Isolamento e purificazione del β-glucano fungino come strategia immunoterapica per il glioblastoma

Riepilogo

Il presente protocollo descrive le fasi di purificazione e i successivi studi di quattro diversi β-glucani fungini come potenziali molecole immunomodulatrici che potenziano le proprietà antitumorali della microglia contro le cellule di glioblastoma.

Abstract

Una delle maggiori sfide nello sviluppo di terapie efficaci contro il glioblastoma è superare la forte soppressione immunitaria all'interno del microambiente tumorale. L'immunoterapia è emersa come una strategia efficace per trasformare la risposta del sistema immunitario contro le cellule tumorali. I macrofagi e le microglia associati al glioma (GAM) sono i principali motori di tali scenari anti-infiammatori. Pertanto, il miglioramento della risposta antitumorale nelle GAM può rappresentare una potenziale terapia coadiuvante per il trattamento dei pazienti con glioblastoma. In questo senso, le molecole fungine di β-glucano sono state a lungo conosciute come potenti modulatori immunitari. È stata descritta la loro capacità di stimolare l'attività immunitaria innata e migliorare la risposta al trattamento. Queste caratteristiche modulanti sono in parte attribuite alla loro capacità di legarsi ai recettori di riconoscimento dei pattern, che, curiosamente, sono molto espressi nei GAM. Pertanto, questo lavoro è focalizzato sull'isolamento, la purificazione e il successivo uso di β-glucani fungini per migliorare la risposta tumoricida della microglia contro le cellule di glioblastoma. Le linee cellulari di glioblastoma di topo (GL261) e microglia (BV-2) sono utilizzate per testare le proprietà immunomodulatorie di quattro diversi β-glucani fungini estratti da funghi pesantemente utilizzati nell'attuale industria biofarmaceutica: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus e Ganoderma lucidum. Per testare questi composti, sono stati eseguiti saggi di co-stimolazione per misurare l'effetto di un mezzo pre-attivato condizionato dalla microglia sulla proliferazione e l'attivazione dell'apoptosi nelle cellule di glioblastoma.

Introduzione

Nonostante l'avvento di nuove conquiste nel campo della neuro-oncologia, l'aspettativa di vita dei pazienti con glioblastoma rimane scarsa. Le terapie gold standard contro i tumori cerebrali si basano sulla fusione di chirurgia, radioterapia e chemioterapia. Tuttavia, nell'ultimo decennio, l'immunoterapia è emersa come una potente strategia per trattare diversi tipi di cancro¹. Pertanto, la possibilità di sfruttare la risposta immunitaria del corpo contro le cellule tumorali è recentemente diventata il quarto pilastro dell'oncologia.

È noto da tempo che una delle maggiori sfide nel campo è quella di superare la forte immunosoppressione trovata all'interno del microambiente tumorale². In particolare, nel caso del glioblastoma, una delle forme più comuni e aggressive di cancro al cervello, svelare percorsi chiave che orchestrano tali scenari pro-tumorali e trovare nuovi composti che potrebbero contrastare la risposta deprimente del sistema immunitario potrebbe aprire la strada a future terapie contro questa malattia incurabile.

Il cervello possiede le proprie cellule del sistema immunitario e il tipo di cellula più rilevante sono le microglia. Queste cellule hanno dimostrato di avere un comportamento piuttosto complesso in diverse malattie centrali³. Nel caso di tumori cerebrali primari (ad esempio, glioblastoma), queste cellule sono spostate verso un fenotipo anti-infiammatorio che supporta le cellule tumorali per colonizzare il parenchima cerebrale³. Numerose pubblicazioni hanno migliorato il ruolo principale di queste cellule durante la progressione del tumore. Una delle ragioni principali di ciò è che la microglia associata al glioma e i macrofagi infiltrati (GAM) rappresentano un terzo della massa tumorale totale, suggerendo così l'influenza inequivocabile dei loro stati di attivazione durante la progressione del tumore cerebrale ^4,5.

In questo senso, i β-glucani fungini sono stati descritti come potenti molecole che innescano risposte immunitarie efficaci, tra cui la fagocitosi e la produzione di fattori pro-infiammatori, portando all'eliminazione di agenti perniciosi 6,7,8,9,10. I β-glucani fungini sono stati generalmente studiati utilizzando estratti di diverse parti di funghi. Tuttavia, l'attribuzione di effetti specifici richiede la sua purificazione per evitare ambiguità e per essere in grado di comprendere il meccanismo d'azione di tali molecole come agenti immunomodulatori⁸.

In questo lavoro, i β-glucani solubili sono purificati dal corpo fruttifero di quattro diversi funghi, regolarmente impiegati come funghi commestibili (Pleurotus ostreatus e Pleurotus djamor) e medicinali (Ganoderma lucidum e Hericium erinaceus). In particolare, questi quattro funghi hanno un grande uso nell'industria alimentare e farmaceutica e sono stati prodotti nell'ambito di un'economia circolare rispettosa dell'ambiente in un'impresa commerciale (vedi Tabella dei materiali).

Al fine di gettare le basi per l'uso futuro di β-glucani fungini nelle terapie del cancro al cervello, strategie di purificazione ben definite e studi preclinici che approfondiscono la loro presunta interazione con le cellule del sistema immunitario sono essenziali per valutare il loro potenziale ruolo come mediatori antitumorali. Questo lavoro descrive i numerosi passaggi di isolamento e purificazione necessari per recuperare i β-glucani solubili contenuti all'interno dei corpi fruttiferi del fungo selezionato. Una volta purificate con successo, le cellule della microglia vengono attivate per migliorare il loro fenotipo infiammatorio. Le cellule di glioblastoma di topo (GL261) sono rivestite con un diverso mezzo condizionato dalla microglia, precedentemente trattato con questi estratti, e quindi viene valutato il suo effetto sul comportamento delle cellule tumorali. È interessante notare che studi pilota del nostro laboratorio (dati non mostrati) hanno scoperto come la microglia pro-infiammatoria possa rallentare la migrazione delle cellule tumorali e le proprietà di invasione non solo nelle cellule di glioblastoma ma anche in altre linee cellulari tumorali. Questo lavoro multidisciplinare può fornire uno strumento utile per i ricercatori oncologici per testare composti promettenti in grado di aumentare la risposta immunitaria in molti diversi tipi di tumori.

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Protocollo

Le quattro diverse varianti di funghi descritte in questo protocollo sono state ottenute da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).

1. Isolamento di β-glucani fungini

1. Estrazione e isolamento di polisaccaridi solubili di funghi
   NOTA: I polisaccaridi solubili dei funghi (SMP) sono stati ottenuti secondo la procedura schematicamente mostrata nella Figura 1.
   1. Risciacquare delicatamente i corpi fruttiferi freschi di P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus e G. lucidum (circa 2.000 g / fungo) in acqua distillata cinque volte.
   2. Essiccare i corpi fruttiferi a 50 ± 2 °C in un forno ad aria convenzionale fino a raggiungere un peso costante (~24 h).
   3. Macinare i funghi secchi in un mulino a lame, ottenendo circa 200 g di polvere da ciascun fungo.
   4. Sospendere 100 g di polvere di funghi (MP) (P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus e G. lucidum) in 1.000 ml di H₂O_d. Quindi, autoclavare a 121 °C per 15 min, e infine lasciare a temperatura ambiente per 30 min.
   5. Centrifugare la sospensione risultante a 6.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
   6. Essiccare il precipitato contenente polisaccaridi di funghi insolubili (IMP) a 50 ± 2 °C in un forno ad aria per 24 ore.
   7. Scartare il precipitato e mantenere il surnatante. Concentrare il surnatante 10 volte in un evaporatore rotante.
   8. Precipitare il concentrato contenente SMP con etanolo (concentrazione finale dell'80%) a 4 °C durante la notte.
   9. Centrifugare la sospensione di etanolo a 6.000 x g per 15 minuti a 4 °C, trattenere il pellet (precipitato) e gettare il surnatante con una pipetta.
   10. Lavare il precipitato tre volte con etanolo all'80% prima di scioglierlo in H₂O_d (10% p/v). Regolare il pH a 6,5/7 e la temperatura a 37 °C e trattare con 2 U e 4 U di α-amilasi e glucoamilasi, rispettivamente, per solubilizzare i α-glucani seguendo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).
   11. Dopo il trattamento con α-amilasi/glucoamilasi, regolare il pH e la temperatura rispettivamente a 8,0 e 50 °C e trattare con alcalasi (2,5 U/g di proteine) (vedere Tabella dei materiali) per solubilizzare le proteine.
       NOTA: Questo trattamento enzimatico sequenziale rimuove la maggior parte dei α-glucani e delle proteine che co-precipitano con β-glucani nella precipitazione dell'etanolo.
   12. Dopo l'idrolisi, centrifugare l'idrolizzato a 6.000 x g per 15 minuti a 4 °C e il concentrato di surnatante pulito cinque volte in un evaporatore rotante. Precipitare nuovamente con etanolo all'80%.
   13. Solubilizzare il precipitato risultante in H₂O_d e dializzarlo in acqua distillata per 24 ore utilizzando membrane tubolari di cellulosa (membrane cut-off da 12.000 Da; vedi Tabella dei materiali) per rimuovere molecole a basso peso molecolare. Recuperare la parte idrosolubile e liofilizzarla per produrre β-glucani solubili (SβG).
2. Misurazione di zuccheri e proteine
   1. Misurare il contenuto totale di zucchero di ciascuna frazione con il metodo dell'acido fenolo-solforico, utilizzando il glucosio come standard⁸.
      NOTA: La quantificazione del contenuto di β-glucano può essere effettuata anche utilizzando il kit di dosaggio β-glucano (funghi e lieviti; vedi Tabella dei materiali), basato sull'idrolisi enzimatica e sull'attività delle ossidoreduttasi: vale a dire eso-1,3-β-glucanasi, glucosio ossidasi, β-glucosidasi e perossidasi, con successiva formazione della chinonerimina. Seguire le istruzioni del produttore, con lievi modifiche.
   2. Utilizzare 18 MH 2 SO4 invece di 12 MH₂SO₄.
   3. Valutare separatamente il contenuto dei glucani e dei α-glucani totali.
   4. Misurare i valori di β-glucano risultanti come differenza tra i valori di glucano totale e α-glucano (triplicato) seguendo il protocollo Kjeldahl. In alcuni casi, il contenuto proteico può essere determinato con il metodo di Lowry, utilizzando l'albumina per tracciare la curva di calibrazione^11,12.
3. Analisi della spettroscopia di assorbimento ultravioletto
   1. Ottenere gli spettri ultravioletti (UV) SβG utilizzando uno spettrofotometro UV-visibile (vedi Tabella dei materiali) scansionando i campioni nella regione 200-400 nm (Figura 2).
   2. Preparare 1,0 mg/ml di ogni SβG in H₂O_d, trasferire la soluzione in una cuvetta di quarzo e scansionare a temperatura ambiente.
4. Analisi della distribuzione del peso molecolare
   1. Stimare l'omogeneità dei SβG e il peso molecolare dei polimeri mediante cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) utilizzando un sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) (vedi Tabella dei materiali) dotato di un rivelatore di indice di rifrazione e di una colonna lineare di filtrazione in gel ultra-idrogel (300 mm x 7,8 mm; Figura 3).
   2. Eseguire il test a 40 °C utilizzando acqua deionizzata come eluente ad una portata di 0,5 mL/^min-1 e destrani (110, 80 e 50 kDa) come standard (vedere Tabella dei materiali). Raccogliere una frazione di 5 ml.
5. Analisi infrarossa a trasformata di Fourier (FTIR)
   1. Registrare gli spettri infrarossi (Figura 4) su uno spettrometro FTIR nell'intervallo 4000-500 ^cm-1. I campioni devono essere precedentemente miscelati con KBr per formare pellicole (procedura FTIR standard; vedere le istruzioni del produttore e la tabella dei materiali).
6. Analisi della composizione molecolare
   1. Stimare le composizioni molecolari di SβG mediante cromatografia su strato sottile ad alte prestazioni (HPTLC) e gascromatografia accoppiata alla spettrometria di massa (GC-MS), seguendo le procedure standard¹².

2. Studio in vitro della stimolazione microglia indotta da β-glucano

1. Coltura cellulare di glioblastoma di topo e cellule di microglia in vetrini a 8 pozzetti
   NOTA: Questo protocollo è specifico per le linee cellulari GL261 (glioblastoma) e BV2 (microglia). Tuttavia, con lievi modifiche, questi passaggi potrebbero potenzialmente essere utilizzati per studiare altre linee cellulari tumorali e immunitarie.
   1. Preparare il mezzo completo modificato di Eagle (DMEM) di Dulbecco modificato con L-glutammina, 4,5 g / L D-glucosio e senza piruvato. Aggiungere il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina (vedere la tabella dei materiali). Preriscaldare il materiale a bagnomaria a 37 °C per 15 min.
   2. Scongelare le aliquote BV2 e GL261 congelate a bagnomaria (37 °C) per 2 minuti e, poco prima che si scongelano completamente, trasportarle in una cappa a flusso laminare e placcare le cellule in due diversi palloni sterili T25 (uno per ogni linea cellulare).
   3. Incubare i matraccio T25 a 37 °C, 5% CO₂ fino a quando la coltura è confluente.
      NOTA: A seconda delle condizioni di congelamento e del tempo di crioconservazione, il tempo fino alla confluenza può variare. Queste linee cellulari di solito richiedono da 3 a 5 giorni per raggiungere la confluenza in un matraccio T75.
   4. Dopo che la coltura cellulare BV2 diventa confluente, trasferirla in vetrini a 8 pozzetti 0,6 x 10⁶ cellule/pozzetto. Conservare i vetrini della camera a 8 pozzetti nell'incubatore per 24 ore.
   5. Una volta che le cellule della microglia sono placcate nei vetrini della camera a 8 pozzetti, ripetere lo stesso protocollo con le cellule GL261.
2. Attivazione della microglia con β-glucani
   1. Rivestire le cellule BV2 con quattro diversi β-glucani (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum e H. erinaceus) ad una concentrazione di 0,2 mg/ml per 72 ore. Una condizione sperimentale deve rimanere non trattata (mezzo normale), agendo come gruppo di controllo.
   2. Raccogliere il surnatante con una pipetta dopo 72 ore e far passare il volume rimanente attraverso un filtro a siringa da 0,20 μm. Quindi, congelare il surnatante a -80 °C per almeno 24 ore.
3. Trattamento di GL261 con terreno pre-attivato condizionato da microglia
   1. Una volta che GL261 è confluente all'80% all'interno dei vetrini della camera a 8 pozzetti, aggiungere il mezzo microgliale trattato con β-glucano (fase 2.2.2) ad una concentrazione di volume finale del 25% per 72 ore (volume totale: 250 μl/pozzetto).
   2. Rimuovere il terreno dopo 72 ore di incubazione e scartarlo.
   3. Lavare le cellule con tampone fosfato salino (PBS; pH 7,4, 0,1 M) tre volte per 5 minuti.
   4. Fissare le cellule aggiungendo 200 μL di paraformaldeide (PFA) al 4% a 4 °C per 15 minuti.
      NOTA: A seconda dei diversi anticorpi che potrebbero essere utilizzati per l'immunofluorescenza, i metodi di fissazione possono differire dal tipico 4% di PFA. I fissativi a base di alcol possono essere più efficienti nel preservare alcuni epitopi.
4. Studio di immunofluorescenza
   1. Lavare i campioni con PBS con tritone X (PBST; 0,01%) per 10 minuti tre volte.
   2. Rimuovere il PBST e aggiungere tampone bloccante l'albumina sierica bovina (BSA) al 10% in PBST (Tabella 1) per 30 minuti a temperatura ambiente.
   3. Rimuovere il tampone bloccante e aggiungere 200 μL per pozzetto di PBS contenente la miscela di anticorpi primari (1:500 anticorpo monoclonale Ki-67 di ratto e 1:500 anticorpo caspasi-3 scisso di coniglio; vedere Tabella dei materiali). Incubare per una notte a 4 °C.
   4. Dopo 24 ore di incubazione a 4 °C, lasciare i campioni a temperatura ambiente per 30 minuti.
   5. Lavare i pozzetti tre volte per 10 minuti con PBS su uno shaker (bassa velocità).
   6. Rimuovere il PBS e sostituirlo con 200 μL per pozzetto di PBS contenente la miscela di anticorpi secondari (1:200 anticorpo secondario anti-ratto asino (H + L) altamente adsorbito, Alexa Fluor 488 e 1:200 anticorpo secondario anti-coniglio anti-coniglio (H + L) altamente adsorbito, Alexa Fluor 647; vedi Tabella dei materiali) per 45 minuti a temperatura ambiente al buio.
   7. Lavare i campioni con PBS per 10 minuti su uno shaker multiuso.
   8. Rimuovere il PBS e aggiungere 200 μL per pozzetto di 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) diluito in PBS (1:5.000) per 1 min.
   9. Rimuovere DAPI (vedere Tabella dei materiali) e lavare le celle per 5 minuti in PBS.
   10. Rimuovere il telaio del pozzetto e aggiungere 50 μL di PBS:glicerolo (1:1) su ciascun pozzetto e coprire con un vetrino.
   11. Sigillare le diapositive con lo smalto.
   12. Acquisire immagini a 20x utilizzando un sistema di microscopio confocale (vedi Tabella dei materiali).

3. Quantificazione e analisi della proliferazione e dell'apoptosi delle cellule tumorali

NOTA: Al fine di misurare il potenziale effetto dei diversi β-glucani sulla proliferazione e sull'apoptosi delle cellule tumorali, è stato utilizzato uno script interno nel software ImageJ per quantificare il numero di pixel positivi di Ki67 (proliferazione) e cCasp3 (apoptosi)¹³.

1. Aprire ImageJ. Fare clic sul pulsante Plugin . Fare clic su Coloc2, un plugin precedentemente installato nella cartella plugin, e infine selezionare l'immagine da analizzare¹¹.
   NOTA: Questo plugin era disponibile dopo un precedente contatto con il Dr. Vasiliki Economopoulos (veconom@uwo.ca). Invece dello script, sia il software ImageJ che Fiji hanno strumenti diversi per l'analisi di colocalizzazione (vedi Tabella dei materiali), con proprietà simili.
2. Impostare le soglie in base alle condizioni di controllo (non trattate, solo DMEM). Fare clic sul pulsante OK .
   NOTA: per evitare discrepanze di sfondo e intensità, tutte le immagini devono essere scattate nelle stesse condizioni. Preferibilmente, le sessioni di imaging dovrebbero essere eseguite lo stesso giorno e i parametri del microscopio inalterati tra le immagini.
3. Assicurati che vengano visualizzate le immagini risultanti dei pixel colocalizzati e una finestra di riepilogo che fornisca la percentuale o il numero non elaborato di pixel al di sopra della soglia. Normalizzare i risultati rispetto alle condizioni di controllo (non trattate).
   NOTA: Tutti i dati sono indicati come media ± SEM. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando software grafici e di analisi (vedi Tabella dei materiali). È stata utilizzata una ANOVA unidirezionale con il test di confronto multiplo di Tukey. Gli errori sono rappresentati come errore standard della media (s.e.m.) (*p < 0,05, **p < 0,01).

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Risultati

Purificazione riuscita dei β-glucani
La massa di MP, SMP e SβG ottenuta dai corpi fruttiferi di P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum e H. erinaceus dopo il processo di estrazione e purificazione è riassunta nella tabella 1. La composizione di base (carboidrati totali, β-glucani e proteine) di MP, SMP e SβG ottenuti dai funghi è raffigurata nella Tabella 2. Questi risultati mostrano come il protocollo abbia permesso il recupero ...

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Discussione

Questo lavoro descrive l'uso di tecniche consolidate per isolare, purificare e caratterizzare con successo il contenuto di SβG da quattro diversi funghi. I risultati hanno mostrato come dopo l'estrazione con acqua calda di SMP, ottenuti da P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum e H. erinaceus, seguita da un trattamento idrolitico con α-amilasi, glucosidasi e proteasi, il contenuto di α-glucano e proteine è stato ridotto, arricchendo così significativamente la quantità di SβG puri.<...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-well chamber slides	Thermo Fisher, USA	171080
Air-drying oven	J.P. Selecta S.A., Spain	2000210
Albumin	Sigma-Aldrich, St. Louis	A7030
Alcalase	Novozymes, Denmark	protease
Alexa Fluor 488	Thermofisher, USA	A32731
Alexa Fluor 647	Thermofisher, USA	A32728
Blade mill	Retsch, Germany	SM100
Bovine Serum Albumin	MERK, Germany	A9418
Cellulose tubing membrane	Sigma-Aldrich, St. Louis	D9402
Centrifuge	MERK, Germany	Eppendorf, 5810R
Colocalisation pluggins	ImageJ		(https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis )
DAPI	MERK, Germany	28718-90-3
Dextrans	Pharmacosmos, Holbalk, Denmark	Dextran 410, 80, 50
Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Gluta MAXTM	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	10564011
Extenda (α- Amylase/Glucoamylase)	Novozymes, Denmark
Fetal bovine serum	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	A4736301
FT-IR spectromete	Bruker-Vertex, Switzerland	VERTEX 70v
Graphing and analysis software	GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)
H2SO4
HPLC system	Waters Corp, Milford, MA, USA	Waters 2695 HPLC
Incubator	Eppedorf	Galaxy 170S
Mass Spectometer	Q Exactive GC, Thermo Scientific	725500
Paraformaldehyde	MERK, Germany	P6148
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich, St. Louis	P4458
pH meter	Crison, Barcelona, Spain	Basic 20
Phosphate-buffered saline	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	1010-015
Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody	Abcam, UK	ab243998
Rat Ki-67 Monoclonal	Thermofisher, USA	MA5-14520
Rotary evaporator	Büchi Ibérica S.L.U., Spain	El Rotavapor R-100
Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm)	Waters Corp, Milford, MA, USA	WAT011545
UV-Visible spectrophotometer	Amersham Bioscience, UK	Ultrospec 2100 pro
VectaMount	Vector Laboratories, C.A, USA	H-5000-60
Water bath	J.P. Selecta S.A., Spain
Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System.	Zeiss, Germany
β-glucan Assay Kit	Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland	K-BGLU
β-glucans	Setas y Hongos del Sur, S.L.		Supplied the four variants of mushrooms