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Method Article
Qui, presentiamo un protocollo dettagliato che delinea l'uso di frammenti microvascolari isolati da roditori o tessuto adiposo umano come approccio diretto per progettare tessuto adiposo beige funzionale e vascolarizzato.
L'ingegneria del tessuto adiposo termogenico (ad esempio, tessuti adiposi beige o bruni) è stata studiata come potenziale terapia per le malattie metaboliche o per la progettazione di microtessuti personalizzati per lo screening sanitario e i test farmacologici. Le strategie attuali sono spesso piuttosto complesse e non riescono a rappresentare accuratamente le proprietà multicellulari e funzionali del tessuto adiposo termogenico. I frammenti microvascolari, piccoli microvasi intatti composti da arteriole, venule e capillari isolati dal tessuto adiposo, fungono da singola fonte autologa di cellule che consentono la vascolarizzazione e la formazione del tessuto adiposo. Questo articolo descrive i metodi per ottimizzare le condizioni di coltura per consentire la generazione di tessuti adiposi termogenici tridimensionali, vascolarizzati e funzionali da frammenti microvascolari, compresi i protocolli per l'isolamento di frammenti microvascolari da tessuto adiposo e condizioni di coltura. Inoltre, vengono discusse le migliori pratiche, così come le tecniche per caratterizzare i tessuti ingegnerizzati e vengono forniti i risultati dei campioni da frammenti microvascolari sia di roditori che umani. Questo approccio ha il potenziale per essere utilizzato per la comprensione e lo sviluppo di trattamenti per l'obesità e le malattie metaboliche.
L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere un approccio per lo sviluppo di tessuto adiposo beige vascolarizzato da una singola fonte potenzialmente autologa, il frammento microvascolare (MVF). I tessuti adiposi marroni e beige hanno dimostrato di mostrare proprietà benefiche legate alla regolazione metabolica; Tuttavia, il piccolo volume di questi depositi di tessuto adiposo negli adulti limita il potenziale impatto sul metabolismo sistemico, in particolare in condizioni malate come l'obesità o il diabete di tipo 2 1,2,3,4,5,6,7. C'è un significativo interesse per il grasso marrone / beige come bersaglio terapeutico per prevenire gli effetti metabolici dannosi legati all'obesità e alle sue comorbidità 8,9,10,11,12.
Gli MVF sono strutture vascolari che possono essere isolate direttamente dal tessuto adiposo, coltivate e mantenute in una configurazione tridimensionale per lunghi periodi di tempo13,14,15. Il lavoro precedente del nostro gruppo, e di altri, ha iniziato a sfruttare la capacità multicellulare e multipotente degli MVF, in particolare per quanto riguarda la formazione del tessuto adiposo16,17,18. Come conclusione di questo lavoro, abbiamo recentemente dimostrato che gli MVF derivati da modelli di roditori di diabete sano e di tipo 219 e da soggetti umani (adulti di età superiore ai 50 anni)20 contenevano cellule in grado di essere indotte a formare tessuto adiposo termogenico o beige.
Ecco un approccio innovativo da cui viene utilizzato un MVF da una singola fonte, non solo in grado di creare tessuto adiposo beige ma anche la sua componente vascolare associata e critica21. L'uso di questa tecnica potrebbe essere di grande valore per gli studi che cercano un approccio semplice di ingegneria tissutale per la formazione del tessuto adiposo termogenico. A differenza di altri metodi che aspirano a progettare il tessuto adiposo beige 22,23,24,25,26,27,28, il processo descritto in questo studio non richiede l'uso di più tipi di cellule o complessi regimi di induzione. I modelli di grasso beige e bianco vascolarizzati possono essere creati con MVF provenienti da fonti di roditori e umani, dimostrando un grande potenziale di traduzione. Il prodotto finale di questo protocollo è un tessuto adiposo termogenico beige ingegnerizzato con una struttura e una funzione metabolica paragonabili al tessuto adiposo bruno. Nel complesso, questo protocollo presenta l'idea che una fonte facilmente accessibile e possibilmente autologa MVF possa essere un utile intervento terapeutico e uno strumento per studiare i disturbi metabolici.
Questo studio è stato condotto in conformità con la legge sul benessere degli animali e i regolamenti di attuazione sul benessere degli animali in conformità con i principi della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università del Texas a San Antonio.
NOTA: Per i passaggi descritti di seguito, vengono utilizzati ratti Lewis maschi. Lievi aggiustamenti del protocollo devono essere effettuati per una femmina, così come la raccolta di frammenti microvascolari di topo (MVF)29. Per i protocolli che utilizzano MVF umani (h-MVF), gli unici passaggi richiesti sono la risospensione degli h-MVF seguendo il protocollo del produttore, la preparazione dei terreni di crescita (1.3), la formazione di idrogel di fibrina (5) e la coltura (6). Per una panoramica del protocollo, vedere la Figura 1.
Figura 1: Schema sperimentale. Suddivisione di sei fasi chiave, prima dell'analisi, per la formazione di tessuto adiposo termogenico utilizzando MVF. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
1. Preparazione del reagente
NOTA: I reagenti riportati di seguito corrispondono a un ratto, pesato e realizzato all'interno di una biocappa.
2. Preparazione di utensili/materiali
NOTA: Tutta la strumentazione deve essere sterilizzata in autoclave prima dell'uso.
3. Protocollo di isolamento del grasso
Figura 2: Isolamento di diversi depositi di tessuto adiposo. (A) Incisioni iniziali necessarie per l'escissione del tessuto adiposo inguinale. B) Ubicazione del deposito di grasso inguinale. (C) Posizione del deposito di grasso epididimale, notando l'incisione della pelle esterna necessaria per l'accesso. (D) Ulteriori incisioni necessarie una volta che i topi sono inclini ad accedere al grasso aggiuntivo. (E) Posizione del deposito adiposo sottocutaneo posteriore. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
4. Protocollo di isolamento del frammento microvascolare
Figura 3: Isolamento degli MVF . (A) Dopo la digestione del tessuto adiposo, rappresentazione della separazione di MVF contenenti pellet e surnatante a seguito di uno spin-down. (B) Disposizione delle forniture per la filtrazione e l'intrappolamento degli MVF. (C) Illustrazione del metodo del cerchio concentrico per le fasi di filtrazione/lavaggio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
5. Formazione di idrogel di fibrina
Figura 4: Formazione di gel di fibrina MVF . (A) Una miscela di trombina in 5/7 parti viene pipettata nel pozzetto corrispondente. (B) Successivamente, con una punta di pipetta tagliata (per non disturbare gli MVF), una miscela di fibrinogeno + MVF in 2/7 parti viene pipettata nel pozzetto e delicatamente miscelata. (C) Infine, tutti i gel completati vengono inseriti in un incubatore a 37 °C, consentendo all'idrogel di solidificarsi completamente prima che il mezzo sia posizionato sopra. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
6. Condizioni di coltura degli MVF
Figura 5: Tempistica per la formazione di tessuto adiposo non vascolarizzato. Questa cifra è stata modificata da Acosta et al.19. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Tempistica per la formazione del tessuto adiposo vascolarizzato. Questa cifra è stata modificata da Acosta et al.19. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Ci sono alcune caratteristiche morfologiche fenotipiche chiave del tessuto adiposo beige / marrone: è multiloculare / contiene piccole goccioline lipidiche, possiede un gran numero di mitocondri (la ragione del suo aspetto tipicamente "brunastro" in vivo), ha corrispondentemente un alto tasso di consumo di ossigeno / bioenergetica mitocondriale, è altamente vascolarizzato, ha aumentato la lipolisi / assorbimento di glucosio stimolato dall'insulina e, più notoriamente, esprime alti livelli di proteina disacco...
Il campo dell'ingegneria del tessuto adiposo marrone / beige è in gran parte immaturo 22,23,24,25,26,27,28, con la maggior parte dei modelli adiposi sviluppati per il tessuto adiposo bianco 8,22,31...
Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.
Il Dr. Acosta è supportato dalle sovvenzioni del National Institutes of Health CA148724 e TL1TR002647. Il Dr. Gonzalez Porras è supportato dal National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases del National Institutes of Health, con il numero di premio F32-0DK122754. Questo lavoro è stato supportato, in parte, dal National Institutes of Health (5SC1DK122578) e dall'Università del Texas presso il Dipartimento di Ingegneria Biomedica di San Antonio. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. Le figure sono state parzialmente create con Biorender.com.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Aminocaproic Acid | Sigma Aldrich | A2504-100G | Added in DMEM at the concentration of 1 mg/mL |
Blunt-Tipped Scissors | Fisher scientific | 12-000-172 | Sterilize in autoclave |
Bovin Serum Albumin (BSA) | Millipore | 126575-10GM | Diluted in PBS to 4 mg/mL and 1 mg/mL |
Collagenase Type 1 | Fisher scientific | NC9633623 | Diluted to 6 mg/mL in BSA 4 mg/mL, Digestion of minced fat |
Dexamethasone | Thermo Scientific | AC230302500 | Diluted in ethanol at a 2 mg/ml stock concentration |
Disposable underpads | Fisher scientific | 23-666-062 | For fluid absorption during surgery |
Dissecting Scissors | Fisher scientific | 08-951-5 | Sterilize in autoclave |
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM) | Fisher scientific | 11885092 | |
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F12) | Sigma Aldrich | D8062 | |
Fetal Bovine Serum | Fisher scientific | 16140089 | Added in DMEM to 20% v/v. |
Fibrinogen | Sigma Aldrich | F8630-25G | Solubilized in DMEM at the concentration of 20 mg/mL, Protein found in blood plasma and main component of hydrogel |
Flask, 250 mL | Fisher scientific | FB500250 | Allows for digestion of fat using a large surface area |
Forceps | Fisher scientific | 50-264-21 | Sterilize in autoclave, For handling of tissue and filters |
Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | Diluted in ethanol at a 10 mM stock concentration |
Human MVF | Advanced Solutions Life Scienes, LLC | https://www.advancedsolutions.com/microvessels | Human MVFs (hMVFs) isolated from three different patients (52-, 54-, and 56-year old females) were used in the current study. |
Indomethacine | Sigma Aldrich | I7378 | Diluted in ethanol at a 12.5 mM stock concentration |
Insulin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | I5523 | Diluted in 0.01 N HCl at a 5 mg/ml stock concentration |
MycoZap | Fisher scientific | NC9023832 | Added in DMEM to 0.2% w/v, Mycoplasma Prophylactic |
Pennycilin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher scientific | 15140122 | Added in DMEM to 1% v/v. |
Petri dishes, polystyrene (100 mm x 15 mm). | Fisher scientific | 351029 | 3 for removal of blood vessels and mincing, 8 (lid) for presoaking of screens & 8 (dish) for use when filtering with 500 or 37 µM screens |
Petri dishes, polystyrene (35 mm x 10 mm). | Fisher scientific | 50-202-036 | For counting fragments |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Fisher scientific | 14-190-250 | Diluted to 1x with sterile deionized water. |
Rat Clippers (Andwin Mini Arco Pet Trimmer) | Fisher scientific | NC0854141 | |
Rosiglitazone | Fisher scientific | R0106200MG | Diluted in DMSO at a 10 mM stock concentration |
Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | 1 for initial incision, 1 for epididymal incision, 1 for tip clipping |
Screen 37 µM | Carolina Biological Supply Company | 652222R | Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Fragment entrapment and removal of very small fragments/single cells and debris |
Screen 500 µM | Carolina Biological Supply Company | 652222F | Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Removes larger fragments/debris |
Serrated Hemostat | Fisher scientific | 12-000-171 | Sterilize in autoclave, For clamping of skin before incision |
Steriflip Filter 0.22 μm | Millipore | SE1M179M6 | |
Thrombin | Fisher scientific | 6051601KU | Diluted in deionzed water to 10 U/mL, Used as a clotting agent turning fibrinogen to fibrin |
Thyroid hormone (T3) | Sigma Aldrich | T2877 | Diluted in 1N NaOH at a 0.02 mM stock concentration |
Zucker diabetic fatty (ZDF) rats - obese (FA/FA) or lean (FA/+) male | Charles River | https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611 | Obtained from Charles River (Wilmington, MA). Rats were acquired at 4 weeks of age and fed Purina 5008 until euthanasia (15-19 weeks of age). Glucose levels (blood from the lateral saphenous vein) were greater than 300 mg/dL in all FA/FA rats used in the study. All animals were housed in a temperature-controlled environment with a 12-h light-dark cycle and fed ad libitum. |
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