Una determinazione della dissoluzione in vitro di componenti multi-indice nella medicina tibetana Rhodiola granuli

Riepilogo

Qui, testiamo la dissoluzione dei granuli di Rhodiola (RG) in vitro, disegniamo curve di dissoluzione di salidroside, acido gallico e gallato di etile in acqua ultrapura e adattiamo le curve a diversi modelli matematici. Questo protocollo fornisce informazioni e indicazioni per studi di bioequivalenza in vivo e di correlazione in vivo-in vitro di RG.

Abstract

La composizione della medicina tibetana Rhodiola granuli (RG) è complessa e la qualità complessiva di RG è difficile da determinare. Pertanto, stabilire un metodo per determinare la dissoluzione in vitro multicomponente di RG è di grande importanza per il controllo di qualità. Questo studio utilizza il secondo metodo a pale della quarta regola generale 0931 della Farmacopea cinese (edizione 2020), conforme all'apparato 2 della Farmacopea degli Stati Uniti (USP). L'apparato di dissoluzione è stato impostato su una velocità di rotazione di 100 giri / min con acqua ultrapura come mezzo di dissoluzione. Un volume campione di 1 mL è stato raccolto in ogni punto temporale. Inoltre, la dissoluzione cumulativa di acido gallico, salidroside e acido etilgallico in RG in diversi punti temporali è stata determinata mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). Infine, le curve di dissoluzione sono state disegnate e le curve sono state adattate alle equazioni di GompertzMod, Gompertz, Logistic e Weibull. I risultati hanno mostrato che la dissoluzione cumulativa dell'acido gallico in RG era superiore all'80% a 1 minuto, la dissoluzione cumulativa di salidroside e acido etilgallico era superiore al 65% a 5 minuti e la dissoluzione cumulativa di ciascun componente indice diminuiva dopo 30 minuti. Il raccordo della curva ha dimostrato che l'equazione di GompertzMod era il modello più adatto per ogni componente dell'indice di RG. In conclusione, il metodo di test di dissoluzione descritto in questo protocollo è semplice, accurato e affidabile. Può caratterizzare il comportamento di dissoluzione delle componenti dell'indice in RG in vitro, che fornisce un riferimento metodologico per il controllo di qualità di RG e la valutazione della qualità di altri composti etnici.

Introduzione

In Cina, la prevalenza delle malattie cardiovascolari continua ad aumentare e i tassi di morbilità e mortalità delle malattie cardiovascolari sono al primo posto tra i residenti cinesi¹. L'angina pectoris della malattia coronarica è causata da stenosi luminale dovuta all'aterosclerosi coronarica, che porta a un apporto di sangue coronarico relativamente insufficiente e ischemia miocardica e ipossia². Negli ultimi anni, l'effetto curativo della medicina tradizionale cinese nel trattamento della malattia coronarica è stato riconosciuto da molti medici³.

La medicina tradizionale cinese svolge un ruolo importante nell'alleviare i sintomi clinici e migliorare la qualità della vita dei pazienti⁴. I granuli di Rhodiola (RG) vengono estratti e raffinati dalla pianta medicinale dell'altopiano tibetano Rhodiola rosea L. I componenti principali di RG sono salidroside, rodiosina e flavonoidi ^5,6. RG ha l'effetto di integrare Qi⁷ e attivare e promuovere la circolazione sanguigna per alleviare il dolore. Clinicamente, è usato per trattare le ostruzioni toraciche causate da carenza di Qi e stasi del sangue, malattia coronarica, angina pectoris⁸. La sola determinazione del contenuto non riflette pienamente la qualità intrinseca dei farmaci, poiché sia la disintegrazione che la dissoluzione in vitro possono influenzare la biodisponibilità e l'efficacia dei farmaci ^9,10. I metodi di ispezione per la dissoluzione della medicina cinese includono il metodo del cesto rotante, il metodo della pagaia e il metodo della piccola tazza. Lo svantaggio del metodo del cestello rotante è che solo la parte esterna del cestello rotante entra in contatto con il mezzo di dissoluzione durante la rotazione, il che non riflette il comportamento di dissoluzione del mondo reale. Il metodo della pagaia può superare la carenza di cui sopra, il che lo rende più adatto del metodo del cesto per alcuni preparati solidi della medicina cinese¹¹. Al momento, non esiste alcun rapporto sull'analisi di dissoluzione in vitro di RG. Al fine di controllare la qualità della RG in modo più completo, è stato studiato il comportamento di dissoluzione dei tre componenti dell'indice (acido gallico, salidroside ed etilgallato) nella RG. Questo studio fornisce dati per il controllo di qualità di RG e un riferimento metodologico per la valutazione della qualità di altri preparati composti etnici.

Protocollo

1. Preparazione della soluzione

1. Preparare la soluzione madre della sostanza di riferimento: pesare separatamente 10,6 mg di salidroside, 5,24 mg di acido gallico e 5,21 mg di acido etilgallico su una bilancia analitica elettronica e aggiungerli singolarmente in un matraccio tarato da 5 ml. Quindi, aggiungere metanolo di grado HPLC per sciogliere e diluire a 5 ml. Infine, agitare bene per ottenere la soluzione madre della sostanza di riferimento con concentrazioni di massa rispettivamente di 2,120 mg/ml, 1,048 mg/ml e 1,042 mg/ml.
   NOTA: La soluzione madre della sostanza di riferimento contiene 2,120 mg/ml di salidroside, 1,048 mg/ml di acido gallico e 1,042 mg/ml di gallato di etile come soluzione madre di ciascuna soluzione nella curva standard successiva.
2. Preparare la soluzione del campione di prova. Estrarre 2,8 g di RG (Table of Materials) con 10 mL di metanolo di grado HPLC utilizzando una macchina per la pulizia ad ultrasuoni (potenza: 200 W, frequenza: 40 kHz) per 30 minuti, quindi filtrarla con un filtro da 0,22 μm per il test di adattabilità del sistema.
3. Preparare una soluzione di riferimento mista contenente 0,590 mg/ml di salidroside, 2,030 mg/ml di acido gallico e 1,930 mg/ml di gallato di etile.
   NOTA: Ogni standard (2,950 mg di salidroside, 10,150 mg di acido gallico e 9,650 mg di acido etilgallico) viene sciolto in un matraccio tarato da 5 mL in metanolo di grado HPLC come mezzo di dissoluzione.
4. Ottenere il contenuto teorico di ogni componente caratteristico di RG per l'estrazione di acqua ultrapura.
   1. Mettere 2,8 g di RG in un matraccio conico da 500 mL, aggiungere 200 mL di acqua ultrapura ed estrarre ad ultrasuoni (Potenza: 200 W, frequenza: 40 kHz) per 60 min. Quindi, filtrarlo con un filtro da 0,22 μm.
   2. Determinare il contenuto della soluzione di prova in base all'equazione lineare ottenuta nel seguente esperimento.

2. Stato cromatografico

1. Impostare le condizioni cromatografiche come mostrato nella Tabella 1 per la cromatografia liquida ad alte prestazioni. Per i dettagli sullo strumento utilizzato, fare riferimento alla Tabella dei materiali.

3. Test di adattabilità del sistema

1. Esaminate la relazione lineare.
   1. Diluire le soluzioni madre di riferimento di acido gallico e gallato di etile di 5, 10, 25, 50 e 125 volte e le soluzioni madre di riferimento di salidroside di 2, 4, 8, 16 e 32 volte per ottenere la soluzione di concentrazione del gradiente per disegnare una curva standard.
      NOTA: Regolare il rapporto di diluizione della curva standard in base all'esperimento preliminare del trattamento del campione. Nell'esperimento preliminare, le soluzioni stock dei tre standard sono state prima diluite 5, 10, 25, 50 e 125 volte, quindi è stata tracciata la prima curva standard. Tuttavia, quando è stata rilevata la concentrazione del campione in esame, si è constatato che le concentrazioni di salidroside non rientravano nell'intervallo lineare di questa curva standard e, pertanto, le concentrazioni sono state adeguate per includerle nella curva. In sintesi, gli esperimenti preliminari di cui sopra sono stati utilizzati per determinare le concentrazioni finali di diluizione dei tre campioni di prova per studi sperimentali successivi.
2. Test di precisione: iniettare 10 μL della soluzione di riferimento mista nel sistema HPLC sei volte al giorno ed eseguire i campioni con le stesse condizioni HPLC descritte al punto 2.1. Registrare l'area di picco di ciascun componente della feature.
3. Esperimenti di prova di stabilità: iniettare 10 μL della soluzione campione preparata e determinare le aree di picco dell'HPLC in base alle condizioni cromatografiche dopo 0 h, 6 h, 10 h, 12 h, 14 h, 16 h, 18 h, 20 h e 24 h, rispettivamente.
   NOTA: Le aree di picco vengono registrate automaticamente dal sistema HPLC.
4. Prova di riproducibilità: prelevare sei campioni dello stesso lotto di RG per preparare la soluzione campione di prova secondo il metodo indicato al punto 1.2. Iniettare 10 μL di ciascun campione nel sistema HPLC. Eseguire gli esempi come descritto nel passaggio 2.1 e determinare la riproducibilità.
   NOTA: La ripetibilità è stata valutata confrontando le differenze di concentrazione tra i sei campioni.
5. Esperimento di recupero
   1. Preparare sei porzioni dello stesso lotto di RG per la soluzione di prova. Quindi, aggiungere circa il 50% della sostanza di riferimento di ciascun componente indice nella soluzione di prova per calcolare il tasso di recupero. Eseguire questi esempi nel sistema HPLC con le stesse condizioni descritte nel passaggio 2.1.
   2. Calcola il tasso di recupero.
      NOTA: Tasso di recupero = (C - A) / B x 100, dove A è la quantità di componente da misurare nella soluzione di prova, B è la quantità di sostanza di riferimento aggiunta e C è il valore misurato della soluzione contenente la sostanza di riferimento e il campione RG. Fare riferimento al punto 2.1 per le condizioni cromatografiche per eseguire i passaggi precedenti (ad esempio, i passaggi 3.1-3.5).

4. Test di dissoluzione in vitro

1. Effettuare il test di dissoluzione utilizzando il metodo della pagaia del secondo metodo della regola generale 0931 della Farmacopea cinese (edizione 2020)¹².
   NOTA: Tecnica e attrezzatura di campionamento: L'apparato di dissoluzione del farmaco (tabella dei materiali) ha una tazza di dissoluzione, una pagaia, un sistema di controllo della temperatura e un sistema di regolazione della velocità. Prima di iniziare l'esperimento di dissoluzione, l'acqua viene preriscaldata a una temperatura impostata, quindi viene impostata la velocità corrispondente. Inizia a registrare l'ora immediatamente dopo aver aggiunto RG.
2. Aggiungere 100 ml di acqua ultrapura nel bicchiere di dissoluzione dell'apparecchio di dissoluzione del farmaco e mantenere la temperatura a 37 °C ± 0,5 °C. Impostare la velocità di rotazione su 100 giri/min.
   NOTA: L'apparecchio di dissoluzione è dotato di un dispositivo di riscaldamento che consente di impostare la temperatura all'interno dell'impianto. Non vi è stata alcuna differenza significativa nel tasso di dissoluzione del salidroside in acqua, succo gastrico artificiale (16,4 ml di acido cloridrico diluito [234 ml di acido cloridrico concentrato diluito a 1000 ml con acqua] con circa 800 ml di acqua e 10 g di pepsina, ben agitato e diluito con acqua a 1.000 ml) e succo intestinale artificiale (tampone fosfato [pH 6,8] contenente tripsina)¹³. L'acqua più facilmente disponibile (ultrapura) è stata selezionata come mezzo di dissoluzione.
3. Aggiungere 2,8 g di RG in una tazza di dissoluzione e iniziare immediatamente a registrare la durata della dissoluzione. Raccogliere un totale di 1 mL del campione con un iniettore (vedere Tabella dei materiali) a 1 min, 5 min, 10 min, 20 min, 30 min e 60 min, e portare immediatamente il volume nel bicchiere di dissoluzione con il mezzo di dissoluzione alla stessa temperatura.
   NOTA: La provetta di campionamento nel bicchiere di dissoluzione non può raccogliere piccoli volumi di campione, quindi l'iniettore viene utilizzato per raccogliere il campione. I campioni devono essere raccolti rapidamente per evitare di perdere i punti temporali di raccolta specificati.
4. Filtrare immediatamente i campioni raccolti attraverso una membrana microporosa da 0,22 μm e prelevare il successivo filtrato. Determinare il contenuto di ciascun componente in ogni punto temporale mediante HPLC (come da passaggio 2.1) e calcolare la dissoluzione cumulativa.
   1. Per calcolare la dissoluzione cumulativa, calcolare la dissoluzione di ciascun punto temporale (X_n):
      X_n = A / B x 100, dove A è la quantità di componenti misurata in ciascun punto temporale e B è il contenuto teorico di ciascun componente.
   2. Quindi, calcola la dissoluzione cumulativa (Y):
      Y = X n + (X 1 + ... + X _n-1) x V 2 / V 1, dove V₁ è il volume totale del mezzo di dissoluzione e V ₂ è il volume di soluto aggiunto dopo ogni campionamento.
      NOTA: A causa dei bassi valori di risposta del salidroside e dell'acido gallico nel cromatogramma, la dissoluzione cumulativa di salidroside e gallato di etile al punto temporale di 1 minuto non è stata tracciata nella curva di dissoluzione.

5. Adattamento del modello di dissoluzione

1. Importare i dati cumulativi di dissoluzione in ogni punto temporale nel software di analisi dei dati.
2. Utilizzare il plug-in di analisi della dissoluzione dei farmaci nel software di analisi dei dati per adattare l'equazione GompertzMod, l'equazione di Gompertz, l'equazione logistica e l'equazione di Weibull¹⁴. Maggiore è il valore di R², migliore è l'effetto di adattamento della curva.
   1. Avviare il software, selezionare la finestra Book1 per accedere alla finestra Origin Data Editing .
   2. Nella prima colonna A(X)-Long Name input Time, definire Time come time e immettere ogni tempo di determinazione della dissoluzione. Immettere i dati nella seconda colonna B(Y)-Nome lungo, definire i dati come la dissoluzione cumulativa, immettere la percentuale di dissoluzione cumulativa di ciascun tempo di determinazione della dissoluzione.
   3. Dopo aver inserito i dati, selezionare le colonne A(X) e B(Y), selezionare il plug-in Analisi della dissoluzione dei farmaci nella barra dei menu del software e fare clic su Fit Dissolution Data > Concatenate Fit > OK. Il software genera i risultati di montaggio di ogni modello.

Risultati

In questo studio, la precisione, la stabilità, la ripetibilità e il recupero del campione di RG erano tutti all'interno dell'intervallo metodologico specificato nella Farmacopea cinese (Volume 4, 2020)¹², indicando che il metodo era fattibile. Dopo ripetuti debug, è stato determinato che il gradiente di eluizione utilizzato in questo studio aveva una buona risoluzione (Figura 1) per le tre componenti dell'indice in RG. Le tre componenti dell'indice in RG avevano un...

Discussione

Il test di dissoluzione è un metodo ideale in vitro per simulare la disintegrazione e la dissoluzione di preparati orali solidi nel tratto gastrointestinale¹⁵. È un indice importante per valutare e controllare la qualità delle preparazioni orali solide. Pertanto, il test di dissoluzione svolge un ruolo essenziale nello sviluppo di preparati orali di farmaci solidi¹⁶. In particolare, con lo sviluppo della tecnologia di controllo della qualità della medicina trad...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chromatographic column	ZORBAX Eclipse	XDB-C18	4.6 mm x 250 mm, 5 µm
Drug dissolution tester	Shanghai Huanghai Pharmaceutical Inspection Instrument Co., Ltd.	RCZ-6B3
Electronic analytical balance	Shanghai Liangping Instruments Co., Ltd.	FA1004
Ethyl gallate (HPLC, ≥98%)	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DSTDM006301
Function drawing software	OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA	2022
Gallic acid (HPLC, ≥98%)	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DSTDM000802
High performance liquid chromatography	Agilent Technologies Singapore (International) Pte. Ltd.	Agilent 1260 Infinity
HPLC grade methanol	Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd.	216565
Injector	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instrument Co., Ltd.	0.7 (22 G)
Millipore filter	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd	φ13 0.22 Nylon66
Rhodiola granules	Tibet Nodikang Pharmaceutical Co., Ltd.	210501
Salidroside (HPLC, ≥98%)	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DST200425-037
Ultra pure water systemic	Merck Millipore Ltd.	Milli-Q
Ultrasonic cleansing machine	Ningbo Xinyi Ultrasonic Equipment Co., Ltd	SB-8200 DTS