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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo studia gli effetti protettivi della platycodin D sulla steatosi epatica non alcolica in un modello in vitro indotto dall'acido palmitico.

Abstract

L'incidenza della steatosi epatica non alcolica (NAFLD) è aumentata a un ritmo allarmante in tutto il mondo. Platycodon grandiflorum è ampiamente usato come etnomedicina tradizionale per il trattamento di varie malattie ed è un tipico alimento funzionale che può essere incorporato nella dieta quotidiana. Gli studi hanno suggerito che il platycodin D (PD), uno dei principali ingredienti attivi di Platycodon grandiflorum, ha un'elevata biodisponibilità e mitiga significativamente il progresso della NAFLD, ma il meccanismo sottostante di questo non è ancora chiaro. Questo studio mira a studiare l'effetto terapeutico del PD contro la NAFLD in vitro. Le cellule AML-12 sono state pretrattate con acido palmitico (PA) da 300 μM per 24 ore per modellare la NAFLD in vitro. Quindi, le cellule sono state trattate con PD o non hanno ricevuto alcun trattamento PD per 24 ore. I livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono stati analizzati utilizzando la colorazione con 2′,7′-dicloro-diidro-fluoresceina diacetato (DCFH-DA) e il potenziale della membrana mitocondriale è stato determinato dal metodo di colorazione JC-1. Inoltre, i livelli di espressione proteica di LC3-II/LC3-I e p62/SQSTM1 nei lisati cellulari sono stati analizzati mediante western blotting. È stato riscontrato che il PD riduce significativamente i livelli di ROS e di potenziale della membrana mitocondriale nel gruppo trattato con PA rispetto al gruppo di controllo. Nel frattempo, il PD ha aumentato i livelli di LC3-II / LC3-I e diminuito i livelli di p62 / SQSTM1 nel gruppo trattato con PA rispetto al gruppo di controllo. I risultati hanno indicato che il PD ha migliorato la NAFLD in vitro riducendo lo stress ossidativo e stimolando l'autofagia. Questo modello in vitro è uno strumento utile per studiare il ruolo del PD nella NAFLD.

Introduzione

Platycodon grandiflorus (PG), che è la radice essiccata di Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC., è usato nella medicina tradizionale cinese (MTC). Viene prodotto principalmente nelle regioni nord-est, nord, est, centro e sud-ovest della Cina1. I componenti PG includono saponine triterpenoidi, polisaccaridi, flavonoidi, polifenoli, glicoli polietilenico, oli volatili e minerali2. PG ha una lunga storia di essere usato come alimento e una medicina a base di erbe in Asia. Tradizionalmente, questa erba è stata usata per fare medicina contro le malattie polmonari. La farmacologia moderna fornisce anche prove dell'efficacia della PG per il trattamento di altre malattie. Gli studi hanno dimostrato che PG ha un effetto terapeutico su una varietà di modelli di danno epatico indotti da farmaci. L'integrazione alimentare di estratti di PG o platycodin può migliorare l'obesità indotta dalla dieta ricca di grassi e le sue malattie metaboliche correlate 3,4,5. I polisaccaridi da PG possono essere utilizzati per il trattamento del danno epatico acuto causato da LPS/D-GalN nei topi6. Inoltre, le saponine dalle radici di PG migliorano la steatoepatite non alcolica (NASH) indotta dalla dieta ricca di grassi7. Inoltre, la platycodin D (PD), uno dei componenti terapeutici più importanti della PG, può migliorare l'espressione del recettore delle lipoproteine a bassa densità e l'assorbimento delle lipoproteine a bassa densità nelle cellule del carcinoma epatocellulare umano (HepG2)8. Inoltre, il PD può anche indurre apoptosi e inibire l'adesione, la migrazione e l'invasione nelle cellule HepG2 9,10. Pertanto, in questo studio, le cellule AML-12 dell'epatoma di topo vengono utilizzate per la costruzione di modelli in vitro e per studiare ulteriormente gli effetti farmacologici e i meccanismi sottostanti del PD in questo modello.

Il termine steatosi epatica non alcolica (NAFLD) si riferisce a un gruppo di malattie del fegato che include steatosi semplice, NASH, cirrosi e carcinoma epatocellulare11. Sebbene la patogenesi della NAFLD non sia completamente compresa, dalla classica teoria "two-hit" all'attuale teoria "multiple-hit", la resistenza all'insulina è considerata centrale nella patogenesi della NAFLD12,13,14. Gli studi hanno dimostrato che la resistenza all'insulina negli epatociti potrebbe portare ad un aumento degli acidi grassi liberi, che formano trigliceridi che si depositano nel fegato e causano il fegato a diventare grasso15,16. L'accumulo di grasso può portare a lipotossicità, disfunzione mitocondriale indotta da stress ossidativo, stress del reticolo endoplasmatico e rilascio di citochine infiammatorie, con conseguente patogenesi e progressione della NAFLD17,18. Inoltre, l'autofagia svolge anche un ruolo nella patogenesi della NAFLD, in quanto è coinvolta nella regolazione della sensibilità cellulare all'insulina, del metabolismo lipidico cellulare, del danno degli epatociti e dell'immunità innata 19,20,21.

Una varietà di modelli animali e modelli cellulari sono stati stabiliti per fornire una base per esplorare la patogenesi e potenziali bersagli terapeutici di NAFLD22,23. Tuttavia, i singoli modelli animali non possono imitare completamente tutti i processi patologici della NAFLD24. Le differenze individuali tra gli animali portano a diverse caratteristiche patologiche. L'utilizzo di linee cellulari epatiche o epatociti primari in studi in vitro di NAFLD garantisce la massima coerenza nelle condizioni sperimentali. La disregolazione del metabolismo lipidico epatico può portare a livelli più elevati di accumulo di goccioline lipidiche epatocitarie nella NAFLD25. Gli acidi grassi liberi come l'acido oleico e l'olio di palma sono stati utilizzati nel modello in vitro per imitare la NAFLD causata da una dieta ricca di grassi26,27. La linea cellulare di epatoblastoma umano HepG2 è spesso utilizzata nella costruzione di modelli NAFLD in vitro, ma, come linea cellulare tumorale, il metabolismo delle cellule HepG2 è significativamente diverso da quello delle cellule epatiche in normali condizioni fisiologiche28. Pertanto, l'utilizzo di epatociti primari o epatociti primari di topo per costruire il modello NAFLD in vitro per lo screening farmacologico è più vantaggioso rispetto all'utilizzo di linee cellulari tumorali. Confrontando l'esame sinergico degli effetti dei farmaci e dei bersagli terapeutici sia in modelli animali che in modelli di epatociti in vitro, sembra che l'utilizzo di epatociti murini per costruire il modello NAFLD in vitro abbia un migliore potenziale applicativo.

Gli acidi grassi liberi che entrano nel fegato vengono ossidati per produrre energia o immagazzinati come trigliceridi. Significativamente, gli acidi grassi liberi hanno una certa lipotossicità e possono indurre disfunzione cellulare e apoptosi12. L'acido palmitico (PA) è l'acido grasso saturo più abbondante nel plasma umano29. Quando le cellule nel tessuto non adiposo sono esposte ad alte concentrazioni di PA per lungo tempo, questo stimola la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e provoca stress ossidativo, accumulo lipidico e persino apoptosi30. Pertanto, molti ricercatori usano la PA come induttore per stimolare le cellule del fegato a produrre ROS e, quindi, costruire il modello di steatosi epatica in vitro e valutare gli effetti protettivi di alcuni principi attivi sulle cellule31,32,33,34. Questo studio introduce un protocollo per studiare gli effetti protettivi del PD su un modello cellulare di NAFLD indotto da PA.

Protocollo

Le cellule AML-12 (una normale linea cellulare di epatociti di topo) sono utilizzate per gli studi basati sulle cellule. Le celle sono ottenute da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).

1. Pretrattamento delle cellule AML-12 per modellare la NAFLD in vitro

  1. Mantenere le cellule in normali terreni di coltura cellulare (DMEM più F12 [1:1] di prosciutto contenente 0,005 mg/ml di insulina, 5 ng/mL di selenio, 0,005 mg/mL di transferrina, 40 ng/mL di desametasone e 10% di siero fetale bovino [FBS], vedi Tabella dei materiali) a 37 °C in atmosfera umidificata con il 5% di CO2.
  2. Seminare le cellule in piastre da 12 pozzetti (1 mL/pozzetto) con una densità di 2,8 x 105 celle/pozzetto.
    NOTA: Tutte le operazioni di digestione cellulare e di scambio medio vengono eseguite in un armadio di biosicurezza per evitare la contaminazione delle cellule.
  3. Rimuovere il terreno di coltura delle cellule dopo l'incubazione notturna (~ 10 h), quindi lavare le cellule due volte con 1 ml di terreno privo di siero (per pozzetto).
  4. Dividere la piastra cellulare a 12 pozzetti in quattro diversi gruppi di trattamento da sinistra a destra, tra cui (1) il gruppo di controllo, (2) il gruppo trattato con PD, (3) il gruppo trattato con PA e (4) il gruppo trattato con PA + PD.
    NOTA: Tre repliche di ciascun gruppo di trattamento sperimentale sono disposte dall'alto verso il basso sulla stessa piastra cellulare a 12 pozzetti.
  5. Aggiungere il terreno di coltura cellulare normale (1 mL/pozzetto) al gruppo di controllo e al gruppo trattato con PD e aggiungere il terreno di coltura cellulare normale (1 mL/pozzetto) integrato con 300 μM di PA al gruppo trattato con PA e PA + PD.
  6. Rimuovere il terreno di coltura delle cellule dopo 24 ore di incubazione, quindi lavare le cellule con 1 ml di terreno privo di siero (per pozzetto) due volte.
  7. Aggiungere al gruppo di controllo terreni di coltura cellulare normali (1 ml/pozzetto) integrati con un veicolo (dimetilsolfossido, DMSO, 0,1% v/v); aggiungere terreni di coltura cellulare normali (1 mL/pozzetto) integrati con 1 μM PD al gruppo trattato con PD; aggiungere terreni di coltura cellulare normali (1 mL/pozzetto) integrati con 300 μM PA al gruppo trattato con PA; aggiungere terreni di coltura cellulare normali (1 mL/pozzetto) integrati con 300 μM PA e 1 μM PD al gruppo trattato PA + PD.
  8. Dopo l'incubazione per ulteriori 24 ore, studiare gli effetti protettivi del PD sulle cellule utilizzando la colorazione con 2′,7′-dicloro-diidro-fluoresceina diacetato (DCFH-DA) (fase 2), colorazione JC-1 (fase 3) e western blotting (fase 4).
    NOTA: Tutte le operazioni di incubazione vengono effettuate a 37 °C in atmosfera umidificata con il 5% di CO2.

2. Misurazione della variazione della produzione di ROS

NOTA: I livelli intracellulari di ROS nelle cellule sono valutati sulla base del test di colorazione DCFH-DA.

  1. Alla fine del periodo di trattamento (fase 1.8), lavare le cellule con 1 mL di soluzione salina tamponata fosfato per pozzetto (1x PBS, pH 7,4) tre volte, quindi colorare le cellule con 100 μL di 10 μM DCFH-DA per pozzetto (vedere Tabella dei materiali). Incubare le cellule al buio per 30 minuti.
    NOTA: Se non si osserva alcuna fluorescenza verde evidente dopo 30 minuti di incubazione, il tempo di incubazione della sonda e delle cellule può essere opportunamente aumentato (30-60 min). Se si osserva una sovraesposizione del valore di fluorescenza verde dopo 30 minuti di incubazione, il tempo di incubazione della sonda e delle cellule può essere opportunamente ridotto (15-30 min).
  2. Lavare le celle con 1x PBS (1 ml / pozzetto) tre volte. Aggiungere 1 mL di 1x PBS a ciascun pozzetto.
  3. Posizionare la piastra a 12 pozzetti sul palco del microscopio (vedi Tabella dei materiali), quindi utilizzare un obiettivo 20x per osservare la morfologia delle cellule (ingrandimento: 200x).
  4. Acquisire tre immagini di fluorescenza rappresentative (ingrandimento: 200x) per ciascun pozzetto al microscopio a fluorescenza utilizzando il canale fluorescente verde con una lunghezza d'onda di eccitazione di 480 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 530 nm.
    NOTA: Il canale fluorescente verde con una lunghezza d'onda di eccitazione di 480 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 530 nm è raccomandato per rilevare il DCFH-DA. Inoltre, DCFH-DA può essere rilevato con le impostazioni dei parametri per GFP e FITC nel microscopio a fluorescenza35,36.
  5. Infine, elaborare le immagini con un software di acquisizione delle immagini (vedere Tabella dei materiali), quindi utilizzare il software ImageJ per calcolare l'intensità media di fluorescenza di ciascun gruppo o i rapporti dei diversi gruppi.
    NOTA: I dettagli tecnici del microscopio a fluorescenza e del software Image J utilizzati per il lavoro di imaging sono stati descritti in precedenza37,38.

3. Misurazione della variazione del potenziale di membrana mitocondriale

NOTA: I cambiamenti nel potenziale della membrana mitocondriale sono monitorati dal test di colorazione JC-1.

  1. Alla fine del periodo di trattamento (fase 1.8), lavare le cellule con 1 mL di 1x PBS per pozzetto tre volte, quindi colorare le cellule con 100 μL di 5 μg/mL di soluzione di lavoro JC-1 (vedere Tabella dei materiali) per 30 minuti a 37 °C al buio.
    NOTA: Se non si osserva alcuna fluorescenza verde evidente dopo 30 minuti di incubazione, il tempo di incubazione della sonda e delle cellule può essere opportunamente aumentato (30-60 min). Se si osserva una sovraesposizione del valore di fluorescenza verde dopo 30 minuti di incubazione, il tempo di incubazione della sonda e delle cellule può essere opportunamente ridotto (15-30 min).
  2. Lavare le celle con 1x PBS (1 ml / pozzetto) tre volte. Aggiungere 1 mL di 1x PBS a ciascun pozzetto.
  3. Posizionare la piastra a 12 pozzetti sullo stadio del microscopio, quindi utilizzare un obiettivo 20x per osservare la morfologia delle cellule (ingrandimento: 200x).
  4. Cattura tre immagini di fluorescenza rappresentative (ingrandimento: 200x) per ciascun pozzetto sul microscopio a fluorescenza utilizzando il canale fluorescente verde con lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione di 485 nm e 535 nm, rispettivamente, e il canale fluorescente rosso con lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione di 550 nm e 600 nm, rispettivamente.
    NOTA: Il canale fluorescente verde con una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 535 nm viene utilizzato per rilevare il monomero JC-1, che viene trattato come mitocondri depolarizzati 39,40,41, e il canale fluorescente rosso con una lunghezza d'onda di eccitazione di 550 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 600 nm viene utilizzato per rilevare il dimero JC-1, che viene trattato come mitocondri polarizzati 39,40,41.
  5. Infine, elaborare le immagini con il software di acquisizione delle immagini, quindi utilizzare il software Image J per calcolare l'intensità media di fluorescenza di ciascun gruppo o i rapporti dei diversi gruppi.
    NOTA: I dettagli tecnici del microscopio a fluorescenza e del software Image J utilizzati per il lavoro di imaging sono stati descritti in precedenza37,38.

4. Misurazione dei livelli di espressione proteica di LC3-II/LC3-I e p62/SQSTM1

  1. Dopo il trattamento (fase 1.8), lavare le celle tre volte con 1x PBS (1 mL/pozzetto) preraffreddato a 4 °C.
  2. Aggiungere tampone di lisi RIPA (100 μL/pozzetto) integrato con proteasi e un cocktail inibitore della fosfatasi (1x) (vedere Tabella dei materiali) alla piastra a 12 pozzetti e lisare su ghiaccio per 5 minuti.
  3. Raccogliere il lisato cellulare in provette da microcentrifuga da 1,5 ml e centrifugare a 12.000 x g per 20 minuti a 4 °C. Determinare la concentrazione proteica dei surnatanti con il metodo BCA seguendo le procedure standard42.
  4. Aggiungere il buffer di caricamento del campione SDS-PAGE (5x, vedere la tabella dei materiali) ai surnatanti di lisato cellulare (rapporto volume = 1:4).
  5. Mescolare per vortice (ad alta velocità per ~ 15 s) e riscaldare i campioni miscelati a 100 ° C per 5 minuti per denaturare la proteina.
  6. Inserire il gel SDS-PAGE al 12% ben preparato nel serbatoio di elettroforesi, quindi aggiungere il tampone di up-sample SDS (1x) diluito con acqua ultrapura nella posizione limite di altezza.
    NOTA: Il gel SDS-PAGE viene preparato utilizzando un kit commerciale (vedi Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
  7. Aggiungere il marcatore proteico (5 μL/pozzetto) e i campioni (20 μg/pozzetto) in diversi pozzetti del gel SDS-PAGE.
  8. Impostare la modalità di tensione stabile a 100 V ed eseguire l'elettroforesi per 80 minuti.
  9. Dopo l'elettroforesi SDS-PAGE, effettuare l'elettrotrasferimento delle proteine su una membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF) (0,45 μM, vedi Tabella dei materiali) seguendo i rapporti precedentemente pubblicati43,44.
  10. Dopo l'elettrotrasferimento delle proteine, lavare la membrana PVDF con 10 mL di TBST (1x TBS, 0,1% Tween 20) due volte (5 min/tempo) in uno shaker a temperatura ambiente.
  11. Bloccare la membrana PVDF con 5 ml di albumina sierica bovina (BSA, 5%) in uno shaker a temperatura ambiente per 1 ora.
  12. Lavare la membrana PVDF con 10 ml di TBST tre volte (10 min/tempo). Quindi, incubare la membrana PVDF in 5 mL degli anticorpi primari specifici diluiti in tampone bloccante per LC3 (mouse mAb, 1:2.000), p62/SQSTM1 (di seguito denominato p62, mouse mAb, 1:2.000) e β-actina (mouse mAb, 1:2.000) (vedi Tabella dei materiali) per una notte a 4 °C.
  13. Lavare la membrana PVDF con 10 ml di TBST tre volte (10 min/tempo) a temperatura ambiente. Quindi, incubare la membrana PVDF con anticorpo secondario IgG (HRP) anti-topo di coniglio diluito in tampone bloccante (1:10.000) (vedi Tabella dei materiali) a temperatura ambiente e al riparo dalla luce per 2 ore.
  14. Lavare la membrana PVDF con 10 ml di TBST tre volte (10 min/tempo) a temperatura ambiente. Quindi, posizionare la membrana PVDF sull'involucro di plastica, aggiungere una quantità appropriata di soluzione di lavoro ECL (200 μL/membrana) (vedere Tabella dei materiali) e incubare per 2 minuti.
  15. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di lavoro ECL ed esporre la membrana PVDF nel sistema di imaging per lo sviluppo dell'immagine. Infine, utilizzare il software Image J per analizzare i valori di grigio di ciascuna banda.
    NOTA: I dettagli tecnici del western blotting e del software Image J utilizzati per il lavoro di imaging sono stati descritti in precedenza45,46.

5. Analisi statistica

  1. Presentare i dati degli esperimenti come media ± deviazione standard (SD).
  2. Eseguire l'analisi di significatività con lo strumento software statistico descritto in precedenza47.
  3. Calcola le differenze statistiche tra i due gruppi usando un t-test. Un valore P inferiore a 0,05 è considerato statisticamente significativo: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,005.

Risultati

ROS intracellulari nelle cellule
Le cellule AML-12 sono state indotte con 300 μM PA per 24 ore ed è stato stabilito un modello di cellule NAFLD. Successivamente, le cellule sono state trattate con PD per 24 ore. Le cellule sono state etichettate con una sonda fluorescente DCFH-DA e la produzione di ROS è stata osservata al microscopio a fluorescenza. I risultati della colorazione DCFH-DA dei ROS intracellulari nelle cellule sono mostrati in Figura 1. I risultati hanno ...

Discussione

Gli studi hanno evidenziato il fatto che la NAFLD è una sindrome clinicopatologica, che va dal fegato grasso alla NASH, che può progredire verso la cirrosi e il cancro al fegato51. Una dieta ricca di grassi e uno stile di vita inattivo sono fattori di rischio tipici per la NAFLD. Sono state studiate sia terapie non farmacologiche che terapie farmacologiche per il trattamento della NAFLD51,52,53. Tuttavi...

Divulgazioni

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Questo lavoro è supportato da sovvenzioni della Commissione per la scienza e la tecnologia di Chongqing (cstc2020jxjl-jbky10002, jbky20200026, cstc2021jscx-dxwtBX0013 e jbky20210029) e della China Postdoctoral Science Foundation (n. 2021MD703919).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
5% BSA Blocking BufferSolarbio, Beijing, ChinaSW3015
AML12 (alpha mouse liver 12) cell lineProcell Life Science&Technology Co., Ltd, ChinaAML12
Beyo ECL PlusBeyotime, Shanghai, ChinaP0018S
Bio-safety cabinetEsco Micro Pte Ltd, SingaporeAC2-5S1 A2 
cellSensOlympus, Tokyo, Japan1.8
Culture CO2 IncubatorEsco Micro Pte Ltd, SingaporeCCL-170B-8
DexamethasoneBeyotime, Shanghai, ChinaST125
Dimethyl sulfoxideSolarbio, Beijing, ChinaD8371
DMEM/F12Hyclone, Logan, UT, USASH30023.01
Foetal Bovine SerumHyclone, Tauranga, New ZealandSH30406.05
Graphpad softwareGraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA8.0
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L)ABclonal, Wuhan, ChinaAS003
Hydrophobic PVDF Transfer MembraneMerck, Darmstadt, GermanyIPFL00010
Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100×Beyotime, Shanghai, ChinaC0341
MAP LC3β AntibodySanta Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., LtdSC-376404
Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1Solarbio, Beijing, ChinaM8650
Olympus Inverted Microscope IX53Olympus, Tokyo, JapanIX53
Palmitic AcidSigma, GermanyP0500
Penicillin-Streptomycin Solution (100x)Hyclone, Logan, UT, USASV30010
Phenylmethanesulfonyl fluorideBeyotime, Shanghai, ChinaST506
Phosphate Buffered SolutionHyclone, Logan, UT, USABL302A
Platycodin DChengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, ChinaCSA: 58479-68-8
Protease inhibitor cocktail for general use, 100xBeyotime, Shanghai, ChinaP1005
Protein MarkerSolarbio, Beijing, ChinaPR1910
Reactive Oxygen Species Assay KitSolarbio, Beijing, ChinaCA1410
RIPA Lysis BufferBeyotime, Shanghai, ChinaP0013E
SDS-PAGE Gel Quick Preparation KitBeyotime, Shanghai, ChinaP0012AC
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5xBeyotime, Shanghai, ChinaP0015
Sigma CentrifugeSigma, Germany3K15
SQSTM1/p62 AntibodySanta Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., LtdSC-28359
Tecan Infinite 200 PRO  Tecan Austria GmbH, Austria1510002987
WB Transfer Buffer,10xSolarbio, Beijing, ChinaD1060
β-Actin Mouse mAbABclonal, Wuhan, ChinaAC004

Riferimenti

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