Progettazione e realizzazione di un modello di perfusione polmonare ex vivo di ratto

Riepilogo

I polmoni ex vivo sono utili per una varietà di esperimenti per raccogliere dati fisiologici escludendo le variabili confondenti degli esperimenti in vivo. Le configurazioni commerciali sono spesso costose e limitate nei tipi di dati che possono raccogliere. Descriviamo un metodo per costruire una configurazione completamente modulare, adattabile a vari progetti di studio.

Abstract

I preparati polmonari ex vivo sono un modello utile che può essere tradotto in molti campi di ricerca diversi, integrando i corrispondenti modelli in vivo e in vitro. I laboratori che desiderano utilizzare polmoni isolati devono essere consapevoli dei passaggi importanti e delle sfide intrinseche per stabilire una configurazione che sia conveniente, affidabile e che possa essere facilmente adattata per adattarsi all'argomento di interesse. Questo articolo descrive un modello fai-da-te (fai da te) per la ventilazione e la perfusione polmonare di ratto ex vivo per studiare gli effetti di farmaci e gas sul tono vascolare polmonare, indipendentemente dai cambiamenti nella gittata cardiaca. La creazione di questo modello include a) la progettazione e la costruzione dell'apparato e b) la procedura di isolamento polmonare. Questo modello si traduce in una configurazione più conveniente rispetto alle alternative commerciali e tuttavia sufficientemente modulare da adattarsi ai cambiamenti in specifiche domande di ricerca. È stato necessario risolvere vari ostacoli per garantire un modello coerente che possa essere utilizzato per una varietà di argomenti di ricerca diversi. Una volta stabilito, questo modello ha dimostrato di essere altamente adattabile a diverse domande e può essere facilmente modificato per diversi campi di studio.

Introduzione

Le tecniche di perfusione polmonare ex vivo (EVLP)¹ hanno visto un aumento dell'uso nell'ultimo decennio come mezzo per studiare i trapianti di polmone², l'ischemia/riperfusione³, il metabolismo polmonare⁴ e le risposte immunitarie⁵. I polmoni isolati, ma intatti, ventilati e perfusi offrono la capacità di valutare direttamente la risposta dei polmoni, compresa la vascolarizzazione polmonare, a potenziali interventi e/o terapie senza potenziali fattori confondenti, come l'input neuronale e ormonale o la modifica dell'emodinamica in vivo. Allo stesso tempo, mantengono l'interazione fisiologica tra ventilazione e perfusione, in contrasto con le condizioni in vitro. Una proposta che esamina le risposte immunitarie nei polmoni⁵, ad esempio, necessita della stessa qualità dei dati di uno studio incentrato sull'aumento della dimensione^del pool di donatori 6 per i trapianti di polmone. EVLP può essere utilizzato in una varietà di specie, tra cui topi³, ratti 7,8,9,10,11,12, maiali ¹³ e esseri umani 2. Pertanto, è necessario stabilire un modello in grado di produrre dati affidabili da una varietà di parametri sperimentali diversi. La rilevanza clinica sarà generata negli studi successivi utilizzando il modello EVLP come strumento.

Sebbene le configurazioni commerciali siano disponibili per l'acquisto per la maggior parte delle specie, spesso possono essere proibitive in termini di costi e limitare i ricercatori a una marca specifica di apparecchiature e software proprietario. Qualsiasi deviazione dalla configurazione predefinita (ad esempio, il passaggio da una specie all'altra) richiede lungimiranza e lavorare intorno alla configurazione fornita, il che può rivelarsi difficile o impossibile. Di seguito, viene descritta una configurazione fai-da-te (fai da te) per polmoni isolati di ratto che è sia modulare che economica, nonché la procedura chirurgica per isolare i polmoni.

Protocollo

La parte in vivo degli esperimenti (dall'anestesia generale all'eutanasia) richiede l'approvazione preventiva del rispettivo Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC). Tutte le procedure qui descritte sono state approvate (numero di protocollo M1700168) dall'IACUC presso il Vanderbilt University Medical Center, Nashville, Tennessee, e sono state eseguite in conformità con le linee guida ARRIVE¹⁴. Prima della sperimentazione, tutti i ratti erano ospitati nella struttura di cura degli animali dell'istituto, con libero accesso ad acqua e cibo. Includendo diversi studi al di fuori dell'ambito di questo manoscritto, abbiamo utilizzato un totale di 148 ratti maschi Sprague Dawley, di 7-10 settimane, con un peso compreso tra 250 g e 400 g finora.

1. Costruzione di apparecchi

NOTA: Tutte le parti, compresi i rispettivi produttori, sono elencate nella Tabella dei materiali.

1. Per tenere in posizione ogni apparecchiatura, costruire un reticolo su misura per consentire una facile configurazione e incorporazione dei nuovi dispositivi (Figura 1). Attacca i pali di alluminio (da 1 a 2 piedi di lunghezza, 1 cm di diametro, disponibili in qualsiasi negozio di ferramenta) l'uno all'altro utilizzando morsetti a croce per creare un reticolo 3D e posizionali su un vassoio di plastica (30 pollici x 21 pollici) per evitare fuoriuscite di liquidi.
2. Montare i trasduttori di pressione ad un'altezza uguale ai polmoni e collegarli alle linee per l'arteria polmonare (PA), la vena polmonare (PV) e al tubo di ventilazione.
   NOTA: Questi trasduttori trasmettono i dati ai rispettivi bioamplificatori collegati al sistema di acquisizione dati (DAQ) e al suo software.
3. Piuttosto che utilizzare cannule disponibili in commercio, è possibile creare cannule personalizzate (Figura 2) da segmenti di tubo di plastica dura larghi 2 mm che sono svasati all'estremità, utilizzando una fiamma libera per consentire la legatura sicura delle suture. Piegali a forma di U per ridurre lo stress sui polmoni durante l'impiccagione e per adattarli alla camera polmonare.
4. Per realizzare la camera in cui i polmoni devono essere ventilati e perfusi, posizionare un becher da 1.000 mL all'interno di un becher da 1.500 mL con un bagno d'acqua tra i due e all'interno del becher da 1.000 mL, creando una doppia caldaia. Posizionare questi becher su una piastra riscaldante impostata a 48 °C, creando una camera per i polmoni umida e resistente alle fluttuazioni di temperatura.
5. Conservare il tampone per l'esperimento in un matraccio tarato da 150 mL posto su una piastra riscaldante regolata a 37 °C. Utilizzare una barra di agitazione magnetica per far circolare il tampone all'interno del becher. Impostare il menisco del tampone ad un'altezza tale che si trovi a 4 cm sopra il polmone, per creare una pressione innata di 4 cmH₂O sul PV. Durante l'intervento chirurgico, assicurarsi che i polmoni dell'animale siano alla stessa altezza del tampone per ridurre la formazione di edema idrostatico.
   NOTA: L'uso di un pallone riduce al minimo la quantità di superficie a contatto con l'aria ambiente, riducendo al minimo la diffusione del gas.
6. Utilizzare una pompa a rulli per spostare il tampone attraverso un circuito costituito da una serpentina di riscaldamento e una trappola d'aria prima di perfondere il polmone. Riciclare l'effluente del PV nel matraccio tarato. Collegare sia la serpentina di riscaldamento che il sifone ad un bagnomaria di ricircolo anch'esso impostato a 37 °C. Regolare la temperatura del bagnomaria in base alla velocità della pompa, in modo che il perfusato abbia una temperatura costante di 37 °C.

2. Procedura

1. Prima dell'inizio dell'esperimento, preparare la configurazione.
   1. Assicurarsi che il software sia in esecuzione (vedere di seguito) e che i dati vengano raccolti correttamente.
   2. Calibrare quotidianamente tutti i trasduttori di pressione per assicurarsi che non vadano alla deriva.
   3. Preparare il tampone (vedere la Tabella 1 per gli ingredienti di una soluzione fisiologica salina con albumina sierica bovina al 4% [BSA]) e assicurarsi che il pH sia a 7,4, utilizzando l'HCl per regolare di conseguenza. Installare il sistema di perfusione con tampone riscaldato (Tabella 1) che circola dappertutto, assicurandosi che non siano presenti bolle d'aria. Aggiungere BSA almeno 30 minuti prima dell'inizio dell'esperimento per dargli il tempo sufficiente per dissolversi. In assenza di un ossigenatore, far bollire il gas nel tampone di perfusione prima dell'aggiunta di BSA con una composizione gassosa del 65% di N₂, 30% di O₂ e 5% di CO₂ per imitare i livelli di CO₂ dei polmoni in vivo . Ciò impedisce alla soluzione di formare schiuma una volta aggiunto il BSA.
   4. Preparare l'area operatoria con tutti gli strumenti chirurgici, le suture e il nastro adesivo necessari. Inclinare la scheda operatoria con un angolo di 15°, in modo che il ratto anestetizzato possa essere posizionato con la testa sollevata rispetto al resto del corpo e che la trachea e il blocco cuore-polmone possano essere manipolati facilmente.
   5. Indossando adeguati dispositivi di protezione individuale, pesare il ratto e somministrare un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital (65 mg/^kg-1). Dopo 10 minuti, utilizzare un pizzico per le dita dei piedi per assicurarsi che il piano chirurgico dell'anestesia generale sia stato raggiunto. Somministrare più anestetico se necessario.
2. Trasferisci il ratto nell'area operativa e fissalo alla tavola operatoria fissando separatamente le zampe anteriori, seguite dalle zampe posteriori insieme, assicurandoti che le zampe anteriori siano abbastanza larghe da consentire la visualizzazione di un riflesso del dolore nel caso in cui l'anestesia non sia abbastanza profonda (Figura 3A).
3. Fissare la testa del ratto fissando la bocca con un nastro adesivo con una striscia lunga e sottile dietro i denti anteriori, senza limitare la lingua o il flusso d'aria per il ratto che respira ancora spontaneamente (Figura 3B).
4. Eseguire una tracheostomia pizzicando la pelle sopra la trachea usando una pinza e tagliando con le forbici chirurgiche. Usando una pinza curva, seziona senza mezzi termini il muscolo e il tessuto per raggiungere la trachea. Assicurarsi che non ci siano sanguinamenti durante questo passaggio.
   1. Passare le pinze curve sotto la trachea e aprirle per lasciare spazio per far passare le suture 3-0 sottostanti che possono poi essere pre-legate in un nodo a scatola (Figura 3B). Praticare una piccola incisione tra gli anelli di cartilagine della trachea e inserire la cannula tracheale (ago modificato da 18 G con tubo di 1 mm di diametro incollato attorno alla punta per creare una tacca). Legare la sutura, assicurandosi che l'aria non possa fuoriuscire dall'incisione tracheale e che la cannula non metta a dura prova la trachea.
5. Impostare il ventilatore in modo che funzioni con una miscela di gas del 30% di O₂, 5% di CO₂ e 65% di N₂, con un volume corrente (VT) di 10 ml/kg, una pressione positiva di fine espirazione (PEEP) di 0 cmH₂O e una frequenza di 60 respiri/min.
6. Una volta che la cannula tracheale è fissata con la sutura, iniziare a ventilare il ratto con le impostazioni di cui sopra.
   NOTA: Il metodo chirurgico utilizzato è stato adattato da Nelson et ^al.9 ed è descritto passo dopo passo.
7. Rimuovere il pelo dall'addome del ratto usando grandi forbici chirurgiche e pinze.
   NOTA: Gli unguenti depilatori possono essere utilizzati anche prima dell'inizio dell'esperimento.
8. Tenendo premuto il processo xifoideo con una pinza, praticare una piccola incisione orizzontale sotto le costole, assicurandosi che il diaframma rimanga intatto. Una volta che gli organi interni possono essere visualizzati in sicurezza, allargare il taglio orizzontale per esporre l'intero diaframma.
9. Prestando la massima attenzione per evitare di perforare i polmoni, iniettare eparina (3.000 U/^kg-1) nella vena cava inferiore (IVC) con una siringa da 22 G.
10. Ancora una volta, tieni il processo xifoideo con una pinza e taglia cranialmente lungo lo sterno visualizzando costantemente i polmoni per evitare di tagliarli.
11. Per vedere correttamente il blocco cuore-polmone, allargare la gabbia toracica usando due grandi pinze e assicurarsi di evitare di rompere le costole, che possono provocare un frammento osseo tagliente che perfora il polmone (Figura 3C).
    NOTA: Una volta aperta la gabbia toracica, utilizzare una PEEP di 2-3 cmH₂O, impostata da un blocco d'acqua attaccato al ramo espiratorio del ventilatore, per evitare l'atelettasia.
12. A questo punto, tagliare l'IVC per sopprimere il ratto mediante dissanguamento. Assicurarsi attentamente che sia trascorso almeno 1 minuto dall'iniezione di eparina (vedere punto 2.9) per darle il tempo sufficiente per circolare e prevenire la formazione di microcoaguli nei polmoni.
13. Quando si posizionano le cannule di perfusione, controllare costantemente le pressioni per assicurarsi che non si verifichino cambiamenti improvvisi.
    NOTA: Un improvviso picco di pressione mentre la pompa funziona a velocità costante indica la formazione di un blocco, mentre una diminuzione improvvisa può indicare una perdita.
14. Tagliare il timo in eccesso per consentire una più facile visualizzazione del sistema vascolare polmonare. Individua il PA, passa una piccola pinza curva sotto e passa di nuovo una sutura 3-0 sotto e pre-lega in un nodo a scatola.
15. Praticare una piccola incisione nel ventricolo destro del cuore e inserire la cannula PA (realizzata con un tubo di plastica di 2 mm di diametro svasato all'estremità utilizzando una fiamma libera per consentire di legare i punti di sutura), essendo delicato per evitare di rompere l'arteria adiacente. Fissare la cannula utilizzando la sutura e il perfuso, a partire da 1,5 mL/^min-1 (Figura 3D).
16. Asportare immediatamente l'apice del cuore per evitare un accumulo di pressione nei polmoni. Utilizzando una pinza piccola e curva, rompere la valvola mitrale e assicurarsi visivamente che la pinza sia in grado di entrare nell'atrio sinistro senza restrizioni.
17. Posizionare una sutura 3-0 pre-legata attorno al cuore sotto l'atrio (Figura 3E).
18. Inserire la cannula PV (struttura simile alla cannula PA) nell'atrio sinistro e assicurarsi che il tampone possa fuoriuscire prima di legare la sutura.
    NOTA: È fondamentale che la cannula PV sia posizionata oltre la valvola mitrale per garantire che possa essere legata correttamente, senza essere posizionata troppo in profondità da danneggiare il PV o ingombrare il flusso (Figura 3E). Prestare particolare attenzione alla legatura della sutura, poiché legarla troppo allentata provoca una perdita di flusso, mentre legarla troppo stretta può danneggiare il cuore, indebolendo il posizionamento della cannula e causando potenzialmente perdite.
19. Tagliare il tessuto in eccesso tra la cavità toracica e l'incisione della tracheostomia usando le forbici a punta smussata per evitare di danneggiare la trachea. Assicurarsi che l'intera trachea sotto la cannula tracheale e l'intero blocco cuore-polmone siano visibili.
20. Rimuovere il blocco cuore-polmone e la trachea tenendo la cannula tracheale e asportando il tessuto connettivo dietro la trachea con un paio di forbici curve a punta smussata, lasciando l'esofago attaccato per un ulteriore supporto strutturale (Figura 3F).
21. Aumentare gradualmente la portata fino a un flusso massimo di 40 mL/^kg-1/^min-1. Lasciare che i primi 50 mL di tampone fuoriescano dal sistema per rimuovere eventuali citochine infiammatorie che possono essere rilasciate (Figura 3G).
22. Spostare delicatamente i polmoni isolati nella camera a bagnomaria creata con i due becher. Assicurarsi che la cannula PA, PV o tracheale non si attorciglino in nessun punto mentre si muovono i polmoni o li si appende.
    NOTA: La prevenzione dell'atelettasia durante il prelievo polmonare e il collegamento al setup è importante, soprattutto quando l'EVLP viene utilizzato per polmoni già danneggiati o quando sono pianificati interventi prima dell'EVLP. Ciò può essere ottenuto, ad esempio, con una piccola clip sulla trachea dopo l'inspirazione prima del trasferimento al ventilatore¹⁵.

3. Acquisizione dati

1. Per la raccolta dei dati, utilizzare qualsiasi convertitore analogico/digitale e sistema DAQ disponibile in commercio.
2. Prestare attenzione che la frequenza di campionamento sia sufficiente per lo scopo indicato (200 Hz qui) e che tutti i parametri dipendenti rilevanti dai bioamplificatori e da altri dispositivi di input vengano raccolti contemporaneamente (pressione delle vie aeree, PA e pressione PV scelte per questo protocollo)¹⁶.
3. Registrare parametri indipendenti (ad esempio, velocità di perfusione, velocità di ventilazione, composizione del gas ventilato, composizione dell'elettrolita tampone e peso polmonare).

Risultati

Dopo 10 minuti di stabilizzazione e letture di base, abbiamo randomizzato un primo set di 10 ratti Sprague Dawley maschi in cinque piccoli gruppi: ischemia globale senza flusso per 5, 7,5, 8, 9 o 10 minuti (n = 2 per gruppo) seguita da riperfusione; Questi esperimenti preliminari limitati di determinazione della dose sono stati condotti per identificare il tempo di ischemia più lungo possibile per consentire ancora una ventilazione e una riperfusione sufficienti prima dell'eventuale sviluppo di un aumento precipitoso e ...

Discussione

Più di 100 esperimenti sono stati eseguiti con successo nel nostro laboratorio utilizzando questa configurazione. Il design modulare di questa configurazione personalizzata ha dato grande flessibilità a potenziali cambiamenti nei requisiti sperimentali. Mentre altre configurazioni utilizzano un deossigenatore¹⁸ per imitare il consumo costante di ossigeno e la produzione di CO₂ da parte degli organi terminali, questo modello semplificato non utilizzava questa caratteristica, a causa de...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,000 mL Glass Beaker	Pyrex, Chicago, IL
1,500 mL Glass Beaker	Pyrex, Chicago, IL
Air Trap Compliance Chamber	Radnoti	130149
Bioamplifiers	CWE Inc	BPM-832
Clamps	Fisher Scientific	S02626
DAQ (Data Acquisition)	National Instruments, Austin, TX	NI USB-6343
Gas Mixer	CWE Inc, Ardmore, PA	GSM-4
Heating Coil	Radnoti, Covina, CA	158822
Heating Plate	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	11-100-49SH
Heparin	Pfizer	W63422
LabVIEW Full Development System 2014	National Instruments
Pentobarbital	Diamondback Drugs	G2270-0235-50
pH700 Probe	OAKTON, Vernon Hills, IL	EW-35419-10
Polystat Water Bath	Cole-Parmer	EW-12121-02
Rodent Ventilator	Harvard Apparatus, Holliston, MA	Model 683
Roller Pump	Cole-Parmer, Wertheim, Germany	Ismatec REGLO Digital MS 2/8
Sprague Dawley Rat	Charles River, Wilmington, MA	Strain code 001
VetScan i-STAT	Abraxis, Chicago, IL	i-STAT 1