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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo fornisce istruzioni per l'attivazione e il monitoraggio della pesofagia mediata da Stub1 in cellule vive.

Abstract

Le cellule di mammifero possono trasformare i perossisomi attraverso la pesofagia mediata da Stub1. Il percorso consente potenzialmente il controllo cellulare della quantità e della qualità dei perossisomi. Durante questo processo, la proteina da shock termico 70 e l'ubiquitina E3 ligasi, Stub1, traslocano sui perossisomi per essere girati per iniziare la pexofagia. L'attività della ligasi Stub1 consente l'accumulo di ubiquitina e di altri moduli correlati all'autofagia su perossisomi mirati. L'elevazione dei livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS) all'interno del lume perossisomale può attivare la pesofagia mediata da Stub1. Si può, quindi, utilizzare la generazione di ROS assistita da coloranti per innescare e monitorare questo percorso. Questo articolo delinea le procedure per l'utilizzo di due classi di coloranti, proteine fluorescenti e fluorofori sintetici, per avviare la pesofagia all'interno di colture cellulari di mammifero. Questi protocolli basati sulla generazione di ROS assistiti da coloranti non solo possono essere utilizzati per colpire tutti i perossisomi all'interno di una popolazione cellulare a livello globale, ma possono anche consentire la manipolazione di singoli perossisomi all'interno di singole cellule. Descriviamo anche come la pexofagia mediata da Stub1 può essere seguita usando la microscopia a cellule vive.

Introduzione

I perossisomi sono organelli legati a membrana singola presenti nella maggior parte delle cellule eucariotiche. I perossisomi sono un compartimento metabolico essenziale per effettuare la beta-ossidazione degli acidi grassi a catena molto lunga, il catabolismo delle purine e la sintesi dei fosfolipidi eterici e degli acidi biliari1. L'acetil-CoA derivata dai perossisomi controlla l'omeostasi lipidica regolando la segnalazione centrale nel metabolismo2. Pertanto, non sorprende che le funzioni perossisomiali compromesse siano implicite in varie malattie, tra cui disturbi neurodegenerativi, invecchiamento, tumori, obesità e diabete 3,4,5. Un processo essenziale nel mantenimento del funzionamento perossisomale è la pesofagia. La pexofagia è un processo catabolico per il turnover selettivo dei perossisomi da parte dell'autofagia. Le cellule usano la pexofagia per aiutare a controllare la quantità e la qualità dei perossisomi, garantendo così una corretta funzione perossisomiale. Uno studio recente ha dimostrato che la perdita di perossisomi causata da mutazioni nei fattori di biogenesi perossisomale PEX1 1 e 6 deriva dalla pexofagia 6 non controllata. In particolare, il 65% di tutti i pazienti con disturbo della biogenesi dei perossisomi (PBD) presenta carenze nel complesso perossisomale AAA ATPasi, composto da PEX1, PEX6 e PEX26 nelle cellule di mammifero7.

Un certo numero di metodi possono essere utilizzati per iniziare e studiare la pesofagia. Nel lievito, la pexofagia viene attivata quando i nutrienti forniti passano da fonti di carbonio dipendenti dai perossisomi a fonti di carbonio indipendenti dai perossisomi (per abbassare il numero di perossisomi cellulari)8. Ad esempio, il trasferimento di cellule di Pichia pastoris coltivate a metanolo dal mezzo di metanolo al mezzo di glucosio e al mezzo di etanolo induce micropexofagia e macropexofagia, rispettivamente 8,9,10. La micropexofagia sequestra i perossisomi raggruppati per la degradazione rimodellando il vacuolo per formare membrane di sequestro vacuolare simili a coppe e una struttura simile a un coperchio chiamata apparato di membrana micropexofagico-specifico (MIPA). Nella macropexofagia, i singoli perossisomi sono inghiottiti da strutture a doppia membrana note come pexofagosomi, seguite dalla fusione con il vacuolo per la degradazione 8,9,10. La fosforilazione dei recettori della pesofagia, come Atg36p in Saccharomyces cerevisiae e Atg30p in Pichia pastoris, è fondamentale per i recettori per reclutare il meccanismo di autofagia centrale e per facilitare il targeting perossisomale agli autofagosomi 8,11.

Nelle cellule di mammifero, la pesofagia può essere indotta dall'ubiquitinazione. La marcatura delle proteine di membrana perossisomale PMP34 o PEX3 con ubiquitina sul lato citosolico induce la pesofagia12. La sovraespressione di PEX3 induce l'ubiquitinazione dei perossisomi e l'eliminazione dei perossisomi da parte dei lisosomi13. Inoltre, la fusione di PEX5 con un EGFP C-terminale compromette l'esportazione di PEX5 monoubiquitinata e provoca la pesofagia14. D'altra parte, la pexofagia può anche essere innescata dal trattamento con H 2 O2. I perossisomi producono specie reattive dell'ossigeno (ROS); nello specifico, l'enzima perossisomale Acox1, che catalizza la fase iniziale della beta-ossidazione degli acidi grassi a catena molto lunga (> 22 carbonio), produce non solo acetil-CoA ma anche ROS perossisomiali. In risposta ai livelli elevati di ROS sotto il trattamento conH 2 O2, le cellule di mammifero attivano la pexofagia per ridurre la produzione di ROS e alleviare lo stress. È stato riportato che il trattamentocon H 2 O2 guida il reclutamento di atassia-telangiectasia mutata (ATM) in perossisomi. ATM quindi fosforila PEX5 per promuovere il turnover perossisomale mediante la pesofagia15.

Poiché i perossisomi sono centri di generazione di ROS, sono anche soggetti a danni da ROS. Le lesioni perossisomiali indotte da ROS costringono le cellule ad attivare la pexofagia per avviare le vie di controllo della qualità dei perossisomi (rimozione del perossisoma danneggiato mediante autofagia). Qui, delineiamo un approccio per l'innesco on-demand di lesioni perossisomiali indotte da ROS. Il protocollo sfrutta la produzione di ROS attivati dalla luce all'interno degli organelli 16,17,18,19,20 (Figura 1). I perossisomi marcati con colorante sono illuminati, portando alla produzione di ROS all'interno del lume perossisomiale, che innesca specificamente la lesione perossisomiale. Utilizzando questo protocollo, è dimostrato che i perossisomi stressati da ROS vengono rimossi attraverso una via di degradazione ubiquitina-dipendente. I perossisomi stressati da ROS reclutano l'ubiquitina E3 ligasi Stub1 per consentire il loro inghiottimento in autofagosomi per la rimozione individuale mediante pexofagia16. Si può usare questo protocollo per confrontare il destino dei perossisomi feriti e sani all'interno della stessa cellula mediante microscopia time-lapse. Il metodo può anche essere utilizzato per danneggiare globalmente tutti i perossisomi (in tutte le cellule) su un piatto di coltura, consentendo l'analisi biochimica della via della pexofagia.

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Protocollo

1. Preparazione di cellule che esprimono proteine diKillerRed o automarcanti (SLP) nel lume dei perossisomi

  1. Seminare le cellule desiderate su piatti di coltura cellulare con fondo di vetro. Per l'esperimento qui, seminare 2 x 105 cellule umane SHSY5Y in 840 μL di terreno di coltura (DMEM / F-12 integrato con il 10% di siero bovino fetale e l'1% di penicillina / streptomicina) o 6 x 104 cellule NIH3T3 di topo in 840 μL di terreno di coltura (DMEM integrato con siero bovino al 10% e penicillina / streptomicina) su un piatto di coltura da 35 mm con un micropozzetto di vetro di 20 mm di diametro.
    NOTA: Il numero di celle seminate deve essere regolato proporzionalmente in base all'area del micropozzetto di vetro quando si utilizzano piatti con fondo di vetro di altre specifiche.
  2. Far crescere le cellule sotto il 5% di CO2/37 °C per 24 ore.
  3. Trasfettare le cellule con i plasmidi desiderati usando un reagente di trasfezione.
    1. Utilizzare PMP34-TagBFP per etichettare i perossisomi nelle cellule vive. Utilizzare diKillerRed-VKSKL o SLP-VKSKL con targeting dei perossisomi (+ ligandi SLP marcati con colorante) per la generazione di ROS nel lume dei perossisomi (attraverso la produzione di ROS attivati dalla luce). In questo protocollo, utilizziamo la proteina auto-etichettante HaloTag-VKSKL21. Per monitorare la traslocazione di Stub1/Hsp70, l'accumulo di proteine ubiquitinate e la formazione di autofagosomi sui perossisomi stressati da ROS, trasfettare rispettivamente EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-Ub o EGFP-LC3B. Per controllare la generazione di ROS nel lume perossisomiale, co-transfettare diKillerRed-VKSKL con la sonda redox fluorescente localizzata dai perossisomi roGFP2-VKSKL22.
    2. Per la trasfezione cellulare SHSY5Y, diluire i plasmidi in 55 μL di DMEM/F-12 senza siero e diluire 1 μL di reagente di trasfezione in 55 μL di DMEM/F12 privo di siero. Combinare il DNA diluito con il reagente diluito. Mescolare delicatamente e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
    3. Aggiungere il complesso al micropozzetto da 20 mm precedentemente placcato con 100 μL di terreno di coltura per SHSY5Y senza antibiotici (DMEM/F-12 con siero bovino fetale al 10%). Agitare delicatamente il piatto avanti e indietro.
    4. Per la trasfezione cellulare NIH3T3, sostituire il mezzo sierico ridotto per il DMEM/F-12 privo di siero per diluire i plasmidi e il reagente di trasfezione. Sostituire il terreno di coltura galvanico con SHSY5Y con terreno di coltura per cellule NIH3T3 senza antibiotici (DMEM con siero bovino al 10%).
  4. Dopo 2 ore di trasfezione, rimuovere il mezzo contenente il reagente di trasfezione e aggiungere 1 mL di terreno di coltura fresco. Incubare le cellule NIH3T3 o SHSY5Y a 37°C e 5% di CO2 per 24 ore.
    NOTA: Altre linee cellulari possono anche essere utilizzate per studiare la esofagia mediata da Stub1 (ad esempio, cellule HeLa).

2. Colorazione dei perossisomi con ligandi SLP marcati con colorante (per la produzione di ROS attivati dalla luce)

  1. A 24 ore dopo la trasfezione, rimuovere il terreno di coltura e aggiungere 100 μL di ligando HaloTag TMR da 200 nM o da 200 nM di legante HaloTag Janelia Fluor 646 sul micropozzetto di vetro da 20 mm.
    NOTA: I ligandi SLP marcati con colorante devono essere diluiti con il rispettivo terreno di coltura per ciascuna linea cellulare. La scelta di ligandi marcati con Janelia Fluor 646 libererà i canali blu, verde e rosso per l'imaging a fluorescenza a valle.
  2. Trasferire il piatto in un incubatore a 37°C, 5% CO2 . Macchia per 1 h. Dopo 1 ora, rimuovere accuratamente il terreno di colorazione e aggiungere 1 ml di terreno di coltura fresco.

3. ROS-stressing dei perossisomi su un microscopio confocale a scansione laser

  1. Posizionare un piatto con fondo di vetro contenente le cellule desiderate su un microscopio confocale a scansione laser dotato di un'incubatrice da palcoscenico.
  2. Fare clic su Finestra strumento, scegliere Oculare e fare clic sul pulsante DIA (Figura 2A) per accendere la luce trasmessa. Visualizza il piatto attraverso l'oculare del microscopio e metti a fuoco le cellule ruotando la manopola di messa a fuoco.
  3. Scegliere LSM e fare clic sul pulsante Selezione colorante e rilevatore (Figura 2B). Fare doppio clic sui coloranti desiderati nella finestra pop-up per selezionare le impostazioni laser e di filtro appropriate per l'imaging delle celle (Figura 2C). Fare clic su Livex4 nel pannello Live per avviare la scansione laser veloce e avviare lo screening dei segnali di fluorescenza delle cellule (Figura 2D).
  4. Spostare lo stage utilizzando il controller del joystick e individuare le cellule medie che esprimono diKillerRed-VKSKL o SLP-VKSKL per applicare lo stress ROS (sui perossisomi). Acquisire un'immagine della cella desiderata.
  5. Fate clic su Finestra strumento (Tool Window) e scegliete Stimolazione LSM (Figura 2E). Fare clic sul pulsante ellisse e, nella finestra dell'immagine live, utilizzare il mouse per disegnare un ROI circolare di 15 μm di diametro (Figura 2F) contenente i perossisomi desiderati acquisiti nel passaggio 3.4 a cui verrà applicata la sollecitazione ROS (vedere la Figura 3 per un esempio).
  6. Per applicare lo stress ROS, utilizzare 561 nm per le cellule con il ligando SLP marcato con diKillerRed-PTS1 o TMR e utilizzare 640 nm per le cellule colorate con il ligando SLP marcato con Janelia Fluor 646.
  7. Selezionare la lunghezza d'onda del laser per applicare la sollecitazione ROS. Immettere la percentuale laser desiderata e la durata (Figura 2G).
  8. Fare clic su Acquisisci e fare clic sul pulsante Stimolazione (Figura 2H) per avviare la scansione con luce a 561/640 nm attraverso i ROI per 30 s ciascuno. Ciò corrisponde a un'impostazione di potenza laser ~ 5% sia per 561 nm che per 640 nm sul microscopio confocale utilizzato qui. Questa operazione porterà alla produzione di ROS nei perossisomi.
    NOTA: è possibile selezionare ROI di diverse dimensioni. Si dovrebbe regolare proporzionalmente il tempo di illuminazione per ogni ROI in base alla sua area.
  9. Dopo 30 secondi di illuminazione laser, i perossisomi all'interno dei ROI avranno perso i loro segnali diKillerRed-PTS1/TMR/Janelia Fluor 646. Questa perdita di segnale consente di distinguere i perossisomi illuminati da quelli non illuminati (danneggiati vs. sani) all'interno di una cellula.

4. Monitoraggio della pexofagia nelle cellule vive mediante imaging time-lapse

  1. Seguire la traslocazione di Stub1, Hsp70, Ub, p62 o LC3B con tag EGFP sui perossisomi illuminati/ROS-stressati mediante imaging time-lapse utilizzando intervalli di 10 minuti tra i fotogrammi (per esempi, vedere Figure 3-7).
    NOTA: i segnali EGFP-Stub1 o EGFP-Hsp70 iniziano ad apparire 10-20 minuti dopo l'illuminazione e rimangono su tutti i perossisomi danneggiati fino a ~ 40 minuti dopo l'illuminazione. I segnali EGFP-Ub appaiono 30 minuti dopo l'illuminazione e durano per 2-3 ore. La traslocazione EGFP-p62 appare 60 minuti dopo l'illuminazione e i segnali EGFP-LC3B diventano visibili ~ 3 ore dopo l'illuminazione.
  2. Quantificare i segnali EGFP sui perossisomi danneggiati (da Stub1, Ub, p62 o LC3B) utilizzando ImageJ. Eseguire la procedura seguente per utilizzare ImageJ per quantificare un'immagine a tre canali (PMP34-TagBFP/EGFP-LC3B/HaloTag-VKSKL).
    1. Aprire l'immagine e applicare le selezioni Ellittiche o Selezioni a mano libera per racchiudere la regione contenente tutti i perossisomi illuminati (segnale PMP34-TagBFP positivo e segnale del ligando HaloTag sbiancato; Figura 8A).
    2. Fare clic su Duplica per selezionare il canale PMP34-TagBFP (Figura 8A). Impostare una soglia utilizzando il menu a discesa Immagine > Regola soglia > per contrassegnare i perossisomi (Figura 8B).
    3. Selezionare Analizza > Analizza particelle per determinare le regioni esatte dei perossisomi illuminati. ImageJ registra queste aree di interesse (ROI) nel gestore del ROI (Figura 8C).
    4. Fare clic su Duplica per scegliere il canale EGFP per analizzare il segnale di fluorescenza da Ub, p62 o LC3B coniugati EGFP (Figura 8D). Selezionare tutti i ROI in ROI Manager (Figura 8E).
    5. Applicare Measure nel ROI Manager per misurare i segnali EGFP sui perossisomi (Figura 8E). Trova il valore dell'area e della densità integrata (la somma di tutte le intensità di pixel) per ogni ROI nella tabella Risultati (Figura 8E).
    6. Per ottenere le intensità medie di fluorescenza dell'EGFP in diversi punti temporali dopo l'illuminazione, dividere l'intensità EGFP integrata per l'area totale dei perossisomi illuminati (aree negative del segnale PMP34-TagBFP e del ligando HaloTag). Per ottenere il segnale accumulato sui perossisomi, sottrarre l'intensità media in un punto temporale per l'intensità media al tempo = 0, quindi normalizzare l'intensità media al tempo = 0.

5. Danneggiare globalmente tutti i perossisomi (in ogni cellula) su un piatto di coltura

  1. Eseguire la fase 1 (preparazione di cellule che esprimono diKillerRed [diKillerRed-VKSKL] o SLP [SLP-VKSKL]) e la fase 2 (colorazione dei perossisomi con il ligando SLP [per la produzione di ROS attivati dalla luce]).
  2. Dopo 1 ora di colorazione del ligando marcato TMR, rimuovere il mezzo di colorazione e aggiungere 1 mL di terreno di coltura contenente 30 mM 3-AT (3-ammino-1,2,4-triazolo; un inibitore della catalasi).
    NOTA: La catalasi è uno scavenger ROS espresso nel lume del perossisoma, quindi il trattamento 3-AT aiuta ad aumentare il danno ossidativo indotto dalla luce sui perossisomi.
  3. Posizionare il piatto di coltura sopra un LED (555-570 nm). Illuminare tutte le celle con una densità di potenza di 1,8 W/cm2 per 9 ore in un'incubatrice.
    NOTA: Per eseguire questo passaggio all'esterno di un'incubatrice, posizionare il piatto di coltura su una piastra riscaldante a 37 °C. Aggiungere 20 mM HEPES al mezzo contenente 3-AT e coprire il piatto di coltura con una pellicola trasparente per ridurre al minimo lo scambio di gas. HEPES è un agente tampone che mantiene il pH fisiologico nella coltura cellulare al di fuori di un incubatore di CO2 durante l'illuminazione a LED.
  4. Convalidare il successo del danno indotto da LED mediante l'imaging dei segnali EGFP-Ub, EGFP-p62 o EGFP-LC3B sui perossisomi. Utilizzando la condizione di illuminazione descritta sopra, l'82% delle cellule SHSY5Y che esprimono stabilmente HaloTag-VKSKL ha mostrato una pesofagia mediata da Stub1.
  5. Raccogliere le cellule per l'analisi biochimica a valle.

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Risultati

Lo schema di induzione della pesofagia mediata da Stub1 mostrato qui sfrutta la generazione di ROS assistita da coloranti all'interno del lume del perossisoma. Questa operazione richiede intensità luminose minime. I perossisomi contenenti proteine fluorescenti o coloranti possono quindi essere illuminati utilizzando microscopi confocali a scansione laser standard. L'illuminazione focale porta alla produzione istantanea e localizzata di ROS all'interno dei singoli perossisomi, come indicato dal reporter fluorescente roGF...

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Discussione

Questo protocollo spiega in dettaglio come innescare la pesofagia mediata da Stub1 all'interno delle colture cellulari elevando i livelli di ROS perossisomale con la luce. Poiché il protocollo si basa sulla generazione di ROS assistita da coloranti, è necessario garantire un'espressione sufficiente di diKillerRed-VKSKL o colorazione del ligando SLP marcato con colorante all'interno delle cellule di interesse. Dato che diversi tipi di cellule o cellule di diverso background genetico possono ospitare perossisomi con prop...

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Divulgazioni

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una borsa di ricerca MOST 111-2311-B-001-019-MY3 del Consiglio nazionale della scienza e della tecnologia di Taiwan.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell MatTekP35G-1.5-20-C20 mm glass bottomed
3-amino-1,2,4-triazole (3-AT)Sigma AldrichA8056
bovine serumThermoFisher Scientific16170060
Cell culture incubatorNuaireNU-4750
diKillerRed-PTS1Academia Sinicamade by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL)
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)ThermoFisher Scientific11965092
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12)ThermoFisher Scientific11330032
EGFP-C1ClontechpEGFP-C1The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62
EGFP-Hsp70Academia SinicaHsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1
EGFP-LC3BAddgene11546
EGFP-p62Academia Sinicagenerated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1
EGFP-Stub1Academia Sinicagenerated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1
EGFP-UbAddgene11928
fetal bovine serumThermoFisher Scientific10437028
HaloTag TMR ligand PromegaG8252
HaloTag-PTS1Academia SinicaPTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone
HEPESThermoFisher Scientific15630080
Inverted Confocal Microscope OlympusFV3000RS405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,  microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment
Janelia Fluor 646 HaloTag LigandPromegaGA1120
LEDVitaStarPAR6480 W, 555-570 nm
lipofectamine 2000 ThermoFisher Scientific11668transfection reagent
NIH3T3 cellATCCCRL-1658adherent
Opti-MEMThermoFisher Scientific319850reduced serum media
penicillin/streptomycinThermoFisher Scientific15140
PMP34-TagBFPAcademia SinicaPMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171)
roGFP2-PTS1Academia Sinicagenerated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1
SHSY5Y cellATCCCRL-2266adherent

Riferimenti

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