesso alle strutture identificate si ottiene mediante l'asportazione del linfonodo popliteo e la legatura dei linfatici afferenti mediali e laterali. Particolare attenzione deve essere prestata per garantire che qualsiasi vaso linfatico che si unisce al sistema linfatico femorale all'interno della coscia senza entrare nel linfonodo popliteo possa essere identificato e legato.

La valutazione postoperatoria è stata eseguita a 3, 6 e 12 mesi dopo l'induzione utilizzando misurazioni circonferenziali dell'arto posteriore e dell'ICG-L. Come dimostrato durante il follow-up, gli animali hanno sviluppato un reflusso dermico che è stato mantenuto fino al 12^° mese, rendendo questo animale da esperimento utile per nuove valutazioni a lungo termine nella gestione del linfedema. In conclusione, l'approccio qui descritto è fattibile e riproducibile. Inoltre, durante la finestra temporale presentata, può essere rappresentativo del linfedema umano, fornendo così un utile strumento di ricerca.

Introduzione

Il linfedema è una condizione cronica che merita un'attenzione particolare, a causa della sua incidenza in tutto il mondo, della mancanza di trattamenti curativi e standardizzati e del grave impatto sulla qualità della vita dei pazienti ^1,2.

Nei paesi sviluppati, il linfedema è principalmente acquisito ed è secondario al cancro al seno, a causa dell'elevata prevalenza di questo tumore maligno; L'incidenza cumulativa del linfedema correlato al cancro al seno 10 anni dopo l'intervento chirurgico può raggiungere fino al 41,1%³. Tuttavia, anche malattie come il melanoma, i tumori ginecologici, i tumori genito-urinari e le neoplasie della testa e del collo sono associate a un'alta incidenza di questa malattia⁴. La resezione linfonodale regionale, nell'ambito del trattamento oncologico necessario per aumentare i tassi di sopravvivenza, porta all'interruzione del drenaggio linfatico funzionale. In alcuni casi, ciò si traduce in meccanismi di compensazione che prevengono o ritardano l'insorgenza del linfedema⁵. Tuttavia, quando vengono somministrate la chemioterapia e la radioterapia, questi meccanismi non sono in grado di compensare il cambiamento e di conseguenza si verifica il linfedema. Ciò ha un impatto negativo sulla qualità della vita dei pazienti, influenzando il loro benessere funzionale, sociale e psicologico ^6,7.

La necessità di una cura efficace per il linfedema richiede la comprensione della fisiopatologia del sistema linfatico, nonché una profonda comprensione dei complessi meccanismi cellulari e delle loro risposte sia nel sistema linfatico normale che in quello disfunzionale ^8,9,10. Tali intuizioni possono essere ottenute inizialmente da modelli animali sperimentali in grado di riprodurre malattie umane croniche¹¹.

Sono stati fatti molti tentativi di replicare il linfedema in modelli animali sperimentali; Tuttavia, la maggior parte di essi è stata ostacolata da alcune limitazioni, tra cui l'incapacità di riprodurre l'insufficienza linfatica cronica in un modello animale stabile, i costi dello studio e, soprattutto, la grande capacità rigenerativa del sistema linfatico, che gli consente di ripristinare la circolazione^12,13.

Questo studio presenta l'approccio sperimentale per l'induzione chirurgica di linfedema acquisito stabile utilizzando l'arto posteriore del coniglio. Sulla base della revisione della letteratura, questo animale può essere considerato ottimale per lo sviluppo del linfedema a causa dell'anatomia coerente del suo sistema linfatico degli arti posteriori, che include un singolo nodo popliteo che drena gli arti posteriori e raggiunge il sistema linfatico femorale principale nella gamba^14,15.

L'anatomia specifica dell'arto posteriore del coniglio consente la riproduzione delle procedure chirurgiche eseguite nell'uomo per indurre il linfedema secondario. Pertanto, questa procedura può essere utilizzata per la formazione microchirurgica e la ricerca preclinica per estrapolare i risultati alla medicina umana.

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dal comitato etico del Centro di Chirurgia Mininvasiva Jesús Usón e dalle linee guida del governo regionale, che si basano sulla legislazione europea.

1. Preparazione prechirurgica e chirurgica

1. Ospita nove femmine di coniglio bianco della Nuova Zelanda del peso di 4-4,5 kg e di 4 mesi di età in gabbie separate mantenute a una temperatura di 22-25 °C, con libero accesso a cibo e acqua. Assicurarsi che le gabbie contengano una vaschetta in polisulfone con una superficie di 3 m² e un'altezza di 40 cm, nonché un letto con trucioli di legno.
   1. Identificare le gabbie con il codice del progetto e il numero di identificazione dell'animale.
   2. Acclimatare gli animali per 1 settimana prima dell'intervento chirurgico per prevenire problemi indotti dallo stress. Raccogliere i valori di laboratorio preoperatori dei campioni di sangue per assicurarsi che ogni animale sia in buona salute prima dell'anestesia.
2. Assicurati che tutti i conigli seguano un digiuno di 12 ore prima di ogni procedura chirurgica.
   1. Dopo la premedicazione, preossigenare i conigli utilizzando una maschera facciale (maschera di Hall) per 5 minuti con ossigeno al 100% e un flusso di gas fresco di 3-5 L/min. Eseguire la fase di co-induzione con midazolam (0,3 mg/kg) e propofol (10 mg/kg) per via endovenosa.
3. Intubare i conigli con tubi endotracheali da 3,0-3,5, con pneumotaponazione, collegati ad un circuito circolare semichiuso collegato ad un ventilatore con flusso di gas freschi a 1 L/min per un iniziale 5 min, e successivamente impostato a 0,5 L/min.
   1. Eseguire l'anestesia di mantenimento mediante inalazione di sevoflurano a una concentrazione del 3%-3,5% impostata sul vaporizzatore.
4. Somministrare un'infusione continua della soluzione di lattato di Ringer (2-4 ml/kg/h) attraverso la vena marginale dell'orecchio ai conigli anestetizzati durante la procedura chirurgica.
   1. Utilizzare un unguento protettivo per gli occhi per proteggere la superficie oculare.
5. Monitoraggio dell'anestesia generale: utilizzare un termometro rettale per monitorare la temperatura a 38,7-39,7 °C, ispezionare il colore della mucosa e monitorare la saturazione di O₂al >95% e la frequenza cardiaca a 180-240 bpm utilizzando un pulsossimetro per conigli.
6. Posizionare un supporto termico in modo che l'animale mantenga una temperatura costante durante tutta la procedura.
7. Somministrare ketorolac (1,5 mg/kg) più tramadolo (3 mg/kg) per via endovenosa per l'analgesia intraoperatoria.
8. Somministrare antibiotici (7,5 mg/(kg∙die) di enrofloxacina per via sottocutanea [s.c.]) prima dell'intervento chirurgico e 5 giorni dopo l'intervento, nonché analgesia postoperatoria (10 μg/(kg∙die) di buprenorfina s.c.) per 5 giorni.
9. Metti i conigli in posizione supina e rade gli arti posteriori e le zone inguinali dell'animale. Posizionare l'animale in decubito dorsale/supino e tagliare il pelo dalla zona degli arti posteriori e inguinale.
10. Eseguire l'antisepsi cutanea applicando lo 0,5% di clorexidina e il 70% di etanolo sulla pelle precedentemente rasata. Una volta disinfettata l'area, copri il coniglio con un panno sterile, ad eccezione dell'arto posteriore sinistro.

2. Chirurgia di resezione dei linfonodi vascolari poplitei (Figura 1)

1. Infiltrate 0,2-0,3 mL di verde indocianina (ICG) per via intradermica nel secondo e terzo spazio interdigitale dell'arto posteriore sinistro. Massaggiare, flettere delicatamente ed estendere l'arto posteriore per alcuni minuti per facilitare l'assorbimento del colorante nei vasi linfatici. Utilizzare l'arto controlaterale come controllo.
2. Utilizzare una telecamera a fluorescenza nel vicino infrarosso in tempo reale per visualizzare e contrassegnare (utilizzando un marcatore chirurgico) i vasi linfatici che attraversano a livello del ginocchio e il linfonodo popliteo (PLN) sulla pelle (Figura 2).
3. Iniettare il blu pervio V (0,2 mL) nell'area interdigitale per la successiva identificazione dei vasi linfatici e dei linfonodi.
4. Una volta identificato il PLN utilizzando una telecamera a fluorescenza nel vicino infrarosso in tempo reale (Figura 3), creare un'incisione di 2 cm al centro della fossa poplitea, longitudinale all'asse lungo dell'arto posteriore attraverso la vena ischiatica, visibile attraverso la pelle.
   1. Per ottenere immagini panoramiche in tempo reale del sistema linfatico con la telecamera a fluorescenza in tempo reale nel vicino infrarosso, utilizzare la testa ottica dotata di un laser di classe 1 come sorgente di luce di eccitazione e una telecamera sensibile al vicino infrarosso, dalla caviglia al ginocchio dell'arto posteriore dell'animale.
   2. Visualizzare i vasi linfatici sopra la fascia muscolare resecando il grasso sottocutaneo⁵. I vasi linfatici appaiono blu a causa della colorazione a V blu pervio nel passaggio 2.3.
   3. Utilizzare una pinza microchirurgica per allungare l'incisione ed esporre il PLN, compresi i peduncoli vascolari e linfatici afferenti. Garantire una chiara visibilità di tutte le strutture linfatiche e vascolari (Figura 4).
   4. Identificare il PLN, con un diametro di 0,8 mm, sotto la vena ischiatica e tra il bicipite femorale e i muscoli posteriori della coscia mediali.
5. Identificare i due principali vasi linfatici sull'aspetto mediale del PLN. Questi vasi si trovano parallelamente alla vena safena distale e si dividono in una rete di microvasi man mano che si avvicinano al PLN (Figura 5).
6. Sezionare il peduncolo linfonodale evitando di danneggiare i tessuti e i vasi circostanti (Figura 6).
7. Legare l'arteria mediale (un ramo dell'arteria poplitea) e la vena safena laterale distalmente e prossimalmente utilizzando suture di nylon 10/0 non assorbibili.
8. Identificare e cauterizzare i due gruppi di vasi linfatici afferenti che si uniscono direttamente al sistema linfatico femorale all'interno della coscia, ma non entrano nel PLN (Figura 7).
   NOTA: Il primo gruppo corrisponde ai vasi linfatici afferenti mediali che drenano la linfa dalla parte superiore della gamba e dal polpaccio. Il secondo gruppo è composto da vasi linfatici nella muscolatura degli arti inferiori. Questi vasi corrono lungo il muscolo gastrocnemio, insieme alla vena safena.
9. Conferma la completa interruzione del sistema linfatico ripetendo l'imaging a fluorescenza nel vicino infrarosso in tempo reale.
10. Rimuovere completamente il tessuto adiposo circostante per evitare possibili linfangiogenesi.
11. Sutura l'incisione cutanea con suture intrecciate assorbibili all'acido poliglicolico (PGA) 4-0 (con ago triangolare da 16 mm 3/8) utilizzando un pattern intradermico continuo per evitare l'automutilazione postoperatoria.
12. Alloggiare i conigli individualmente in gabbie dopo l'intervento chirurgico; tenerli sotto sorveglianza e a temperatura ambiente compresa tra 16 e 22 °C.

3. Valutazione postoperatoria

1. Eseguire valutazioni postoperatorie a 3, 6 e 12 mesi dopo l'induzione.
2. Anestetizzare i conigli seguendo i passaggi utilizzati in precedenza (passaggi 1.2-1.7).
3. Misurare i perimetri degli arti posteriori dei conigli anestetizzati con un metro a nastro. Prendi le misure ogni 2 cm, con il primo punto alla caviglia e l'ultimo al ginocchio. Calcolare il volume totale utilizzando la formula del tronco di cono.
4. Utilizzare la linfografia con verde indocianina (ICG-L) per valutare la funzione linfatica.
   1. Infiltrare 0,2-0,3 mL di ICG per via intradermica nel secondo e terzo spazio interdigitale e massaggiare delicatamente per 1 minuto per facilitare l'assorbimento dell'ICG nei vasi linfatici.
5. Raccogli le immagini dopo 15 minuti utilizzando il sistema a fluorescenza nel vicino infrarosso per valutare il riflusso dermico.
6. Una volta completati i follow-up, sopprimere il coniglio seguendo lo stesso protocollo anestetico utilizzato nell'intervento. Una volta raggiunto il piano anestetico desiderato, somministrare cloruro di potassio per via endovenosa nella vena auricolare a una velocità media di 2 meq/kg.

Risultati

Nove conigli sono stati sottoposti a induzione di linfedema in questo studio, tuttavia, tre conigli sono morti durante l'immediato periodo postoperatorio e non è stato possibile valutarli. I dati dello studio sono stati ottenuti a 3, 6 e 12 mesi dopo l'intervento da tre ricercatori indipendenti. Le misurazioni circonferenziali degli arti posteriori e l'ICG-L sono state eseguite in anestesia generale per valutare la funzione del sistema linfatico e il riflusso dermico.

Discussione

La resezione del PLN in un animale da esperimento è una procedura relativamente nuova che può indurre linfedema secondario negli arti per la valutazione e lo studio. Dopo la resezione linfonodale, c'è un periodo di alterazione della funzionalità del sistema linfatico, accumulo linfatico e cambiamenti istologici dei vasi linfatici che appaiono dilatati. Quando questo accumulo di linfa raggiunge livelli adeguati, il caratteristico riflusso dermico del linfedema, simile a quello osserva...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bleu Patente V sodique (Guerbet)	Guerbet. Villepinte, France		2.5 g/100 mL
Buprenorphine (Bupaq)	Richter Pharma. Wels, Austria	0820645AA	3 mg/10 mL
Fluobeam	Fluoptics. Grenoble, France		Fluorescence imaging
IBM SPSS software	IBM	version 21.0
Indocyanine green (Verdye, Diagnostic Green GmbH)	Diagnostic Green GmbH. Aschheim-Dornach, Germany		5 mg/mL
Ketorolaco  (Normon)	Normon, S.A. Madrid, Spain	T01H	30 mg/mL
Microsoft Excel	Microsoft	version 16.66.1
Midazolam (Normon)	Normon, S.A. Madrid, Spain	T35M	15 mg/3 mL
Pentero 800 microscope, fluorescence module	Carl Zeiss Meditec AG. Goeschwitzer Strasse 51-52. Jena, Germany	302581-9245-000
Potassium chloride (Braun)	B.Braun. Barcelona, Spain	19262010	20 mmol/10 mL
Propofol (Propomitor, Orion Pharma)	Orion Pharma. Spoo, Finland	20R039B	200 mg/20 mL
RÜSCH endotracheal tubes	Teleflex Medical IDA Business and Technology Park. Athione, Ireland.	12CE 12	Size Tube 4.0 I.D. mm
Sevoflurano (SevoFlo, Zoetis)	Zoetis Belgium. Luvain-la-Neuve, Belgium	6093559	1000 mg/g (250 mL)
Tramadol (Normon)	Normon, S.A. Madrid, Spain	T08U	100 mg/2 mL