Generazione di un modello di tiroidite autoimmune spontanea del topo

Riepilogo

Sono stati stabiliti diversi tipi di modelli animali della tiroidite di Hashimoto, così come la tiroidite autoimmune spontanea nel topo NOD. I mouse H-2h4 sono un modello semplice e affidabile per l'induzione HT. Questo articolo descrive questo approccio e valuta il processo patologico per una migliore comprensione del modello murino SAT.

Abstract

Negli ultimi anni, la tiroidite di Hashimoto (HT) è diventata la malattia autoimmune della tiroide più comune. È caratterizzata da infiltrazione linfocitaria e dalla rilevazione di specifici autoanticorpi sierici. Sebbene il potenziale meccanismo non sia ancora chiaro, il rischio di tiroidite di Hashimoto è correlato a fattori genetici e ambientali. Allo stato attuale, ci sono diversi tipi di modelli di tiroidite autoimmune, tra cui tiroidite autoimmune sperimentale (EAT) e tiroidite autoimmune spontanea (SAT).

L'EAT nei topi è un modello comune per HT, che viene immunizzato con lipopolisaccaride (LPS) combinato con tireoglobulina (Tg) o integrato con adiuvante completo di Freund (CFA). Il modello murino EAT è ampiamente affermato in molti tipi di topi. Tuttavia, la progressione della malattia è più probabilmente associata alla risposta anticorpale Tg, che può variare in diversi esperimenti.

SAT è anche ampiamente usato nello studio di HT nel NOD. Mouse H-2H4. Il CENNO. Il topo H2h4 è un nuovo ceppo ottenuto dall'incrocio del topo diabetico non obeso (NOD) con la B10. A(4R), che è significativamente indotto per HT con o senza alimentazione di iodio. Durante l'induzione, il NOD. Il topo H-2h4 ha un alto livello di TgAb accompagnato da infiltrazione di linfociti nel tessuto follicolare tiroideo. Tuttavia, per questo tipo di modello murino, ci sono pochi studi per valutare in modo completo il processo patologico durante l'induzione dello iodio.

In questo studio viene stabilito un modello murino SAT per la ricerca HT e il processo di cambiamento patologico viene valutato dopo un lungo periodo di induzione dello iodio. Attraverso questo modello, i ricercatori possono comprendere meglio lo sviluppo patologico della HT e selezionare nuovi metodi di trattamento per la HT.

Introduzione

La tiroidite di Hashimoto (HT), nota anche come tiroidite linfatica cronica o tiroidite autoimmune, è stata segnalata per la prima volta nel 1912¹. La HT è caratterizzata da infiltrazione linfocitaria e danni al tessuto follicolare tiroideo. I test di laboratorio si manifestano principalmente come aumento degli anticorpi specifici della tiroide, inclusi gli anticorpi anti-tireoglobulina (TgAb) e gli anticorpi anti-perossidasi tiroidea (TPOAb)². L'incidenza di HT è nell'intervallo 0,4% -1,5%, rappresentando il 20% -25% di tutte le malattie della tiroide, e questo valore è aumentato negli ultimi anni³. Inoltre, un gran numero di studi ha riportato che la HT è associata all'oncogenesi e alla recidiva del carcinoma papillare della tiroide (PTC)^4,5; I potenziali meccanismi sono ancora controversi. La tiroidite autoimmune è anche un fattore importante nell'infertilità femminile⁶. Pertanto, la patogenesi della HT deve essere chiara, per la quale è essenziale un modello animale stabile e semplice.

Per studiare l'eziologia della HT, sono stati impiegati due tipi principali di modelli murini, tra cui la tiroidite autoimmune sperimentale (EAT) e la tiroidite autoimmune spontanea (SAT) nei presenti studi ^7,8. I topi sensibili sono stati immunizzati con antigeni tiroidei specifici (tra cui la tiroide grezza, la tireoglobulina purificata [TG], la perossidasi tiroidea [TPO], l'ectodominio TPO ricombinante e peptidi TPO selezionati) per stabilire il modello murino EAT. Inoltre, gli adiuvanti, tra cui lipopolisaccaride (LPS), adiuvante completo di Freund (CFA) e altri adiuvanti insoliti, vengono utilizzati anche durante l'immunizzazione per abbattere la tolleranza immunitaria 9,10,11,12,13,14,15,16,17.

Il modello SAT è un modello importante per studiare lo sviluppo spontaneo della tiroidite autoimmune, che si basa sul NOD. Topi H-2h4. Il CENNO. Il topo H-2h4 è un nuovo ceppo ottenuto dall'incrocio di NOD e B10. Topi A(4R), seguiti da più backcross a NOD, con il gene di suscettibilità alla tiroidite autoimmune IAk^18,19. ANNUIRE. I topi H-2h4 non sviluppano il diabete, ma hanno un'alta incidenza di tiroidite autoimmune e sindrome di Sjogren (SS)¹⁹. Gli studi hanno scoperto che la molecola di adesione intracellulare-1 (ICAM-1) è altamente espressa nel tessuto tiroideo di NOD. Topi H-2h4 a 3-4 settimane di età. Inoltre, con l'aumento dell'assunzione di iodio, l'immunogenicità della molecola di tireoglobulina è potenziata, che regola ulteriormente l'espressione di ICAM-1, che svolge un ruolo importante nel processo di infiltrazione dei monociti²¹. Questo modello simula il processo autoimmune verificando la relazione tra dose di iodio e gravità della malattia. Il metodo stabilito è stabile, con un'alta probabilità di successo. Il modello SAT è stato applicato per indurre tiroidite autoimmune per molti anni e continua ad essere un metodo efficace per studiare la patogenesi della tiroidite autoimmune. Tuttavia, l'attuale metodo di costruzione del modello EAT è più complicato e costoso; Diversi laboratori utilizzano diversi metodi di immunizzazione e siti di iniezione. Inoltre, topi con diversi background genetici hanno diversi tassi di induzione, che necessitano di ulteriori studi per rivelare il potente meccanismo.

Tuttavia, lo sviluppo della tiroidite nel modello SAT è associato allo ioduro di sodio, al dimorfismo sessuale e alle condizioni di allevamento. Per rivelare la procedura appropriata di tiroidite autoimmune nel modello SAT, questo articolo ha descritto il metodo di induzione della tiroidite autoimmune in diverse condizioni. Inoltre, consente lo studio della patogenesi e del progresso immunologico della tiroidite autoimmune in diversi stadi di questa malattia.

Protocollo

Il protocollo descritto di seguito è stato approvato dalle linee guida per la cura e l'uso stabilite dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Sichuan.

1. Preparazione

1. Ospitare tutti i topi in specifiche condizioni prive di agenti patogeni in cicli luce-buio di 12 ore (a partire rispettivamente dalle 07:00 e dalle 19:00). Mantenere la temperatura ambiente a 22 °C. Cambia i materiali della biancheria da letto ogni settimana. Fornire quantità adeguate di chow e acqua standard per roditori.
2. Quando si prepara la soluzione madre di NaI in acqua, pesare 2,5 g del composto e scioglierlo in 50 ml di acqua sterile e pura sotto vortice per ottenere una soluzione madre del 5%. Conservare questa soluzione madre in un congelatore a 4 °C, evitando la luce, per un massimo di 8 settimane.
3. Per preparare una soluzione di lavoro di NaI, prelevare 2,5 ml di soluzione madre e scioglierla in 250 ml di acqua normale come acqua potabile giornaliera per NOD. Topi H-2h4, per dare una soluzione di lavoro dello 0,05%.

2. Induzione della tiroidite

1. Modello SAT
   1. Preparare il NOD. Topi H-2h4 (8 settimane di età) per lo studio ospitando tutti i topi di un singolo sesso (nessun dimorfismo sessuale) in gabbie di barriera (cinque animali per gabbia) con le condizioni di alimentazione descritte nella fase 1.1.
   2. Per indurre tiroidite autoimmune in NOD. Topi H-2h4, nutrire tutti i topi con lo 0,05% di NaI per 8 settimane. Cambia l'acqua NaI ogni settimana e valuta lo stato dei topi su base settimanale, incluso aspetto, peso, appetito, stato mentale e mobilità.
2. Modello EAT
   1. Preparare i topi BALB/c (8 settimane di età) per lo studio ospitando tutti i topi di un solo sesso (senza dimorfismo sessuale) in gabbie barriera (cinque animali per gabbia) con le condizioni di alimentazione descritte nella fase 1.1. Nutrire tutti i topi con lo 0,05% di NaI per 8 settimane.
   2. Durante le prime 2 settimane, iniettare per via sottocutanea una miscela di CFA e Tg (200 μL) una volta alla settimana.
   3. Dalla terza settimana in poi, iniettare per via sottocutanea una miscela di IFA e Tg (200 μL) una volta alla settimana per 3 settimane.

3. Misurazioni

1. Preparazione di campioni di sangue periferico
   1. Dopo l'induzione, anestetizzare i topi con un volume di 0,01 mL/g di anestetico mediante iniezione intraperitoneale. Preparare l'anestetico mescolando midazolam (40 μg/100 μL per sedazione), medetomidina (7,5 μg/100 μL per sedazione) e tartrato di butorfanolo (50 μg/100 μL per analgesia) in soluzione salina tamponata fosfato (PBS).
      NOTA: Le concentrazioni specifiche di ciascun componente nella miscela di anestesia sono: midazolam 13,33μg/100μL, medetomidina 2,5μg/100μL e butorfanolo 16,7μg/100μL. Per dosaggi specifici utilizzati nei topi, le dosi sono: midazolam 4μg / g, medetomidina 0,75μg / g e butorfanolo 1,67μg / g. La profondità dell'anestesia è stata confermata quando i muscoli degli arti del topo si sono rilassati, i baffi non hanno avuto risposta al tocco e c'è stata perdita del riflesso del pedale.
   2. Dopo che i topi sono stati anestetizzati, preparare i campioni di sangue periferico, fissando il topo con una mano e premendo la pelle dell'occhio per sporgere il bulbo oculare. Quindi, inserire il tubo capillare nell'angolo interno dell'occhio e penetrare con un angolo di 30-45 gradi rispetto al piano della narice. Applicare pressione ruotando delicatamente il tubo capillare. Il sangue fluirà nel tubo attraverso l'azione capillare.
   3. Mettere il sangue in frigorifero a 4 °C per 2 ore e poi centrifugare a 1.000 × g per 10 minuti a 4 °C per ottenere il campione. Per ulteriori analisi, conservare il resto del campione a -80 °C.
2. Preparazione di campioni di tessuto tiroideo
   1. Eutanasia umana dell'animale secondo le politiche istituzionali. Quindi, sezionare la parete toracica per esporre il cuore, tagliare l'atrio destro e infondere soluzione salina nel ventricolo sinistro con un ago per infusione endovenosa collegato a una siringa da 20 ml fino a quando il tessuto diventa bianco.
   2. Fissare il mouse sul tavolo di dissezione con i perni. Sterilizzare il collo con etanolo al 75%. Tagliare la pelle del topo lungo la linea mediana del collo dalla parte superiore dello sterno alla mascella inferiore con forbici di tessuto per esporre completamente il tessuto del collo.
   3. Osservare la coppia di ghiandole rosa, le ghiandole sottomandibolari, sotto le quali si trova il muscolo trachea anteriore. Separare le ghiandole e il muscolo con forbici oftalmiche e pinze per esporre la trachea e la cartilagine tiroidea.
   4. Separare il tessuto sotto la cartilagine, usando una pinza curva per raccogliere la cartilagine e la trachea insieme. Tagliare le estremità distale e prossimale della cartilagine e della trachea, rispettivamente, e rimuovere la ghiandola tiroidea insieme alla trachea.
   5. Immergere le ghiandole in paraformaldeide al 4% per 12-24 ore. Quindi, trasferire il tessuto al 70% di etanolo.
   6. Posizionare i singoli lobi del materiale per biopsia tiroidea nelle cassette di lavorazione e disidratare attraverso il seguente gradiente alcolico seriale: 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%, etanolo per 40 minuti ciascuno; 1/2 xilene + 1/2 etanolo assoluto per 2 ore; 100% xilene per 1,5 ore; 100% xilene per 1,5 ore; 1/2 xilene + 1/2 paraffina per 2 ore; forno a 40 ° C per 40 min; paraffina I per 30 min; e paraffina II per 30 min. Incorporali in blocchi di cera di paraffina.
   7. Prima della colorazione, decerare sezioni di tessuto tiroideo spesse 5 μm in xilene (come segue) e reidratare attraverso le seguenti concentrazioni decrescenti di etanolo: xilene I per 10 minuti; xilene II per 10 min; xilene III per 10 min; etanolo assoluto I per 5 min; etanolo assoluto II per 5 min; 90% di alcol per 5 min; 80% di alcol per 5 min; 70% di alcol per 5 min; e 50% di alcol per 5 min.
   8. Colorare i tessuti con ematossilina ed eosina (H & E). Colorare con ematossilina per 15 minuti, risciacquare con acqua di rubinetto per 15 minuti, aggiungere etanolo acido cloridrico all'1% per 10 s, risciacquare con acqua corrente e quindi con etanolo al 50%, 70% e 80%, ciascuno per 3 min. Eseguire la colorazione con etanolo allo 0,5% di eosina per 2 minuti e risciacquare con acqua corrente. Posizionare le sezioni di paraffina successivamente in etanolo al 75% per 2 minuti, etanolo all'85% per 2 minuti, etanolo assoluto per 5 minuti e xilene per 5 minuti. Fissare le fette con gomma neutra e vetrini.
   9. Per valutare l'entità della tiroidite linfocitica, valutare le sezioni tiroidee come segue: 0: poca o nessuna infiltrazione di linfociti nel tessuto tiroideo; 1+: più di 1/8 della ghiandola è infiltrata in uno o più fuochi; 2+: non più di 1/4 della ghiandola è infiltrata con i linfociti; 3+: 1/4-1/2 della ghiandola è infiltrato con i linfociti; 4+: più di 1/2 della ghiandola viene distrutta.
      NOTA: Si consiglia di rimuovere la cartilagine tiroidea per mantenere l'intera struttura della tiroide del topo, che è troppo piccola per essere rimossa dalla trachea.
3. Misurazione di TPOAb
   NOTA: Le cellule ovariche di criceto cinese (CHO) che esprimono stabilmente il TPO del topo sono state stabilite nel nostro laboratorio. Il cDNA TPO di topo è stato asportato da XbaI e NheI. Quindi, il cDNA è stato trasferito a pcDNA5 / FRT. Dopo che il plasmide è stato costruito con successo, è stato trasfettato nelle cellule CHO e selezionato con igromicina B (100 g / ml).
   1. Dopo la costruzione delle cellule mTPO-CHO, diluire i sieri di topo dal punto 3.1.3 (1:50) e incubare con le cellule mTPO-CHO per 2 ore. Dopo l'incubazione, escludere la colorazione cellulare con ioduro di propidio (1 g/ml) e analizzare il campione mediante citometria a flusso utilizzando IgG anti-topo di capra coniugate con fluoresceina isotiocianato, purificate per affinità. Screening delle popolazioni monocellulari sopravvissute mediante i canali FSC-A e SSC-A e selezionare le cellule marcate FITC e PI dalle popolazioni monocellulari²¹.
   2. Includere il siero di topi BALB/c o C57BL/6 non immunizzati legati a IgG come controllo negativo. Includere anticorpi monoclonali di topo contro il TPO²² umano come controlli positivi che riconoscono il TPO²³ del topo. Esprimere i dati di legame TPO come mezzi geometrici.
4. Misurazione del TgAb
   NOTA: Utilizzare un kit ELISA per rilevare la tireoglobulina seguendo le istruzioni del produttore.
   1. Diluire i campioni standard nella provetta della microcentrifuga secondo le istruzioni. Estrarre il kit dal frigorifero e tenerlo a temperatura ambiente per 30 minuti.
   2. Impostare i pozzi standard, i pozzi vuoti e i pozzi di prova. I pozzi vuoti ottengono solo buffer, mentre i pozzi standard ottengono soluzioni standard. Aggiungere 10 μL di campioni nei pozzetti di prova. Quando aggiungi i campioni, cerca di non toccare le pareti dei pozzetti e scuoti delicatamente la piastra per spostare i campioni sul fondo dei pozzi.
   3. Includere il siero di topi BALB / c immunizzati con Tg, CFA e IFA²⁴ come controllo positivo e il siero di NOD di 8 settimane. Topi H-2h4 su acqua normale come controllo negativo.
   4. Incubare i campioni a bagnomaria a 37 °C per 30 minuti. Diluire il tampone di lavaggio con acqua distillata in rapporto 1:30. Quindi, rimuovere la pellicola sigillante, scuotere il liquido all'interno della piastra enzimatica e asciugare tamponando su carta assorbente e aggiungere 350 μL di tampone di lavaggio per 30 s. Ripetere questa procedura cinque volte e poi tamponare i pozzetti asciutti.
   5. Aggiungere 50 μL di reagente di marcatura enzimatica a ciascun pozzetto, ad eccezione dei pozzetti vuoti, e incubare in un bagno d'acqua a 37 ° per 30 minuti. Rimuovere la pellicola sigillante, scuotere il liquido all'interno della piastra enzimatica e asciugare tamponando su carta assorbente.
   6. Aggiungere 50 μL di sviluppatore A a ciascun pozzetto seguito da 50 μL di sviluppatore B e agitare delicatamente i pozzetti per mescolare per 5 minuti. Aggiungere 50 μL della soluzione di terminazione in ciascun pozzetto per 15 minuti per interrompere la reazione. Misurare l'assorbanza (OD) di ciascun pozzetto a una lunghezza d'onda di 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre. Presentare i dati TgAb come densità ottica (OD) a 490 nm.
5. Misurazione del T4 e dell'ormone stimolante la tiroide (TSH)
   NOTA: Misurare i livelli di T4 e TSH (in aliquote da 10 μL) mediante ELISA seguendo le istruzioni del produttore.
   1. Diluire l'enzima coniugato a 1:11 con il diluente del dosaggio; diluire i campioni da misurare (1:100) utilizzando 0,01 M PBS.
   2. Aggiungere 10 μL dello standard e del campione ai pozzetti corrispondenti, aggiungere 100 μL di enzima coniugato a ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
   3. Scartare il liquido nei pozzetti e pulirlo con tampone di lavaggio tre volte.
   4. Aggiungere 100 μL di 3,3',5,5'-tetrametil benzidina (TMB) e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.
   5. Aggiungere 50 μL di soluzione di arresto e mescolare delicatamente per 15-20 s.
   6. Determinare l'assorbanza (OD) utilizzando un lettore di micropiastre a una lunghezza d'onda di 450 nm e calcolare la concentrazione del campione.
   7. Utilizzare un software statistico per eseguire il test t o il test della somma dei ranghi e tracciare i risultati.

Risultati

I cambiamenti istologici erano sorprendentemente diversi nelle femmine e nei maschi, la durata dell'assunzione di iodio e la soluzione di NaI. Come mostrato nella Figura 1, ~10% di NOD. I topi H-2h4 hanno sviluppato SAT anche senza induzione di iodio all'età di 24 settimane e tutti i topi alla fine hanno sviluppato tiroidite. Quando veniva somministrata acqua normale, non c'era alcuna differenza significativa nei cambiamenti istologici tra maschi e femmine. L'aggiunta di NaI all'acqua potab...

Discussione

La HT si verifica a causa di un disturbo del sistema autoimmune causato da linfociti che si infiltrano nella ghiandola tiroidea, compromettendo ulteriormente la funzione tiroidea, mentre producono anticorpi specifici della tiroide. I livelli sierici di TSH, TgAb e TPOAb nei pazienti con HT sono significativamente elevati²⁷. Allo stato attuale, due tipi principali di modelli murini sono ampiamente utilizzati per studiare l'eziologia della tiroidite autoimmune: EAT e SAT²⁹. I...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Butorphanol tartrate	Supelco	L-044
Dexmedetomidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	145108-58-3
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) well	Sigma-Aldrich	M9410-1CS
Ethanol	macklin	64-17-5
Freund’s Adjuvant, Complete	Sigma-Aldrich	F5881
Freund’s Adjuvant, Incomplete	Sigma-Aldrich	F5506
Goat anti-Mouse IgG	invitrogen	SA5-10275
Midazolam solution	Supelco	M-908
Mouse/rat thyroxine (T4) ELISA	Calbiotech	DKO045
Paraformaldehyde	macklin	30525-89-4
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	P4864
Sodium Iodine	Sigma-Aldrich	7681-82-5
Thyroglobulin	Sigma-Aldrich	T1126
Thyroglobulin  ELISA Kit	Thermo Scientific	EHTGX5
TSH ELISA	Calbiotech	DKO200
Xylene	macklin	1330-20-7