Uso di metodi minimamente invasivi per valutare l'utilizzo del carburante e i ritmi circadiani negli anziani

Riepilogo

Viene presentato un protocollo innovativo e minimamente invasivo per valutare l'impatto sinergico dell'utilizzo del carburante e dei ritmi circadiani sugli individui che invecchiano, utilizzando cellule mononucleate del sangue periferico.

Abstract

L'invecchiamento è associato a molteplici cambiamenti fisiologici che contribuiscono sinergicamente e indipendentemente alla disabilità fisica e al rischio di malattie croniche. Sebbene l'eziologia della disabilità fisica legata all'età sia complessa e multifattoriale, il declino della funzione mitocondriale sembra coincidere con la progressione del declino funzionale in molti anziani. Il motivo per cui c'è una diminuzione della funzione mitocondriale con l'invecchiamento rimane sfuggente, ma la scienza emergente indica che sia il metabolismo del carburante che i ritmi circadiani possono influenzare la funzione mitocondriale.

Studi recenti hanno stabilito che i ritmi circadiani vengono disturbati con l'invecchiamento e che i ritmi circadiani interrotti hanno conseguenze patologiche che influiscono sulla funzione mitocondriale e si sovrappongono a molte malattie croniche associate all'età. Gli attuali metodi quantitativi per la valutazione diretta della funzione mitocondriale sono invasivi e in genere richiedono una biopsia muscolare, che può porre difficoltà con il reclutamento dei partecipanti e l'aderenza allo studio, dati i livelli percepiti di potenziale dolore e rischio. Pertanto, è stato adattato un protocollo innovativo e relativamente non invasivo per valutare i cambiamenti nella funzione mitocondriale a livello cellulare e nei modelli circadiani negli anziani. In particolare, un analizzatore di flusso metabolico in tempo reale viene utilizzato per valutare la funzione bioenergetica mitocondriale dei globuli bianchi in disponibilità differenziale di substrato.

Vengono inoltre analizzate l'espressione dei geni dell'orologio circadiano nei globuli bianchi per correlare in modo incrociato con la bioenergetica mitocondriale e gli esiti del ritmo circadiano. Si ritiene che questi approcci metodologici innovativi aiuteranno i futuri studi clinici fornendo metodi minimamente invasivi per lo studio della preferenza del substrato mitocondriale e dei ritmi circadiani negli anziani.

Introduzione

I progressi dell'ultimo secolo hanno portato a un aumento dell'aspettativa di vita e della popolazione di adulti che invecchiano. Guardando al futuro, si prevede che la percentuale di adulti di età pari o superiore a 65 anni aumenterà del 5% dal 2020 al 2050 negli Stati Uniti¹. Questo aumento dell'aspettativa di vita non implica un aumento della durata della salute, il periodo della vita associato al funzionamento indipendente. La realtà è che l'invecchiamento è accompagnato da innumerevoli cambiamenti biologici che influenzano il metabolismo cellulare e la fisiologia, producendo un graduale declino del funzionamento cognitivo e fisico ^2,3. Poiché l'aspettativa di vita umana continua ad aumentare, c'è una maggiore necessità di preservare la capacità funzionale e l'indipendenza con l'età di⁴ anni.

È noto da tempo che il declino della funzione fisica e dell'indipendenza con l'età è multifattoriale, sebbene sia spesso associato all'insorgenza di malattie croniche e di eventi stimolanti acuti⁵. Al contrario, è stato dimostrato che questi cali delle prestazioni fisiche e delle caratteristiche muscolari sono associati allo sviluppo di disabilità con l'età senza una chiara connessione con una singola malattia⁶. Con le difficoltà nel conoscere l'esatta eziologia della malattia cronica e della disabilità fisica, si è pensato che le menomazioni della funzione mitocondriale coincidessero con l'insorgenza e la progressione della malattia cronica e la perdita della funzione fisica negli adulti che invecchiano ^7,8.

I mitocondri forniscono la maggior parte dell'adenosina trifosfato (ATP), necessaria per molti processi cellulari⁹. I tessuti altamente ossidativi si affidano ai mitocondri per un'adeguata produzione di energia; con l'invecchiamento, la capacità ossidativa e il declino della sintesi mitocondriale di ATP. Questo declino è dovuto in parte al danno ossidativo al DNA mitocondriale (mtDNA), che si traduce in un accumulo incrementale di mutazioni e delezioni del mtDNA¹⁰. L'accumulo di mutazioni e delezioni del mtDNA provoca una diminuzione della formazione di proteine funzionali della catena di trasporto degli elettroni, causando così una ridotta capacità delle cellule di produrre ATP. Il declino della funzione mitocondriale associato all'età è più evidente nei tessuti altamente ossidativi, come il cuore e il muscolo scheletrico¹¹. Gli studi hanno dimostrato che i mitocondri del muscolo gastrocnemio nei campioni di ratto più anziani mostrano una riduzione di circa il 50% della produzione e del contenuto di ATP rispetto ai campioni più giovani¹². Inoltre, è stato dimostrato che la capacità di produzione mitocondriale di ATP nel muscolo scheletrico umano diminuisce di circa l'8% per decennio di vita¹³. Questi risultati suggeriscono che il declino della funzione mitocondriale legato all'età può contribuire a ridurre la produzione di energia negli organismi.

Si ritiene che un regolatore chiave dell'attività mitocondriale sia il coattivatore-1 (PGC-1α)14 del recettore attivato dal proliferatore dei perossisomi γ (PPARγ)¹⁴. Il deterioramento dell'attività di PGC-1α o un declino della sua abbondanza porta a una ridotta attività ossidativa mitocondriale e, di conseguenza, a una ridotta produzione di energia. Inoltre, un declino della qualità mitocondriale può influenzare la qualità del muscolo scheletrico e successivamente portare allo sviluppo o all'esacerbazione di sarcopenia, dinapenia e declino della capacità funzionale^15,16. L'evidenza del declino concomitante correlato all'età della funzione mitocondriale e della qualità del muscolo scheletrico suggerisce una connessione tra la compromissione mitocondriale e la patogenesi del declino funzionale¹⁷. Recentemente, questo è stato confermato negli anziani funzionali che vivono in comunità, dimostrando che le riduzioni del metabolismo dei mitocondri del muscolo scheletrico predicono il declino della mobilità in questa popolazione¹⁸. Sebbene l'esatto meccanismo che porta al declino mitocondriale con l'età non sia chiaro, recenti evidenze hanno evidenziato un'interazione reciproca tra l'orologio circadiano e la funzione mitocondriale, con conseguenze per l'utilizzo del carburante mitocondriale e la biogenesi¹⁹.

Utilizzo del carburante
La funzione mitocondriale sembra essere influenzata dal metabolismo del carburante e dal tipo di carburante utilizzato a livello cellulare nel tessuto muscolare scheletrico¹¹. Durante i periodi di esaurimento del combustibile, in particolare l'esaurimento dei carboidrati nell'uomo, la preferenza per il carburante per la produzione di energia (mitocondriale) cambia. A bassi livelli di glucosio, la preferenza per il carburante si sposta dal glucosio agli acidi grassi e ai corpi chetonici di derivazione acida. Questo interruttore metabolico è caratterizzato dalla sovraregolazione del metabolismo lipidico negli adipociti, seguita da un aumento del rilascio di chetoni nel sangue⁴. Il passaggio dall'utilizzo del carburante dal glucosio ai chetoni con una dieta chetogenica sembra avere un effetto benefico sulla produzione di specie reattive dell'ossigeno mitocondriale, sulla difesa antiossidante, sulla sintesi di ATP e sulla biogenesi²⁰.

Il passaggio metabolico dal metabolismo dei carboidrati a quello dei lipidi si verifica in periodi di bassa disponibilità di nutrienti ambientali e quando le riserve di glicogeno sono state esaurite. Quando questo passaggio viene avviato, i trigliceridi immagazzinati vengono scomposti in glicerolo, un substrato per la gluconeogenesi, e acidi grassi liberi, che vengono trasportati al fegato per essere ossidati tramite β-ossidazione in acetil coenzima A (acetil CoA). I corpi chetonici sono sintetizzati, principalmente nel fegato, mediante una condensazione in due fasi di tre molecole di acetil CoA in β-idrossi-β-metilglutaril-CoA, che vengono poi ulteriormente trasformati in corpi chetonici, tra cui acetoacetato e 3-βeta idrossibutirrato²¹. Questi corpi chetonici sono distribuiti ai tessuti di tutto il corpo, con il consumo più elevato che si verifica nel cuore, nel cervello e nel muscolo scheletrico²¹. Con l'invecchiamento, l'ossidazione degli acidi grassi mitocondriali viene compromessa, influenzando così l'interruttore metabolico²². È stato proposto che le menomazioni nell'utilizzo del carburante mitocondriale portino a un'ulteriore disfunzione mitocondriale, che a sua volta contribuisce alla malattia legata all'età e al declino funzionale²³.

I cambiamenti nel consumo di ossigeno mitocondriale delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono stati studiati per valutare i modelli associati alla disfunzione e alla vascolarizzazione. Hartman et al. hanno condotto uno studio che mirava a determinare la correlazione tra il consumo di ossigeno e la dilatazione mediata in modo diverso, che è stato trovato per suggerire un legame tra la disfunzione mitocondriale e la disfunzione delle cellule muscolari lisce vascolari²⁴. Per quanto riguarda altri organi, le PBMC sono state correlate con un funzionamento cognitivo e cerebrale più elevato, come determinato dalla respirometria²⁵. Pertanto, la bioenergetica e la capacità respiratoria della PBMC possono fungere da potenziali biomarcatori per valutare la capacità funzionale di organi o tessuti in tutto il corpo.

Ritmo circadiano
Un altro fattore importante che influenza la salute mitocondriale è il ritmo circadiano. I ritmi circadiani sono oscillazioni di ~24 ore nel comportamento e nella fisiologia che si verificano in assenza di segnali ambientali²⁶. Questi ritmi funzionano in modo predittivo per supportare l'omeostasi del sistema e dei tessuti. Il meccanismo che sta alla base dei ritmi circadiani è un ciclo di feedback trascrizione-traduzione chiamato orologio circadiano²⁷. È stato dimostrato negli ultimi 15 anni che il meccanismo dell'orologio circadiano esiste praticamente in tutte le cellule del corpo²⁸. Oltre a tenere il tempo, il meccanismo dell'orologio molecolare contribuisce anche a un programma giornaliero di espressione genica, indicato come output dell'orologio circadiano²⁹. I geni di uscita dell'orologio sono unici per ogni tipo di tessuto e sono funzionalmente associati a percorsi importanti per il metabolismo cellulare, l'autofagia, la riparazione e l'omeostasi. Prove recenti hanno dimostrato che la salute mitocondriale dipende dalla funzione dell'orologio circadiano e influenza la funzione mitocondriale, tra cui la biogenesi mitocondriale, l'utilizzo del carburante e la mitofagia³⁰.

Prove emergenti sia in studi preclinici che clinici hanno dimostrato che durante l'invecchiamento ci sono disturbi nei ritmi circadiani³¹. Questi includono interruzioni dei normali cicli di sonno e veglia, una diminuzione dell'ampiezza dei ritmi della temperatura corporea interna e una capacità ritardata di adattarsi ai cambiamenti nella fase³¹. Uno studio, ad esempio, ha sfidato il sistema circadiano di topi adulti e anziani (20+ mesi) spostando il programma di illuminazione di 6 ore. Si è scoperto che i vecchi topi impiegavano più tempo per riportare i loro modelli di attività al nuovo programma di luce³². Coerentemente con i cambiamenti nel comportamento circadiano, l'analisi degli orologi tissutali ha rilevato che sia gli orologi dei tessuti centrali che quelli periferici erano compromessi nella coorte di invecchiamento.

Più recentemente, diversi gruppi hanno eseguito analisi trascrittomiche dell'orologio circadiano e dell'output dell'orologio in diversi tessuti all'età di³³ anni. I risultati di questi studi evidenziano che esiste una riprogrammazione su larga scala dell'output dell'orologio circadiano con l'età. Ciò significa che, anche se l'orologio centrale mantiene una funzione di temporizzazione, i geni bersaglio per l'espressione quotidiana sono in gran parte diversi. Ad esempio, due studi hanno raccolto biopsie muscolari da soggetti umani ogni 4 ore per 24 ore, i risultati hanno determinato che il picco e la depressione dell'espressione genica dell'orologio sono invertiti tra i roditori notturni e gli esseri umani diurni 34,35,36. Ciò indica che quando l'espressione del gene dell'orologio viene confrontata basandosi esclusivamente sulla fase attiva rispetto alla fase di riposo (e non alla luce rispetto al buio), i modelli di espressione del gene dell'orologio nei muscoli sono praticamente gli stessi tra le specie. Si propone che questo cambiamento associato all'età nell'output dell'orologio provochi menomazioni nella regolazione dei percorsi che includono i segni distintivi noti dell'invecchiamento, come la funzione mitocondriale, il danno e la riparazione del DNA e l'autofagia³⁷.

Logica dello studio
La connessione tra la funzione mitocondriale e il declino della funzione fisica è ben stabilita. Tuttavia, la causa alla base della disfunzione mitocondriale rimane oggetto di dibattito. Ricerche recenti suggeriscono che l'utilizzo del carburante cellulare e i ritmi circadiani possono svolgere un ruolo in questo processo. I metodi tradizionali per valutare la funzione mitocondriale, come la misurazione del consumo di ossigeno mitocondriale in un campione di biopsia muscolare, sono spesso percepiti come dolorosi e invasivi, il che può scoraggiare la partecipazione, in particolare nelle popolazioni con bassa massa muscolare, come gli adulti fragili e sarcopenici³⁸.

Date queste limitazioni, c'è bisogno di un metodo meno invasivo per valutare i cambiamenti nell'utilizzo del carburante cellulare e nel ritmo circadiano negli anziani. Questo studio mira a valutare un nuovo protocollo minimamente invasivo che può essere utilizzato per valutare il metabolismo del carburante e il ritmo circadiano in questa popolazione. I risultati di questo studio contribuiranno a una migliore comprensione dei cambiamenti legati all'età e della risposta agli interventi medici o comportamentali, fungendo da modello per futuri studi in questo campo.

Protocollo

Le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state approvate dal comitato etico della ricerca (Florida Ethics Policy 1.0104) e dall'Institutional Review Board dell'Università della Florida.

1. Funzione mitocondriale

1. Isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC)
   1. Raccogliere le PBMC utilizzando speciali provette per la raccolta del sangue da 8 ml (16 mm x 125 mm; contenenti 0,1 M di citrato di sodio anticoagulante o di sodio eparina) (vedere la Tabella dei materiali).
      NOTA: Le provette per la raccolta del sangue contengono un mezzo di separazione del sangue composto da un gel di poliestere tissotropico e da un mezzo di gradiente (vedere la Tabella dei materiali) per migliorare la separazione dei globuli bianchi.
   2. Processare le provette di preparazione cellulare da 8 mL entro 2 ore dalla raccolta per ottenere risultati validi.
   3. Miscelare le provette per il prelievo del sangue dopo averle riempite di sangue (mediante leggera inversione o su un miscelatore) e mantenerle a temperatura ambiente (RT) per un massimo di 2 ore.
   4. Centrifugare le provette per la raccolta del sangue in un rotore oscillante a 2.000 × g per 15 minuti (o equivalente a 30.000 g/min; non superare i 2.000 × g) a RT.
      NOTA: Queste provette sono più alte di una normale provetta da centrifuga da 15 mL; Pertanto, è necessario prestare particolare attenzione all'utilizzo del rotore corretto.
   5. Aspirare e gettare in un contenitore per rifiuti a rischio biologico ~80% dello strato di plasma e raccogliere lo strato cellulare dalla provetta per la raccolta del sangue (utilizzando una pipetta di trasferimento) in una provetta da centrifuga da 15 mL.
      NOTA: Quando si utilizza una provetta da 15 mL, aggiungere 7 mL di strato cellulare e riempire fino a 14 mL con soluzione fisiologica tamponata con fosfato sterile (PBS). Il rapporto tra cellule e PBS dovrebbe essere 1:1. Se necessario, utilizzare più tubi. Mescolare delicatamente invertendo.
   6. Centrifugare in un rotore oscillante a 900 × g per 5 min (o equivalente a 4.500 g-min) a RT.
   7. Senza disturbare il pellet della cella, aspirare la soluzione PBS e gettarla in un contenitore per rifiuti a rischio biologico.
   8. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno basale (BM; vedere Tabella dei materiali) triturando delicatamente. Aggiungere il BM fino a un totale di 10 ml e mescolare delicatamente capovolgendo. Eseguire un conteggio delle celle.
   9. Centrifugare la sospensione della cella in un rotore oscillante a 900 × g per 5 minuti a RT.
      NOTA: Quando le cellule vengono utilizzate lo stesso giorno per la valutazione bioenergetica, procedere al passaggio 1.1.10; Se le celle sono congelate per la conservazione, procedere al passaggio 1.1.13.
   10. Calcolare il volume del terreno di prova (AM; vedere la tabella dei materiali) per la risospensione del pellet cellulare successivo per ottenere la concentrazione cellulare desiderata.
       NOTA: Ad esempio, per una densità di semina di 150.000 cellule/pozzetto in 50 μL, la concentrazione desiderata della sospensione cellulare è di 3 milioni di cellule/mL.
   11. Senza disturbare il pellet cellulare, aspirare il surnatante e gettarlo in un contenitore per rifiuti a rischio biologico.
   12. Risospendere delicatamente il pellet cellulare in 1 mL o meno di AM. Aggiungere AM al volume totale calcolato per la concentrazione di celle desiderata. Le cellule sono ora pronte per essere seminate in una piastra di coltura cellulare rivestita (vedi Tabella dei materiali).
       NOTA: I seguenti passaggi servono per il congelamento delle celle per la conservazione (1.1.13-1.1.16) e non si applicano alla procedura in giornata.
   13. Per il congelamento delle cellule, aspirare il surnatante senza disturbare il pellet cellulare e gettarlo in un contenitore per rifiuti a rischio biologico.
   14. Risospendere delicatamente le cellule in un terreno di congelamento (vedere la Tabella dei materiali) alla concentrazione desiderata (5-10 milioni di cellule/mL). Aliquotare i volumi desiderati in crioviali etichettati.
   15. Congelare lentamente la sospensione cellulare utilizzando un contenitore di congelamento (vedere la tabella dei materiali) per almeno 4 ore o durante la notte a -80 °C.
   16. Dopo 4 ore, o la mattina successiva, trasferire i crioviali in un deposito di azoto liquido, dove dovrebbero risiedere nella fase vapore.
   17. Il giorno prima della misurazione, rivestire il fondo dei pozzetti di una micropiastra per colture cellulari (vedere Tabella dei materiali) con adesivo cellulare (vedere Tabella dei materiali). Preparare l'adesivo secondo le istruzioni del produttore, con una concentrazione consigliata di 22,4 μg/μL, diluendo il volume appropriato di soluzione madre adesiva in bicarbonato di sodio 0,1 M (pH 8,0). Applicare 25 μl di adesivo su ciascun pozzetto della micropiastra per colture cellulari.
   18. Dopo 20 minuti, aspirare il liquido rimanente da ciascun pozzetto e lavare i pozzetti due volte con 200 μL di acqua sterile e purificata. Lasciare asciugare la piastra nella cabina di biosicurezza (per ~2 ore).
   19. Avvolgere il piatto in un foglio di alluminio o metterlo in un contenitore secondario chiuso, e conservarlo in frigorifero a 4 °C.
2. Valutazione bioenergetica di PBMC con analizzatore di flusso metabolico a tempo di latenza
   NOTA: Utilizzando un analizzatore di flusso e il lettore multimodale (vedere Tabella dei materiali), sono stati determinati una densità di semina ottimale di 150.000 PBMC per pozzetto, una concentrazione finale di cianuro di carbonile-4 (trifluorometossi) fenilidrazone (FCCP) di 2 μM e una concentrazione finale di Hoechst 33342 di 4 μM (con un tempo di incubazione di almeno 20 minuti dopo l'iniezione).
   1. Per idratare le cartucce del sensore con l'hydrobooster, rimuovere la cartuccia del sensore con la piastra di utilità dalla scatola e posizionare la cartuccia "in alto" sul banco. Inserire 200 μL di calibrante (vedere la Tabella dei materiali) in ciascun pozzetto della piastra di servizio e posizionare saldamente l'hydrobooster sulla piastra di servizio, quindi la cartuccia del sensore. Ispezionare e rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate e collocare in un'incubatrice non CO₂ a 37 °C per una notte.
   2. Accendere l'analizzatore di flusso e successivamente aprire il software di analisi del saggio (vedere la tabella dei materiali). Impostare la temperatura a 37 °C. Lasciare lo strumento acceso per una notte per consentire la stabilizzazione della temperatura impostata.
      NOTA: I seguenti passaggi di programmazione (1.2.4-1.2.10) possono essere eseguiti il giorno prima o il giorno dell'esperimento
   3. Per programmare il file del software di analisi del saggio (vedere la Tabella dei materiali), aprire il modello per il test di stress ossidativo del substrato. Vai su Definizioni di gruppo, apri la scheda Strategie di iniezione , modifica il test da sforzo Inibitore + Sub Ox in Etomoxir + Test da sforzo Sub Ox e aggiungi altre due strategie di iniezione: UK5099 + Test da sforzo Sub Ox e BTPES + Test da sforzo Sub Ox. All'interno di ciascuna strategia di iniezione, all'interno della finestra Condizione di iniezione , fare clic su A per la porta A e inserire la concentrazione finale del rispettivo inibitore (Etomoxir: 4 μM; UK5099: 2 μM; BTPES: 3 μM).
   4. Fare clic su Porte B, C e D e inserire le rispettive concentrazioni finali (porta B: concentrazione di oligomicina [1,50 μM], porta C: FCCP [2,0 μM]; porta D: Rotenone + Antimicina A [0,5 μM]). Aggiungere Hoechst 33342, 4 μM alla finestra dei composti per la porta D.
   5. Apri la scheda Pretrattamenti e scegli i pretrattamenti, se applicabile. Ad esempio: Controllo, Sperimentale o Consuetudinario (ad esempio, Linea di base e Follow-up). Se necessario, aggiungi le descrizioni nella finestra sottostante.
   6. Aprire la scheda Terreni di prova e dal menu a discesa Terreni scegliere Terreno RPMI, pH 7,4, inserire il numero di lotto, il personale che prepara i terreni, il tempo di preparazione e gli integratori aggiunti ai terreni (10 mM di glucosio, 2 mM di glutammina, 1 mM di piruvato; vedere la Tabella dei materiali).
   7. Aprire la scheda Tipo di cella e immettere l'ID soggetto PBMC come nome, PBMC come tipo di cella, 150000 come densità di semina, ID soggetto come origine, il personale che ha preparato le cellule, la data di preparazione e il giorno di disgelo delle cellule, se applicabile.
   8. Fare clic su Genera gruppi, andare su Mappa piastre e assegnare i pozzetti della piastra a 96 pozzetti ai rispettivi gruppi. Mantenere i pozzetti A1, A12, H1 e H12 assegnati come pozzetti di fondo.
   9. Andare su Protocollo, selezionare la casella Equilibra (impostazione predefinita) e immettere le seguenti informazioni: Linea di base: cinque cicli di misurazione: 3 min mix, 0 min wait e 3 min measure; Fluido o inibitore (porta A): sei cicli di misurazione: 3 min di miscelazione, 0 min di attesa e 3 min di misurazione; Oligomicina (porta B): tre cicli di misurazione: 3 min di miscelazione, 0 min di attesa e 3 min di misurazione; FCCP (Porta C): tre cicli di misurazione: 3 min di miscelazione, 0 min di attesa e 3 min di misurazione; Rotenone + Antimicina A + Hoechst 33342 (Porta D): tre cicli di misurazione: 3 min di miscelazione, 0 min di attesa e 3 min di misurazione.
   10. Il giorno della valutazione bioenergetica, prelevare la micropiastra di coltura cellulare rivestita dal frigorifero e lasciarla riscaldare a RT nella cappa di biosicurezza.
   11. Preparare il terreno di coltura (AM) mescolando 97 mL di BM preriscaldato e integratori: 1 mL di piruvato (concentrazione finale: 1 mM), 1 mL di glucosio (concentrazione finale 10 mM) e 1 mL di glutammina (concentrazione finale: 2 mM). Mettere l'AM a 37 °C in un'incubatrice non contenente CO₂ fino al momento dell'uso.
   12. Per seminare le cellule, aggiungere 50 μL di sospensione cellulare (da 1.1.12) contenente 150.000 PBMC a ciascun pozzetto, ad eccezione di A1, H1, A12 e H12 (assegnati come pozzetti di fondo).
       CRITICO: La densità di semina ottimale è stata determinata in precedenza.
   13. Coprire la piastra cellulare con il coperchio e lasciare riposare 60 minuti di cellule a RT nella cabina di biosicurezza per facilitare la distribuzione uniforme delle cellule.
       CRITICO: Osservare le cellule al microscopio per garantire la distribuzione omogenea delle cellule desiderata in tutto il pozzetto.
   14. Per l'imaging cellulare, accendere il lettore multimodale (vedere la Tabella dei materiali) alcune ore prima della prima incubazione cellulare; attendere il completamento del protocollo di avvio del lettore prima di aprire il software di imaging (vedere la Tabella dei materiali). Aprire il software di imaging e impostare la temperatura di preriscaldamento a 37 °C.
   15. Per preparare i reagenti del saggio, seguire le istruzioni del kit di analisi per ricostituire i reagenti, con lievi modifiche come indicato nella Tabella 1.
       CRITICO: Le concentrazioni finali ottimali di FCCP e Hoechst33342 sono state determinate in precedenza.
   16. Dopo il riposo cellulare di 60 minuti, ispezionare i pozzetti con un microscopio per colture cellulari e prendere nota di eventuali anomalie visive, come le aggregazioni cellulari.
   17. centrifugare la piastra di coltura cellulare a RT in una centrifuga con rotore oscillante per micropiastre a 60 × g per 1 minuto, con accelerazione minima e rottura minima; Girare il piatto e centrifugare nuovamente a 40 × g per 1 min. Impostare l'accelerazione e la frenata al minimo. Incubare le cellule per 25-30 minuti a 37 °C in un incubatore non CO₂ .
       NOTA: Quando si esegue l'imaging cellulare, la piastra cellulare viene invece incubata nel lettore multimodale preriscaldato (vedere la Tabella dei materiali) e viene scattata un'immagine in campo chiaro di ciascun pozzetto durante questo periodo di incubazione (prima incubazione cellulare).
   18. Scansionare il codice a barre della piastra per colture cellulari con lo scanner di codici a barre (vedere Tabella dei materiali), selezionare Avvia scansione in campo chiaro, posizionare la piastra per colture cellulari sul vassoio della piastra e avviare la retrazione del vassoio. Selezionare i pozzetti contenenti celle per la scansione e avviare la scansione.
   19. Durante la prima incubazione cellulare, caricare le porte della cartuccia del sensore con i reagenti, come indicato nella Tabella 1: porta (A): 20 μL di AM (controlli), etomoxir (inibitore del trasporto degli acidi grassi a catena lunga nei mitocondri), UK 5099 (acido 2-ciano-3-(1-fenil-1H-indol-3-il)-2-propenoico; inibitore del vettore mitocondriale del piruvato), o BPTES (Bis-2-(5-fenilacetamido-1, 3,4-tiadiazolo-2-il)etilsolfuro; inibitore della conversione della glutammina in glutammato); porta (B): 22 μL di oligomicina (inibitore dell'ATP sintasi); porta (C): 25 μl di FCCP (disaccoppiatore di cianuro di carbonile-4 (trifluorometossi) fenilidrazone); porta (D): 27 μL di rotenone/antimicina A/Hoechst 33342 (inibitori dei complessi mitocondriali I e III, rispettivamente, e colorante nucleare). Rimettere la cartuccia del sensore nell'incubatore a 37 °C senza CO₂ per altri 5 minuti.
       NOTA: Seguire le istruzioni del produttore per il caricamento delle porte.
   20. Estrarre la piastra per colture cellulari dall'incubatore o dal lettore di piastre dopo la prima incubazione cellulare e dopo il completamento dell'imaging cellulare (se applicabile) e aggiungere AM calda a ciascun pozzetto fino a un volume finale di 180 μl per pozzetto. Porre la piastra cellulare a 37 °C in un incubatore non CO₂ per altri 15-25 minuti (seconda incubazione cellulare).
   21. Avviare il test metabolico avviando la calibrazione del sensore durante la seconda incubazione cellulare. Fare clic su Esegui test quando il test è pronto per essere avviato con la calibrazione della cartuccia del sensore. Quando richiesto, trasferire la cartuccia del sensore dall'incubatore non CO₂ a 37 °C al vassoio dell'analizzatore di flusso e avviare la calibrazione. Seguire le istruzioni del software di analisi del saggio e sostituire la piastra di utilità per la piastra cellulare al termine della calibrazione.
       NOTA: La calibrazione dura circa 20 minuti.
   22. Dopo il test metabolico, seguire le istruzioni del software e rimuovere la cartuccia del sensore e la piastra cellulare dallo strumento. Rimuovere la cartuccia del sensore dalla piastra della cella e coprire la piastra della cella con il coperchio.
   23. Dopo aver determinato il tempo di incubazione del colorante Hoechst negli esperimenti preliminari, scansionare il codice a barre della piastra e seguire le istruzioni del software per acquisire un'immagine fluorescente di ciascun pozzetto contenente cellule con il lettore multimodale.
       NOTA: Il software di imaging e analisi dei saggi è interfacciato, consentendo l'importazione dei dati della conta cellulare nel file di dati dell'analisi del saggio per la normalizzazione dei dati alla conta cellulare.

2. Espressione genica dell'orologio circadiano

NOTA: L'espressione dei geni orologio dei partecipanti dalle PBMC sarà esaminata isolando l'RNA utilizzando il kit di sangue RNA (vedi Tabella dei materiali).

1. Aspirare 3 mL di sangue del partecipante direttamente in una provetta di RNA (vedere la Tabella dei materiali) con 6 mL di reagenti stabilizzanti. Vortice per 10 s per miscelare completamente.
   NOTA: Se i reagenti stabilizzanti non vengono accuratamente miscelati con il campione di sangue del partecipante, aumenta il rischio di errore nello studio.
2. Trasferire 1,0 mL del campione di sangue stabilizzato in una provetta da 15 mL, con 5 mL di tampone per lisi eritrocitaria. Incubare con ghiaccio per 10-15 minuti. Agitare il tubo 2 volte durante l'incubazione. Centrifugare la provetta a 4 °C a 400 × g per 10 min.
3. Identificare il pellet e versare con cura il surnatante contenente globuli rossi lisati. Aggiungere 2 mL di tampone per la lisi degli eritrociti (vedere la Tabella dei materiali), risospendere le cellule, agitare brevemente e centrifugare a 400 × g per 10 minuti a 4 °C.
4. Versare il surnatante e lasciare il tubo capovolto su carta assorbente per 1-2 minuti. Tamponare il liquido intorno al bordo del tubo con carta pulita prima del passaggio successivo.
5. Aggiungere con cautela 600 μl di tampone di lisi dell'RNA (vedere la tabella dei materiali). Seguendo il protocollo del produttore, aggiungere β-mercaptoetanolo e risospendere il pellet.
6. Pipettare il lisato direttamente in un omogeneizzatore monouso di lisato cellulare (vedere la Tabella dei materiali), una colonna di centrifuga posta in una provetta di raccolta da 2 mL e centrifugare per 2 minuti alla massima velocità per omogeneizzare. Eliminare la colonna di centrifuga monouso dell'omogeneizzatore di lisato cellulare e conservare il lisato omogeneizzato.
7. Aggiungere 1 volume (600 μl) di etanolo al 70% al lisato omogeneizzato e miscelare mediante pipettaggio. Pipettare con cautela il campione, compreso l'eventuale precipitato formatosi, in una nuova colonna di centrifuga in una provetta di raccolta da 2 mL, ma non inumidire il bordo. Centrifugare per 15 s a >8.000 × g.
8. Trasferire la colonna di centrifuga (vedere la Tabella dei materiali) in una nuova provetta di raccolta da 2 mL. Applicare 700 μl di tampone di lavaggio a rigore (vedere la tabella dei materiali) sulla colonna di centrifuga e centrifugare per 15 s a >8.000 × g per il lavaggio. Scartare il flusso.
9. Aprire con cautela la colonna di centrifuga e aggiungere 500 μl di tampone di lavaggio delicato (vedere la tabella dei materiali). Chiudere il tappo e centrifugare alla massima velocità (20.000 × g) per 3 min.
10. Trasferire la colonna di centrifuga in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml e pipettare 30-50 μl di acqua priva di RNasi direttamente sulla membrana di silice. Centrifugare per 1 minuto a >8.000 × g per eluire l'RNA. Ripeti ancora una volta.
    NOTA: L'RNA può essere conservato a -80 °C.
11. Eseguire il trattamento con DNasi su una colonna utilizzando il set DNasi privo di RNasi (vedere la Tabella dei materiali), secondo il protocollo del produttore.
12. Generare cDNA utilizzando 500 ng di RNA totale e un sistema di reazione a catena della polimerasi (PCR) in tempo reale (vedi Tabella dei materiali), secondo il protocollo del produttore. Diluire tutti i campioni di cDNA 1:25 in acqua priva di RNasi e utilizzare 4 mL per eseguire la PCR quantitativa a trascrizione inversa (qRT-PCR).
13. Utilizzare un metodo di aggiunta di primer (vedere la Tabella dei materiali) per completare la qRT-PCR con 10 mM di ciascuno dei primer mostrati nella Tabella 2. Completare la qRT-PCR utilizzando un sistema in tempo reale (vedere la Tabella dei materiali).
14. Normalizzare i livelli di mRNA dei geni scelti utilizzando i livelli di mRNA di Rpl26 . Utilizzare il metodo ^2-DDCt per calcolare la quantificazione relativa.
15. Per determinare se l'espressione di un dato mRNA mostrava un'oscillazione circadiana, utilizzare un test basato sulla verosimiglianza LR_rhythmicity³⁹ (utilizzando p≤ 0,01) per rilevare la ritmicità circadiana in una condizione sperimentale⁴⁰.

3. Piano di analisi dei dati

NOTA: Verrà utilizzato un inventario medico per classificare i partecipanti in base all'uso dei farmaci⁴³.

1. Utilizzare un modello lineare a effetti misti, in cui età, sesso, peso, altezza, pressione sanguigna, frequenza cardiaca e altri fattori di rischio dovrebbero essere inclusi come covariate.
2. Dovrebbe essere incluso un termine a effetto casuale per spiegare la correlazione dei dati all'interno del soggetto.
3. Per l'adattamento del modello, è necessario implementare una selezione delle variabili a ritroso con il principio gerarchico.
4. Dal modello adattato, la misura cambia dal punto temporale 1 al punto temporale 2, date tutte le covariate nel modello adattato.

Risultati

Il protocollo proposto include dati preliminari che servono come convalida per la metodologia. Il protocollo incorpora un analizzatore di flusso metabolico in tempo reale per esaminare la funzione mitocondriale e l'utilizzo del carburante cellulare, e l'estrazione dell'RNA e la qRT-PCR per analizzare i geni del ritmo circadiano (ad esempio, BMAL1, CLOCK, Nfil2, Nr1d1, Dbp, Cry1, Per2).

Il tasso di consumo di ossigeno (OCR) di PBMC umane isolate da cinque partecipanti di controllo, 10 giorni dopo un'analisi iniziale, è presentato nella Figura 1. I dati vengono utilizzati per confrontare i valori pre e post e mostrano i valori medi per la respirazione basale, la risposta acuta, la respirazione massima e la capacità di riserva dopo l'iniezione di un controllore, etomoxir, UK5099 e BPTES. In particolare, la Figura 1C mostra una significativa risposta acuta negativa dopo l'iniezione di etomoxir, ma non sono stati osservati effetti significativi per la respirazione basale, la respirazione massima o la capacità di riserva.

Figura 1: Consumo di ossigeno di cellule mononucleate isolate del sangue periferico umano (PBMC). (A) Tasso di consumo di ossigeno in tempo reale (OCR; pmol/(min∙150.000 cellule) di PBMC isolate da un soggetto di controllo, misurato con un analizzatore di flusso e valutato con il saggio di ossidazione del substrato. Le cellule sono state seminate a una densità di 150.000 cellule/pozzetto. La prima iniezione è stata di tipo mediano (controllo) o inibitore (etomoxir, UK5099 o BPTES; vedere il testo per i dettagli) ed è avvenuta dopo aver misurato la frequenza respiratoria cellulare basale. La risposta acuta alla limitazione del substrato mitocondriale è stata determinata come la differenza dell'OCR basale prima e dopo l'iniezione dell'inibitore. L'oligomicina, l'inibitore dell'ATP sintasi, inibisce la respirazione accoppiata alla produzione di ATP e produce la respirazione con perdita di protoni. FCCP, l'uncoupler, induce la respirazione massima e non accoppiata; Il rotenone e l'antimicina A (inibitori del complesso I e III, rispettivamente) inibiscono tutta la respirazione tranne quella non mitocondriale (vedi testo per i dettagli). (B-E) Quantificazione della respirazione cellulare (n = 5; i dati sono rappresentati come media ± DS). (B) OCR basale prima dell'iniezione dell'inibitore, (C) risposta acuta all'inibitore (variazione dell'OCR rispetto alla velocità basale prima dell'iniezione dell'inibitore), (D) OCR massimale e (E) capacità di riserva (differenza tra OCR massimale e OCR basale dopo la prima iniezione). La risposta acuta (C) all'iniezione di etomoxir potrebbe suggerire una maggiore dipendenza dell'OCR dall'acido grasso come substrato energetico in condizioni basali rispetto agli altri gruppi di substrati, senza un effetto notevole sull'OCR durante un'elevata richiesta di energia (D). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Composto	AM (μL) aggiunto al composto	Scorte (μM)	stock (μL) per il materiale da lavoro	AM (μL) per materiale da lavoro	Massa lavorativa (μM)	Scorte di lavoro (μL) [porta]	Conc. finale (μM)
Etomoxir	700	160	500	1500	40	20 [A]	4
UK5099	700	80	500	1500	20	20 [A]	2
BPTES	700	120	500	1500	30	20 [A]	3
oligo	420	150	300	2700	15	22 [B]	1.5
FCCP	720	100	600	2400	20	25 [C]	2
Rot/AA/H	540	50	300	2700	5	27 [D]	0.5

Tabella 1: Preparazione dei reagenti per il test di ossidazione del substrato e concentrazioni delle soluzioni stock, di lavoro e finali. Tutti i reagenti fanno parte del test da sforzo mitoscopico cellulare o dei kit per il test da stress ossidativo del substrato. Abbreviazioni: oligo = oligomicina; FCCP = disaccoppiatore di cianuro di carbonile-4 (trifluorometossi) fenilidrazone; Rot/AA/H = rotenone/antimicina A/Hoechst 33342. Etomoxir, UK5099, BTPES: inibitori rispettivamente dell'ossidazione degli acidi grassi, del glucosio e della glutammina.

Bmal1	Avanti – GCACGACGTTCTTTTTTCTGT
	Inverso – GCAGAAGCTTTTTCGATCTGCTTTT
Orologio	Avanti – CGTCTCAGACCCTTCCTCAAC
	Inverso – GTAAATGCTGCCTGGGGA
Piangere 1	Avanti – ACTGCTATTGCCCTGTTGGT
	Rovescio – GACAGGCAAATAACGCCTGA
Per1	Avanti – ATTCGGGTTACGAAGCTCCC
	Inverso – GGCAGCCCTTTCATCCACAT
Per2	Attaccante – CATGTGCAGTGGAGCAGATTC
	Inverso – GGGGTGGTAGCGGATTTCAT
Rev-erb α	Avanti – ACAGATGTCAGCAGATGTCGC
	Retro – CGACCAAACCGAACAGCATC

Tabella 2: Primer genici dell'orologio circadiano.

Discussione

Il declino della funzione mitocondriale e la regolazione del ritmo circadiano con l'età sono sempre più visti come fattori che contribuiscono alle malattie legate all'età. L'alterazione dei ritmi circadiani attraverso modifiche dello stile di vita, come la dieta e l'attività fisica, rappresenta una potenziale strategia per promuovere un invecchiamento sano e ridurre il declino della mobilità associato all'invecchiamento. Tuttavia, gli attuali metodi per valutare direttamente la funzione mitocondriale sono invasivi e spesso richiedono una biopsia muscolare, che può porre sfide con il reclutamento e la ritenzione dei partecipanti a causa del dolore e dei rischi percepiti.

La valutazione dei marcatori di salute circadiana e metabolica attraverso metodi meno invasivi, come la raccolta del sangue, fornirebbe risultati preziosi per esplorare e testare bersagli terapeutici in studi futuri. Questi metodi minimamente invasivi hanno il potenziale per far progredire notevolmente il campo, fornendo nuove intuizioni sulla complessa interazione tra ritmo circadiano e salute metabolica e sul loro impatto sulla funzione. L'obiettivo di questo studio è valutare la relazione tra il metabolismo energetico cellulare e il ritmo circadiano. In particolare, l'analisi del flusso bioenergetico viene utilizzata per valutare la funzione mitocondriale in varie condizioni di disponibilità del substrato, insieme al monitoraggio dell'espressione genica di un gruppo di geni circadiani nei globuli bianchi dei partecipanti. Impiegando entrambi i bracci dell'analisi, bioenergetica ed espressione genica, è possibile ottenere una comprensione completa della relazione tra questi due processi fondamentali.

L'analisi statistica di questi dati di serie temporali da una prospettiva circadiana offre informazioni sulla forza, l'intervallo e la tempistica dei ritmi circadiani. In conclusione, l'integrazione dell'analisi dell'espressione genica, della bioenergetica cellulare e delle misure metaboliche a livello dell'organismo costituisce un approccio nuovo e innovativo che farà luce sull'interazione tra metabolismo energetico e ritmi circadiani nell'uomo.

In uno studio pilota, abbiamo rilevato una risposta acuta nell'OCR delle PBMC alla limitazione dell'utilizzo degli acidi grassi (dopo l'iniezione di etomoxir, un inibitore della carnitina palmitoil transferasi 1a). Questa scoperta suggerisce che nelle PBMC di questo particolare gruppo di partecipanti, potrebbe esserci una dipendenza dagli acidi grassi come substrato energetico durante la respirazione basale. Tuttavia, la respirazione massima non è stata influenzata, suggerendo che fonti di energia alternative, come il glucosio e la glutammina, possono compensare il ridotto utilizzo di acidi grassi durante l'elevata domanda di energia. Studi futuri dovrebbero indagare se a) la bioenergetica delle PBMC riflette l'energia di tutto il corpo e b) se interventi come l'alimentazione a tempo limitato potrebbero influenzare le preferenze del substrato energetico.

Ci sono diversi passaggi critici riguardanti l'analisi del flusso delle PBMC. In primo luogo, prima di valutare i campioni sperimentali, la densità di semina delle cellule (cellule per pozzetto) deve essere ottimizzata assicurandosi che vi sia una distribuzione uniforme continua delle cellule all'interno di ciascun pozzetto e su ciascuna piastra, la concentrazione finale di FCCP deve essere ottimizzata eseguendo test di concentrazione utilizzando le concentrazioni 0, 0,125, 0,25, 0,5, 1,0 e 2,0 μM, e, se applicabile, la colorazione Hoechst 33342 deve essere ottimizzata seguendo le istruzioni del produttore. In secondo luogo, la normalizzazione dei dati metabolici ai parametri cellulari è fondamentale per la comparabilità dei dati tra gli esperimenti. Nel presente protocollo, viene descritta la conta cellulare dopo la conclusione del test dell'analizzatore di flusso utilizzando cellule colorate con Hoechst 33342 e un dispositivo di imaging cellulare. Se non è disponibile un dispositivo appropriato, è possibile applicare metodi di normalizzazione alternativi, come il contenuto totale di proteine cellulari o DNA nucleare per pozzetto. C'è una modifica nota che può essere utilizzata all'interno del protocollo, rispetto a quelle che sono state proposte. In particolare, il protocollo può essere completato utilizzando un kit di test individuale per ciascuno dei tre inibitori, rispetto ai soli due kit qui proposti (vedi Tabella dei materiali).

L'uso delle PBMC come surrogato per studiare l'interazione tra metabolismo energetico e ritmi circadiani negli anziani è limitato dal presupposto che la loro risposta al trattamento possa riflettere accuratamente la risposta in altri tessuti e organi. Sebbene questo approccio sia nuovo e minimamente invasivo, è importante riconoscere che diversi tessuti e organi, come il cervello, il fegato e il muscolo scheletrico, possono reagire in modo diverso in varie condizioni. Uno studio preclinico ha dimostrato che l'espressione del gene dell'orologio era alterata nei topi alimentati e a digiuno, portando alla parziale sovraregolazione dei geni bersaglio di BMAL1 nel fegato e nel tessuto muscolare, ma alla sottoregolazione di altri⁴¹. Questi tessuti e organi periferici sono altamente rappresentativi dei processi metabolici e possono essere influenzati da segnali ambientali che influenzano i meccanismi di espressione genica dell'orologio⁴². Sono necessarie ulteriori ricerche per comprendere appieno la relazione tra i tessuti periferici, gli organi e l'orologio circadiano centrale.

Un'altra limitazione è che i partecipanti non sono esclusi dall'assunzione di alcuna prescrizione, il che potrebbe porre limitazioni all'analisi statistica. Per contrastare questa limitazione, nella ricerca futura, verrà utilizzato un inventario medico, che è stato convalidato nelle popolazioni di anziani che assumono farmaci⁴³. I partecipanti saranno classificati in base ai farmaci raccomandati registrati nella sezione di revisione dei dati del protocollo. Ci sono un totale di tre categorie, in termini di farmaci che hanno dimostrato di 1) accelerare il declino funzionale, 2) rallentare il declino funzionale e 3) influenzare la funzione del muscolo scheletrico.

Infine, la capacità ossidativa mitocondriale del muscolo scheletrico umano mostra un ritmo giorno-notte, con un picco tra le 18:00 e le 23:00 e un calo tra le 08:00 e le 11:00⁴⁴. Non è ancora chiaro se questo valga per la capacità ossidativa mitocondriale delle PBMC. Tuttavia, dati preliminari suggeriscono che le PBMC e il metabolismo mitocondriale sono correlati⁴⁵. Dato che le informazioni sulle biopsie muscolari e sulle alterazioni nelle PBMC non sono così chiare, è necessario prestare attenzione quando si analizzano i risultati. Data questa limitazione, è importante tenere a mente queste informazioni durante la valutazione e lo sviluppo di un protocollo, in quanto possono fornire un contesto e informazioni preziose che potrebbero aiutare a garantire la validità e l'efficacia del protocollo.

Per quanto ne sappiamo, nessuno studio precedente ha valutato i modelli di utilizzo del carburante o i ritmi circadiani attraverso i metodi proposti in questo progetto. Il nostro obiettivo è esaminare la reattività dei marcatori dell'utilizzo del carburante mitocondriale e della salute circadiana ai cambiamenti. Questo studio presenta un metodo minimamente invasivo per misurare un biomarcatore altamente sensibile, che può servire come alternativa in futuri studi interventistici in cui la biopsia muscolare non è fattibile.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent Technologies Cell Imaging	Agilent Technologies		Cell image software
Agilent/Seahorse Wave desktop program	Agilent Technologies	5994-0039EN	Software used to analyse data from the celluar analyser and stress test assay
Agilent/Seahorse XFe96 Flux Analyzer	Agilent Technologies	S7800B	Real-time cellular flux analyzer; flux analyser
Bar Code Reader	Agilent Technologies	G2615-90007
Seahorse Wave Desktop Software	Agilent technologies		Data acquisition software; assay analysis; wave program
Seahorse XF 1.0 M Glucose solution	Agilent Technologies	103577-100	Supplement to basal medium to make assay medium
Seahorse XF 100 mM Pyruvate solution	Agilent Technologies	103578-100	Supplement to basal medium to make assay medium
Seahorse XF 200 mM Glutamine solution	Agilent Technologies	103579-100	Supplement to basal medium to make assay medium
Seahorse XF Cell Mito Stress Test	Agilent Technologies	103015-100	Mitochondrial bioenergetic function assay
Seahorse XF Mito Fuel Flex Test	Agilent Technologies	103260-100	Mitochondrial bioenergetic function assay
Seahorse XF RPMI Medium	Agilent Technologies	103576-100	Basal medium for PBMCs
Seahorse XFe96 FluxPak mini	Agilent Technologies	102601-100	Sensor cartridges and cell culture microplates
Cytation 1 Cell Imaging Multi-Mode Reader	Agilent/BioTek		Multimode reader to image cells
CPT Sodium Heparin Tube, 16 x 125 mm x 8.0 mL	Becton Dickinson	362753	Blood collection tubes for isolation of peripheral blood mononuclear cells
CellTak Cell and Tissue Adhesive	Corning	354240	Cell adherent to coat cell culture microplate
Phosphate Buffered Saline	Corning	21-040-CV	Buffer to wash blood cells
Ficoll Paque Plus	Cytiva	GE17-1440-02	Gradient medium
Lunar Prodigy DXA scanner	General Electric	EN 60601-2-7 5.1	Whole body lean mass and fat/lean tissue mass ratio
Freezing container, Nalgene Mr. Frosty	MilliporeSigma	C1562	Freezing container used to slow-freeze cell suspension
Buffer EL.	Qiagen	79217	Erythrocyte lysis buffer
Buffer RLT	Qiagen	79216	RNA lysis buffer
Buffer RPE	Qiagen	1018013	Mild washing buffer
Buffer RW1	Qiagen	1053394	Stringent washing buffer
QIAamp DNA Micro Kit	Qiagen	56304	DNA preps: QIAamp MinElute Columns, Proteinase K, Carrier RNA, Buffers, Collection Tubes (2 ml)
QIAamp RNA Blood Mini Kit	Qiagen	52304	RNA blood kit; Used to isolate RNA
QIAshredder	Qiagen	79656	disposable cell-lysate homogenizers
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254	Used to perform DNA digest
2-Mercaptoethanol (Reagent)	Thermo Fisher Scientific	MFCD00004890
2-mL collection tubes, 100 count	Thermo Fisher Scientific	AM12480
Fast SYBR Green Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4385612	Primers are added to this and used to carry out qRT-PCR
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	Thermo Fisher Scientific	69715	Used to hold RNA purification filter during RNA purification
Narrow p1000 pipette tips	Thermo Fisher Scientific	02-707-402
QuantStudio 3 Real-Time PCR System, MiniAmp Plus Thermal Cycler, and 96-Well Plates Package	Thermo Fisher Scientific	A40393
Tempus Blood RNA Tube	Thermo Fisher Scientific	4342792	RNA Tube
Tempus Spin RNA Isolation kit	Thermo Fisher Scientific	4380204	RNA extraction and isolation