Isolamento e purificazione delle cellule endoteliali microvascolari e macrovascolari da campioni derivati dai polmoni

Riepilogo

Sebbene impegnativo, l'isolamento delle cellule endoteliali polmonari è essenziale per gli studi sull'infiammazione polmonare. Il presente protocollo descrive una procedura per l'isolamento ad alto rendimento e ad alta purezza delle cellule endoteliali macrovascolari e microvascolari.

Abstract

La disponibilità di cellule isolate da tessuti e organi sani e malati rappresenta un elemento chiave per approcci di medicina personalizzata. Sebbene le biobanche possano fornire un'ampia collezione di cellule primarie e immortalizzate per la ricerca biomedica, queste non coprono tutte le esigenze sperimentali, in particolare quelle relative a malattie o genotipi specifici. Le cellule endoteliali vascolari (ECs) sono componenti chiave della reazione infiammatoria immunitaria e, quindi, svolgono un ruolo centrale nella patogenesi di una varietà di disturbi. In particolare, le EC di diversi siti mostrano diverse proprietà biochimiche e funzionali, rendendo la disponibilità di specifici tipi di EC (cioè macrovascolari, microvascolari, arteriosi e venosi) essenziale per la progettazione di esperimenti affidabili. Qui, vengono illustrate in dettaglio semplici procedure per ottenere cellule endoteliali macrovascolari e microvascolari umane ad alto rendimento, praticamente pure, dall'arteria polmonare e dal parenchima polmonare. Questa metodologia può essere facilmente riprodotta ad un costo relativamente basso da qualsiasi laboratorio per ottenere l'indipendenza dalle fonti commerciali e ottenere fenotipi/genotipi EC che non sono ancora disponibili.

Introduzione

L'endotelio vascolare riveste la superficie interna dei vasi sanguigni. Svolge un ruolo chiave nella regolazione della coagulazione del sangue, del tono vascolare e delle risposte immuno-infiammatorie 1,2,3,4. Sebbene la coltura di cellule endoteliali (CE) isolate da campioni umani sia essenziale per scopi di ricerca, va osservato che le EC provenienti da diversi vasi sanguigni (arterie, vene, capillari) hanno funzioni specifiche. Questi non possono essere completamente ricapitolati dalle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC), che sono facilmente disponibili e ampiamente utilizzate negli studi sulla fisiopatologia dell'endotelio vascolare ^5,6. Ad esempio, le cellule endoteliali microvascolari polmonari umane (HLMVECs) svolgono un ruolo chiave nell'infiammazione polmonare controllando il reclutamento e l'accumulo di leucociti ^4,7. Pertanto, un setting sperimentale volto a riprodurre l'infiammazione polmonare con alta fedeltà dovrebbe includere HLMVECs. D'altra parte, la disfunzione EC può essere osservata in diverse patologie; pertanto, le EC del paziente sono fondamentali per costruire un modello in vitro affidabile della malattia. Ad esempio, l'isolamento di frammenti di EC dall'arteria polmonare (HPAEC), sezionati dai polmoni espiantati di persone affette da fibrosi cistica (FC), ci ha permesso di scoprire meccanismi di disfunzione endoteliale in questa malattia ^8,9.

Pertanto, i protocolli volti a ottimizzare l'isolamento delle EC da diverse fonti / organi anche negli stati di malattia sono essenziali per fornire agli investigatori preziosi strumenti di ricerca, in particolare quando questi strumenti non sono disponibili in commercio. I protocolli di isolamento HLMVEC e HPAEC sono stati precedentemente riportati 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. In tutti i casi, la digestione enzimatica dei campioni polmonari ha portato a popolazioni cellulari miste, che sono state purificate utilizzando mezzi selettivi ad hoc e sfere magnetiche o selezione cellulare basata su citometria. Ulteriori ottimizzazioni di questi protocolli devono affrontare due problemi principali nell'isolamento della CE: (1) contaminazione cellulare e tissutale, che dovrebbe essere risolta al più presto possibile per ridurre al minimo la senescenza replicativa EC²⁰; e (2) la bassa resa degli isolati EC primari.

Questo studio descrive un nuovo protocollo per l'isolamento ad alto rendimento e purezza di HLMVEC e HPAEC. Questa procedura può essere facilmente applicabile e fornire EC macrovascolari e microvascolari praticamente pure in pochi passaggi.

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Protocollo

Questo studio è stato approvato e il protocollo ha seguito le linee guida del comitato etico della ricerca umana dell'Università di Chieti-Pescara (#237_2018bis). La figura 1 illustra l'isolamento delle cellule endoteliali da segmenti (lunghi 1-3 cm) di parenchima polmonare o arteria polmonare da soggetti umani non identificati (con consenso scritto) sottoposti a chirurgia toracica per vari motivi, come pneumotorace o lobectomia. In quest'ultimo caso, i chirurghi hanno anche raccolto un segmento dell'arteria polmonare. In particolare, i chirurghi sono stati accuratamente istruiti a raccogliere campioni privi di cancro. Il protocollo presentato è stato ottimizzato per ottenere la massima resa e purezza possibile.

1. Preparazione sperimentale

1. Ricostituzione della collagenasi
   1. Sciogliere la polvere di collagenasi in soluzione salina tamponata fosfato senza CaCl 2 e MgCl 2 (PBS−⁻, vedere Tabella dei materiali) ad una concentrazione di₂ mg/ml e filtrare la soluzione utilizzando un filtro per pori da 0,22 μm.
   2. Preparare 5 ml di aliquote e conservarle a -20 °C. Scongelare e preriscaldare le aliquote a 37 °C prima dell'uso.
2. Rivestimento della piastra
   1. Per il rivestimento della piastra, pipettare una soluzione di gelatina all'1,5% o 50 μg/mL di fibronectina (vedere Tabella dei materiali) nella piastra di coltura (500 μL sono sufficienti per coprire la superficie di ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti) e incubare per 1 ora a 37 °C.
   2. Dopo l'incubazione, rimuovere la gelatina in eccesso e lavare i pozzetti con PBS⁻⁻. Aspirare il PBS⁻⁻ e lasciare asciugare la piastra in un cappuccio sterile.
      NOTA: Per la ricostituzione della gelatina, sciogliere la polvere in acqua per ottenere una soluzione all'1,5%, quindi sterilizzarla in autoclave e conservare a 4 °C. La gelatina all'1,5% non è liquida a 4 °C; Pertanto, deve essere riscaldato prima del rivestimento della piastra. In alternativa, qualsiasi soluzione commerciale di gelatina adatta alle colture cellulari può essere utilizzata per il rivestimento della piastra.

2. Preparazione del campione

1. Parenchima polmonare
   1. Lavare i campioni raccolti immergendoli in una provetta da 50 ml contenente PBS⁻⁻.
   2. Trasferire i campioni in una capsula di Petri sterile e tritare manualmente il campione con forbici chirurgiche (dimensione ottimale: >2 cm) in piccoli frammenti di circa 3-4 mm ciascuno.
2. Segmento(i) arterioso
   1. Lavare i campioni raccolti immergendoli in una provetta da 50 ml contenente PBS⁻⁻.
   2. Trasferirlo in una capsula di Petri sterile senza tagliare, poiché la frammentazione aumenterà la superficie della sezione trasversale del segmento arterioso, aumentando così la possibilità di isolare le non-CE.

3. Digestione enzimatica

1. Lavare il parenchima polmonare tagliato a cubetti o il/i segmento/i dell'arteria polmonare due volte con PBS⁻⁻. Questo passaggio rimuoverà gran parte del sangue residuo.
2. Porre i campioni in provette da 15 mL e incubare con 5 mL di collagenasi di tipo 2 (vedere Tabella dei materiali) per 10 minuti a 37 °C e 5% CO₂. Durante questa incubazione, la degradazione della matrice extracellulare rilascia singole cellule e aggregati cellulari.

4. Recupero delle cellule digerite

1. Posizionare un filtro sterile in acciaio/metallo (cioè un colino da tè con una dimensione di maglia ~ 1 mm) sulla parte superiore di un tubo di raccolta da 50 ml.
2. Versare l'intero contenuto dal tubo da 15 mL sul colino, massaggiare delicatamente il tessuto digerito con una spatola e sciacquare il campione con PBS⁻⁻ fino a riempire il tubo di raccolta.
   NOTA: Questo passaggio eliminerà grandi frammenti di tessuto su scala millimetrica, garantendo una maggiore efficienza delle successive fasi di filtrazione.

5. Rimozione non CE mediante filtrazione

1. Filtrare il deflusso raccolto nel punto 4.2 utilizzando un filtro cellulare con maglie di 70 μm e raccogliere il deflusso in una provetta fresca da 50 ml.
2. Quindi, utilizzare un filtro cellulare con una dimensione di maglia di 40 μm e raccogliere il deflusso in un tubo fresco da 50 ml. Etichettare questo tubo come "tubo 1".
   NOTA: queste filtrazioni nei passaggi 5.1 e 5.2 rimuoveranno gli aggregati cellulari di grandi dimensioni, che sono spesso composti da popolazioni cellulari miste.

6. Sedimentazione di cluster cellulari e semina cellulare

1. Centrifugare i campioni a 30 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per sedimentare i cluster cellulari.
2. Rimuovere con cautela il surnatante con una pipetta sterile (non versare) e metterlo in un tubo fresco da 50 ml ("tubo 2").
3. Sospendere il pellet nel "tubo 1" e riempire il tubo fino a 50 ml con PBS⁻⁻. Riempire "tubo 2" fino a 50 ml con PBS−⁻.
   NOTA: Da questa fase in poi, entrambi i tubi vengono trattati allo stesso modo.
4. Centrifugare i campioni a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
5. Sospendere i pellet con 2 ml di terreno di coltura (vedi Tabella dei materiali) e seminare la sospensione in due pozzetti separati di una piastra pre-rivestita a 6 pozzetti (fase 1.2).
   NOTA: Da questa fase, alimentare le cellule ogni 2 giorni con il terreno di crescita fino a raggiungere la confluenza (circa 1 settimana, a seconda della dimensione del campione) al fine di ottenere un numero ragionevole di celle per la selezione.

7. Espansione cellulare

1. Lavare le cellule con 2 ml di PBS con CaCl 2 e MgCl₂ (PBS++, vedere Tabella dei materiali) per rimuovere le cellule del sangue residue (l'uso di PBS⁺⁺ è importante per evitare il distacco delle cellule).
2. Rimuovere PBS⁺⁺ e aggiungere nuovi terreni colturali.
3. Ripetere i punti 7.1 e 7.2 fino a quando le cellule raggiungono la confluenza (circa 1 settimana, a seconda della dimensione del campione).

8. Ordinamento delle celle

1. Staccare le cellule usando 500 μL di tripsina-EDTA (0,05%, vedere Tabella dei materiali), centrifugare e risospendere il pellet con 190 μL di PBS−⁻.
2. Aggiungere 10 μL di un anticorpo fluorescente coniugato anti-umano CD31-FITC (diluizione 1:20, vedere Tabella dei materiali) e incubare la sospensione cellulare a 4 °C per 30 minuti.
3. Lavare le celle con 10 ml di PBS−−, centrifugare a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente e risospendere il pellet in 300 μL di PBS⁻⁻.
4. Isolare e raccogliere le cellule CD31 positive (CD31+) mediante selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS), utilizzando un ugello da 100 μm, e raccoglierle in un tubo.
   1. Secondo la strategia di gating, definire prima la morfologia cellulare utilizzando i parametri dell'area di dispersione laterale, SSC-A e FSC-A. Quindi, selezionare singole celle utilizzando un diagramma a punti FSC-Area/FSC-Height o SSC-Area/SSC-Height, definire le celle positive nel campione contrassegnato rispetto al campione di controllo non colorato e dirigere le celle fluorescenti nel tubo di raccolta²¹.
5. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente e sospendere il pellet in 2 ml di terreno di coltura per la semina nei pozzetti pre-rivestiti di una piastra a 6 pozzetti.

9. Espansione post-ordinamento

1. Due giorni dopo la selezione cellulare, sostituire il terreno condizionato con terreno di crescita fresco.
2. Ripetere il passaggio 7.1 e il passaggio 7.2 ogni 2 giorni per l'espansione cellulare.

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Risultati

Isolamento HLMEC
Il problema principale durante l'isolamento degli HLMVEC è la presenza di cellule contaminanti poiché i capillari microscopici non possono essere facilmente separati dal tessuto stromale. Pertanto, raggiungere la massima purezza possibile nelle prime fasi del processo di isolamento è fondamentale per ridurre i passaggi di coltura e, quindi, l'invecchiamento cellulare. Allo stesso modo, un protocollo di isolamento ottimale dovrebbe fornire la massima resa possibile di HLMVEC puri. P...

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Discussione

I molteplici ruoli svolti dalle cellule endoteliali vascolari nella fisiopatologia umana rendono queste cellule uno strumento indispensabile per studi patogenetici e farmacologici in vitro . Poiché le EC provenienti da diversi siti/organi vascolari mostrano caratteristiche e funzioni peculiari, la disponibilità di EC sane e malate dall'organo di interesse sarebbe ideale per scopi di ricerca. Ad esempio, gli HLMVEC sono essenziali per gli studi sull'infiammazione polmonare; Pertanto, una metodologia per l'isola...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% trypsin-EDTA 1X	GIBCO	25300-054	Used to detach cells from the culture plates
Anti CD31 Antibody, clone WM59	Dako	M0823	Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50
Anti vWF Antibody	Thermo Fisher Scientific	MA5-14029	Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100
Autoclavable surgical scissors	Any		Used for chopping specimens
Cell strainers 40 µm	Corning	431750	Used during the second filtration
Cell strainers 70 µm	Corning	431751	Using during the first filtration
Collagenase, Type 2	Worthington	LS004177	Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL
Conjugated anti CD31 Antibody	BD Biosciences	555445	Used for cell sorting (1:20 dilution)
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with  CaCl2 and MgCl2	Sigma-Aldrich	D8662	Used for cell washing before medium change
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2	Sigma-Aldrich	D8537	Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization
Endothelial Cell Growth Medium MV	PromoCell	C-22020	HLMVEC growth medium
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F0895	Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL
Gelatin from porcine skin, type A	Sigma-Aldrich	G2500	Used for plate coating
Type A gelatin	Sigma-Aldrich	g-2500	Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5%