Quantificazione dei costi di fitness nelle zanzare transgeniche Aedes aegypti

Riepilogo

Il presente protocollo descrive come misurare i dati dei parametri di vita comuni nelle zanzare Aedes aegypti , tra cui fecondità, dimensioni delle ali, fertilità, rapporto tra i sessi, vitalità, tempi di sviluppo, contributo maschile e longevità adulta. Queste misurazioni possono essere utilizzate per valutare l'idoneità delle zanzare transgeniche.

Abstract

Le zanzare transgeniche spesso mostrano costi di fitness rispetto alle loro controparti di tipo selvatico. A questo proposito, gli studi sui costi di fitness prevedono la raccolta di dati sui parametri di vita da zanzare geneticamente modificate e il loro confronto con zanzare prive di transgeni dello stesso background genetico. Questo manoscritto illustra come misurare i tratti comuni della storia della vita della zanzara Aedes aegypti, tra cui la fecondità, le dimensioni e la forma delle ali, la fertilità, il rapporto tra i sessi, la vitalità, i tempi di sviluppo, il contributo maschile e la longevità adulta. Questi parametri sono stati scelti perché riflettono il successo riproduttivo, sono semplici da misurare e sono comunemente riportati in letteratura. I risultati rappresentativi quantificano i costi di fitness associati a un knock-out genico o a un singolo inserimento di un elemento gene drive. Standardizzare il modo in cui vengono raccolti i dati sui parametri di vita è importante perché tali dati possono essere utilizzati per confrontare la salute delle zanzare transgeniche generate negli studi o per modellare il tasso di fissazione transgenica in una popolazione di zanzare di tipo selvatico simulata. Sebbene questo protocollo sia specifico per l'Aedes aegypti transgenica, il protocollo può essere utilizzato anche per altre specie di zanzare o altre condizioni di trattamento sperimentale, con l'avvertenza che alcuni contesti biologici possono richiedere adattamenti speciali.

Introduzione

La sopravvivenza del più adatto è l'idea darwiniana che gli individui che ospitano i geni più adattati al loro ambiente trasmetteranno quei geni^{alle generazioni successive}. Ciò significa che è la fitness che determina se i loro geni sopravviveranno. Questo concetto di oltre 150 anni fa è forse il fattore determinante più significativo per l'ingegnerizzazione di un gene drive di successo nelle zanzare transgeniche. I gene drive, o il modello di ereditarietà super-mendeliana di un elemento genetico egoista che gli permette di diffondersi attraverso le popolazioni², sono in fase di studio per la gestione genetica^{dei parassiti 3}. Nel contesto del controllo dei vettori, questa strategia mira a sostituire gli artropodi wild-type (WT) con quelli resistenti ai patogeni (modificazione della popolazione) o a eliminarli del tutto (soppressione della popolazione)⁴. Tuttavia, le zanzare transgeniche spesso mostrano costi di fitness (chiamati anche carico genetico) rispetto alle loro controparti WT, il che significa che il transgene andrà perso nelle popolazioni che possono superarle. L'accoppiamento dei transgeni con un sistema di gene drive è quindi necessario per compensare eventuali costi di fitness e spingere il transgene attraverso la popolazione a livelli maggiori di quelli attesi dalla tipica eredità mendeliana⁴.

Studi di laboratorio su specie di zanzare vettori hanno dimostrato che i transgeni spesso mostrano costi di fitness ^5,6,7. Ad esempio, Irvin et al. ha misurato vari parametri di vita in Aedes (Ae.) aegypti ingegnerizzati per esprimere la proteina fluorescente verde potenziata (eGFP) o i geni della trasposizione sotto Drosophila actin 5C o promotori sintetici 3XP3 e li ha confrontati con il ceppo Orlando wild-type (lo stesso background genetico da cui sono derivati)⁵. In particolare, hanno scoperto che tutti i ceppi transgenici avevano una capacità riproduttiva significativamente ridotta⁵. A seconda del transgene, alcune zanzare Anopheles (An.) che esprimono transgeni che inibiscono lo sviluppo del parassita Plasmodium hanno anche mostrato costi di fitness⁶. In particolare, An. stephensi che esprime una fosfolipasi veleno d'api (PLA2) sotto promotori costitutivi o inducibili dal pasto di sangue ha deposto un numero significativamente inferiore di uova rispetto ai controlli⁶. Questi autori hanno anche scoperto che gli Anopheles transgenici che esprimono un transgene diverso, un tetramero dodecapeptide SM1, non mostravano costi di fitness, portandoli a concludere che i costi di fitness conferiti dal transgene sono dipendenti, almeno probabilmente in parte, dall'effetto della proteina transgenica prodotta⁶. In effetti, i costi di fitness possono essere attribuiti a prodotti transgenici, effetti posizionali, effetti off-target, mutagenesi inserzionale o effetti di consanguineità in ceppi allevati in laboratorio⁷. I gene drive devono quindi essere sufficientemente robusti da compensare questi costi di fitness indotti dai transgeni, evitando al contempo lo sviluppo di inserzioni e delezioni (indel) che bloccano il drive stesso.

I costi dello sviluppo o dell'idoneità riproduttiva possono essere misurati in studi di laboratorio o in gabbia⁷, con l'avvertenza che anche fattori sconosciuti nel campo possono avere un impatto. Ciononostante, gli studi controllati di fitness sono un primo passo importante quando si pianificano o si valutano i rilasci di zanzare geneticamente modificate, come un programma di gene drive, per determinare se la linea transgenica persisterà nelle generazioni successive. Ad esempio, Hammond et al. valutato Un gene drive basato su CRISPR/Cas9 di gambiae destinato a interrompere i geni necessari per la fertilità femminile⁸. Attraverso studi in gabbia mantenuti per almeno 25 generazioni, gli autori hanno scoperto che le zanzare incorrevano in alleli resistenti al gene drive che bloccavano la scissione mirata a CRISPR e ripristinavano^{la fertilità} femminile. I loro sforzi di modellazione hanno suggerito che la fertilità nelle femmine eterozigoti per il gene drive ha avuto gli impatti più drammatici sulla fissazione del gene drive in condizioni simulate⁸. Sulla stessa linea, Ae. aegypti (Higgs' White Eye strain, HWE) ingegnerizzato per esprimere cassette di gene drive autonomo sotto diversi promotori o in diversi loci intergenici ha mostrato diversi tassi di fissazione del gene drive nelle popolazioni simulate⁹. Utilizzando il modello MGDrivE¹⁰, combinato con i tassi misurati di formazione di indel, gli effetti materni e i dati dei parametri di vita raccolti in laboratorio, gli autori hanno scoperto che la fitness delle zanzare ha influenzato maggiormente la persistenza del gene drive in condizioni simulate⁹. I costi di fitness che hanno maggiori probabilità di compromettere l'efficienza del gene drive sono attribuibili alla (sovra)espressione somatica di Cas9 o al gene che è bersaglio, in particolare negli eterozigoti, piuttosto che al drive intrinseco stesso 11,12,13,14,15,16,17.

Data la sua importanza, l'idoneità è un fattore importante per la capacità di una linea transgenica di persistere nelle generazioni successive e può essere utilizzata come indicatore di eventuali effetti fisiologici associati a un transgene. Ad esempio, gli effetti fuori bersaglio possono essere associati ai costi di fitness. In questo caso, si consiglia di reincrociare una linea transgenica per diverse generazioni. Inoltre, l'attraversamento della linea transgenica con una che riflette una popolazione di campo può anche essere necessario per studiare quanto bene la popolazione transgenica possa competere nel mondo reale. Per quantificare i costi di fitness in modo che possano essere confrontabili, questo manoscritto fornisce semplici protocolli per misurare i tratti comuni della storia di vita nelle zanzare Ae. aegypti, con particolare enfasi sui costi di fitness associati ai transgeni, in modo che tali studi possano essere riprodotti più facilmente. I protocolli includono fecondità, fertilità, rapporto tra i sessi, vitalità, tempi di sviluppo, contributo maschile e longevità adulta. Anche la misurazione della lunghezza e dell'area delle ali è stata scelta come misura di fitness in quanto è correlata alla lunghezza del torace^18,19 e alle misure delle dimensioni del corpo, che è direttamente collegata alle dimensioni, alla fecondità e all'immunità del pasto di sangue^20,21. Sebbene esistano molti modi per valutare l'idoneità, questi parametri sono stati scelti perché riflettono il successo riproduttivo, sono semplici da misurare e sono comunemente riportati in letteratura.

Protocollo

NOTA: Questo protocollo è stato scritto per le linee transgeniche e wild-type di Ae. aegypti che sono state precedentemente convalidate e stabilite. Per ulteriori informazioni sulla generazione transgenica di Ae. aegypti, vedere Kistler et al.²² e Coates et al.²³. Tutti gli esperimenti descritti di seguito sono stati eseguiti secondo le procedure standard di allevamento di Ae. aegypti . Le zanzare sono state mantenute a 28 °C con un'umidità relativa del 75%-80% e un ciclo di 12 ore di luce/12 ore di buio. A fini statistici si consiglia vivamente un minimo di 100 cartine per uova singole per macchia di zanzara. Gli studi completi sulla fitness richiedono circa 3 mesi per essere completati (Figura 1).

1. Misurare la fecondità nelle zanzare femmine

1. Schiude le zanzare transgeniche e WT (dello stesso background genetico ma prive del transgene) mettendo la carta delle uova in acqua sterile durante la notte nell'insetto, seguendo le condizioni standard di allevamento. Lasciare che le larve si nutrano ad libitum fornendo diverse gocce (ciascuna di circa 50 μL) di liquame di cibo macinato per pesci (Tetramina) (circa il 30% p/v). Le larve del primo stadio sono riconoscibili 1 giorno dopo la schiusa. Mettere le larve in contenitori più grandi in modo che non ci sia affollamento, generalmente si possono allevare 100-150 larve in un volume d'acqua di 1 litro con una superficie di circa 250 cm². Continuare a fornire liquame di tetramina come fonte di cibo, consentendo alle larve di nutrirsi ad libitum. Aggiungere l'impasto alimentare in goccioline discrete in modo che sia sempre disponibile cibo sufficiente per le larve e in modo che l'acqua non appaia torbida. Le larve aumenteranno di dimensioni ad ogni stadio e alla fine entreranno in pupa nelle vasche larvali.
2. Una volta che le pupe iniziano ad emergere, ~5-6 giorni dopo la schiusa, separatele per sesso per assicurarvi che gli adulti siano vergini una volta emersi (per il successivo accoppiamento), come descritto di seguito.
   1. Per ordinare le pupe in base al sesso, inizia raccogliendo le pupe usando pipettatori di plastica da 3 ml in piccoli bicchieri di plastica contenenti acqua di rubinetto pulita. Le pupe maschili tendono ad essere più piccole e tendono ad emergere per prime rispetto alle femmine. Innanzitutto, ordina le pupe per dimensione, quindi conferma questa schermata iniziale per morfologia.
   2. Spostare la pupa su un vetrino da microscopio e rimuovere l'acqua in eccesso con un fazzoletto. Questo immobilizza la pupa. Sotto uno stereoscopio con ingrandimento 2x-4x, posizionare la pupa con il lato ventrale rivolto verso l'alto usando un pennello a punta fine.
   3. Analizzare visivamente la coda per le differenze nella forma del lobo genitale (alla fine dei segmenti addominali pupali dietro le pale; Figura 2). Le femmine hanno pinne appuntite che si estendono oltre i lobi genitali, assomigliando all'incirca a una corona o a denti di vampiro, mentre i lobi genitali maschili sono arrotondati e non hanno queste strutture appuntite. Vedi Carvalho et al.²⁴ per le figure aggiuntive.
3. Metti le pupe maschili e femminili in tazze d'acqua separate e mettile in un contenimento adeguato, ad esempio, cartoni da 1,9 L (1/2 gallone o 64 once) con tessuto di organza bianco da 0,2 m x 0,2 m (8 pollici x 8 pollici), ciascuno contenente ~ 150 pupe.
4. Fornisci una fonte di zucchero e acqua sopra le gabbie (ad esempio, uvetta e una tazza piena d'acqua coperta di garza, fissata con due elastici). Taglia un foro delle dimensioni di una penna nei cartoni e coprilo con un tappo di gomma in modo che altre pupe possano essere aggiunte alle gabbie man mano che emergono.
5. A 3-5 giorni dall'emergenza adulta, anestetizzare le zanzare posizionando i cartoni a 4 °C per ~2-5 minuti. Sebbene possano ancora contrarsi, le zanzare sono sufficientemente anestetizzate una volta che la maggior parte cade sul fondo del cartone. Mettere le zanzare su una capsula di Petri di vetro con ghiaccio per ~30 min-1 h.
   NOTA: Lasciare le zanzare a 4 °C per troppo tempo può avere un impatto significativo sulla loro salute, anche se non abbiamo riscontrato alcun impatto se vengono lasciate sul ghiaccio per un massimo di 1 ora.
6. Incrociare in massa maschi WT o GD1 o GD2⁹ transgenici (gene drive basato su CRISPR/Cas-9) con femmine vergini WT (di controllo) aggiungendo zanzare anestetizzate in rapporti di cinque WT o maschi transgenici per una femmina WT in cartoni per zanzare, ciascuno contenente ~ 150 zanzare. Assicurati di etichettare le gabbie per tipo di maschio.
   NOTA: Questo schema di incrocio serve a determinare l'idoneità per gli emizigoti GD1 o GD2⁹ (cioè le zanzare che ospitano una copia del transgene). Per determinare l'idoneità per le linee transgeniche omozigoti, lo schema di incrocio può essere adattato in modo che maschi e femmine transgenici possano accoppiarsi rispetto agli incroci di maschi e femmine WT.
7. Dopo 2-3 giorni, il sangue nutre le femmine seguendo le pratiche di allevamento standard²⁵ fornendo una fonte di sangue sopra la gabbia. Rimuovere la fonte di zucchero 24 ore prima dell'alimentazione e la fonte d'acqua ~2-3 ore prima dell'alimentazione per aumentare l'efficienza dell'alimentazione.
8. Dopo l'alimentazione del sangue, anestetizzare le zanzare posizionandole a 4 °C, come al punto 1.5.
9. Separa le femmine nutrite di sangue (completamente ingozzate) dalle femmine non nutrite controllando visivamente i loro addomi per l'ingorgo. Scartare i maschi non nutriti, parzialmente nutriti e parzialmente nutriti.
10. Rimetti le femmine gonfie nelle rispettive gabbie e fornisci una fonte di zucchero e acqua sopra le gabbie.
11. Dopo 2-3 giorni, posizionare le singole femmine in provette coniche da 50 ml rivestite con carta da filtro pre-etichettata a matita (Figura 3). Coprire i tubi conici con una rete e sigillare con due elastici.
12. Una volta che le femmine sono sveglie, riempi tutte le provette con ~5 ml di acqua del rubinetto. Metti un pezzetto di batuffolo di uvetta o cotone imbevuto di zucchero sopra ogni tubo conico. Lasciare le femmine per 1-2 giorni nell'insetto e lasciarle deporre le uova.
13. Dopo 1-2 giorni, scolare ogni tubo conico e anestetizzare le zanzare ponendole a 4 °C. Per una lavorazione rapida, utilizzare la punta di un pipettatore di plastica da 3 ml premuto contro la rete per drenare l'acqua da ciascun tubo conico. Ruotare i tubi a testa in giù e posizionarli sopra un tovagliolo di carta per scolarli. Posizionare le provette coniche da 50 mL in un portaprovette e posizionare il rack a 4 °C.
14. Raccogli la carta per uova e conta il numero di uova su ogni carta. Conta le femmine che non depongono le uova come 0 e includile nell'analisi. Calcola la fecondità media come il numero totale di uova contate su ogni foglio diviso per il numero totale di femmine sottoposte a screening.
    NOTA: Le immagini digitali delle singole cartine per uova possono fungere da registrazione visiva per la conferma del conteggio (Figura 4).
15. Asciugare le cartine all'uovo e rimetterle nell'insetto. Si consiglia di asciugare le cartine per uova per almeno 3-5 giorni per una schiusa ottimale²⁵.

2. Misurazione della lunghezza, dell'area e delle dimensioni del baricentro delle ali

1. Congelare almeno 25 femmine WT o transgeniche alimentate con sangue di pari età dallo studio di fecondità completato posizionando le gabbie per zanzare a -20 °C per circa 15 minuti.
   NOTA: Non congelare per un periodo di tempo più lungo e non scuotere o far cadere il contenitore, poiché ciò potrebbe causare la caduta delle ali dalle zanzare.
2. Sezionare l'ala sinistra di ciascuna zanzara, asportando all'articolazione dell'ala e del torace, rimuovendo l'intera ala, seguendo il protocollo seguente.
   1. In una mano, tieni la zanzara con una pinza, afferrando la regione del torace sotto le ali.
   2. Usando un altro paio di pinze nell'altra mano, seziona l'ala sinistra di ciascuna zanzara, asportando l'articolazione dell'ala e il torace usando una leggera pressione per staccare l'ala, rimuovendo l'intera ala senza strappare le vene dell'ala.
3. Usando una pinza, posiziona l'ala su un vetrino, sdraiata. Utilizzando una pipetta di trasferimento, aggiungere una goccia da una soluzione madre da 15 mL, composta al 70% da etanolo, e una goccia di detersivo per piatti sull'ala sul vetrino.
4. Aggiungere una goccia di glicerolo all'80% al vetrino coprioggetti e metterlo sopra l'ala nella soluzione di sapone all'etanolo.
5. Fotografare le ali montate sulle diapositive utilizzando una fotocamera con obiettivo da 65 mm (7D-65 mm-1x; zoom = 1, 200, 6,3, ISO = 100). Prendere nota della scala in pixel/mm e assicurarsi che rimanga la stessa per tutte le immagini. Se vengono riprodotte più ali insieme, ritaglia le foto su singole ali e aggiungi le barre di scala a ciascuna foto. Salva le immagini in formato TIFF con compressione LZW, con ogni immagine chiaramente etichettata con tutte le informazioni per la singola vela.
   NOTA: Le ali possono essere fotografate utilizzando una fotocamera e un ingrandimento diversi o con una fotocamera collegata a un microscopio per altri studi, se le impostazioni rimangono le stesse e la scala pixel/mm rimane la stessa per ogni ala fotografata nello studio. Il rapporto pixel/mm sarà preso in considerazione quando si determinano le misurazioni.
6. Scarica tpsUtil e tpsDig, che sono software gratuiti per l'elaborazione di immagini morfometriche. Vedi Rohlf ^26,27 per informazioni più dettagliate sul software.
7. Digitalizza le ali usando tpsUtil per creare un file TPS delle fotografie delle ali per la fase successiva della digitalizzazione.
   1. A tale scopo, aprire tpsUil e, in funzionamento, selezionare Crea file tps da immagini. Fare clic su input, selezionare il file contenente le singole immagini delle ali, quindi selezionare un'immagine qualsiasi per scegliere questa cartella. Fare clic su output e assegnare un nome al file che verrà creato in formato .tps. Fai clic su Salva.
   2. Quindi, in Azioni, fare clic su Configurazione. Seleziona Includi tutto, fai clic su Crea e chiudi la finestra pop-up. In operazione, selezionare Ordina casualmente i campioni. Fare clic su input e selezionare il file .tps appena creato. Fare clic su output, rinominare il file .tps per indicare che si tratta della versione del file con i campioni randomizzati e fare clic su Salva. Quindi, fai clic su Crea. Chiudere il programma tpsUtil.
      NOTA: Per ridurre l'errore di misurazione, le foto dell'ala possono essere duplicate e utilizzate due volte per una replica tecnica.
8. Utilizza il software tpsDig per identificare le coordinate cartesiane bidimensionali per i punti di riferimento. In input selezionare il file con estensione tps creato nel passaggio 2.7. Impostare la bilancia sulla scala determinata dal passaggio 2.5; In Opzioni selezionare Strumenti immagine e quindi fare clic su Misura.
9. Aggiungi punti di riferimento all'immagine facendo clic sull'icona del mirino blu che rappresenta i punti di riferimento digitalizzati, quindi fai clic sulle articolazioni delle ali indicate nella Figura 5, in ordine dal punto di riferimento 1 al punto di riferimento 14.
   NOTA: Questi punti di riferimento sono stati scelti perché sono stati precedentemente utilizzati nella digitalizzazione e nell'analisi dei punti di riferimento delle ali¹⁹, sono facili da individuare nelle giunture delle vene alari in molti campioni e forniscono abbastanza punti di riferimento delle ali per catturare le dimensioni e la forma dell'ala.
10. Quando si contrassegnano i punti di riferimento, contrassegnare eventuali punti di riferimento mancanti o oscurati (a causa di piegatura o danni dell'ala) come mancanti in tpsDig facendo clic sull'icona M per escluderli dall'analisi e mantenere l'ordine corretto dei punti di riferimento. Fare clic sulla freccia rossa rivolta a destra per ripetere la digitalizzazione del punto di riferimento per le immagini successive fino a quando tutte le immagini del file non sono state completate. Salva e chiudi il file.
    NOTA: I punti di riferimento devono essere aggiunti all'immagine dell'ala nell'ordine corretto per ogni immagine affinché i calcoli della lunghezza, dell'area e delle dimensioni dell'ala siano corretti.
11. Calcola la lunghezza e l'area dell'ala utilizzando lo script R fornito nel file supplementare 1, modificando la posizione del file .tps e la scala dell'immagine secondo l'esperimento.
12. Calcola la dimensione del baricentro dell'ala, una misura delle dimensioni statisticamente indipendente dalla forma, definita come la radice quadrata della somma delle distanze al quadrato di ciascuno dei punti di riferimento dal punto centrale dell'ala^28,29.
13. Usa un allineamento generalizzato di Procuste per rimuovere le variazioni di non forma e tracciare le coordinate medie dei punti di riferimento, usando ali che hanno tutti i punti di riferimento intatti. Sia per la dimensione del centroide dell'ala che per la determinazione del punto di riferimento medio, utilizzare lo script R fornito nel file supplementare 2, modificando la posizione del file .tps e la scala dell'immagine secondo l'esperimento.

3. Valutazione della fertilità degli ovuli

1. Far schiudere le singole uova F₁ dalle carte raccolte da singole femmine (raccolte nella fase 1) in contenitori di polipropilene trasparente contenenti ~100 ml di acqua deionizzata appena sterilizzata. Aggiungere due o tre gocce di liquame di mangime per pesci macinati per l'alimentazione ad libitum . Foderare la parte superiore dei contenitori con rete o organza e fissarli con un elastico.
2. A 2-3 giorni dalla schiusa, togliete le cartine d'uovo dall'acqua e lasciatele asciugare per una notte mettendole in un nuovo contenitore coperto con un coperchio o una rete e lasciandole nell'insetto.
3. Schiudi nuovamente le carte delle uova negli stessi contenitori in cui sono state inizialmente schiuse rimettendole nel contenitore dell'acqua.
   NOTA: L'essiccazione e la ri-schiusa delle cartine all'uovo migliora notevolmente l'efficienza della schiusa. Questo potrebbe non essere necessario per altre specie di zanzare.
4. A 3-5 giorni dalla schiusa iniziale, ispezionare visivamente le larve (dal 2^° al 4^° stadio) per un marcatore transgenico (se applicabile; Figura 6). Ispeziona contemporaneamente diverse larve al microscopio a fluorescenza posizionandole su un pezzo di carta da filtro posizionato sopra un'organza o una rete foderata con carta assorbente. I tovaglioli di carta assorbono l'acqua in eccesso, in modo che la carta da filtro possa essere utilizzata per schermare e manipolare le larve immobilizzate.
5. Registrare il numero di larve transgeniche positive o negative. Scartare le larve negative.
6. Pulire l'acqua larvale per garantire tempi di sviluppo ottimali. Per fare questo, pipettare le larve in una piccola tazza, scartare l'acqua sporca e sostituirla con acqua fresca del rubinetto Aggiungere le larve positive e assicurarsi che sia disponibile una quantità sufficiente di liquame di cibo per pesci macinati.
7. Calcola la fertilità come il numero di larve transgeniche o di controllo diviso per il numero totale di uova.

4. Determinazione del rapporto tra i sessi nelle pupe

1. Fino a 14 giorni dopo la schiusa, continuare a raccogliere e registrare il numero di pupe maschili e femminili (come descritto al punto 1.2.3). Le femmine o i maschi possono essere raggruppati, per sesso, in piccole tazze alloggiate in contenitori da 1,9 L.
2. Per determinare il rapporto tra i sessi, aggiungere il numero di femmine F₁ o il numero di maschi F₁ raccolti nella sequenza temporale dello studio per singola zanzara femmina adulta. Dividi questo numero per il numero totale di pupe raccolte per la stessa linea di zanzara generata da una singola femmina.

5. Determinazione della vitalità delle larve

1. Per determinare la vitalità delle larve, aggiungere il numero totale di pupe raccolte durante la sequenza temporale dello studio per singola zanzara femmina adulta.
2. Dividi questo numero per il numero totale di larve contate per ogni singola zanzara femmina adulta per la stessa linea contata nel passaggio 3.

6. Determinazione del tempo di sviluppo larve-pupe

1. Per determinare lo sviluppo da larve a pupe, tenere traccia del numero di larve e del numero di pupe per linea ogni giorno.
2. Calcola lo sviluppo da larve a pupe come il tempo medio per lo sviluppo delle pupe dopo la schiusa.

7. Determinazione del contributo maschile

1. Utilizzando maschi della stessa età, anestetizzare zanzare maschi transgenici vergini adulti sul ghiaccio, nonché zanzare vergini adulte maschi e femmine di controllo.
2. Incrocia gli adulti maschi transgenici o di controllo con le femmine adulte di controllo aggiungendo 50 maschi transgenici o 50 maschi di controllo (uguali per età) con 100 femmine di controllo in cartoni da 64 once, in modo che ci siano un totale di 50 maschi con 100 femmine (due femmine di controllo: un maschio di controllo o transgenico). Assicurati di etichettare quale cartone contiene maschi transgenici e quale cartone contiene maschi di controllo.
3. Lasciare che l'accoppiamento avvenga per 2-3 giorni. Trascorso questo tempo, offri alle zanzare un pasto di sangue seguendo le pratiche di allevamento standard.
4. Tre giorni dopo l'alimentazione del sangue, separare le singole femmine completamente gonfie in provette coniche da 50 ml rivestite con carta da filtro bianca pre-marcata, come descritto nella fase 1 (saggio di fecondità). Scartare le femmine non nutrite o offrire loro un altro pasto di sangue il giorno successivo. Riempi tutte le provette con ~5 ml di acqua del rubinetto. Posizionare un pezzettino di uvetta sulla rete posta sopra ogni tubo conico.
5. Lasciare le femmine per 1-2 giorni nell'insetto e lasciarle deporre le uova. Ispezionare visivamente le cartine per uova per 4-5 giorni dopo la farina di sangue per le uova. Lasciare alle femmine un giorno in più per deporre le uova per aumentare i tassi di deposizione delle uova.
6. Per raccogliere le cartine delle uova, scolare l'acqua e anestetizzare le femmine posizionando dei tubi conici a 4 °C, come descritto in precedenza. Scartare le zanzare femmine inserendo il 70% di etanolo.
7. Lasciare asciugare le cartine in tubi nell'insetto per almeno 5 giorni. Usa una pinza per rimuovere le carte e mettile in contenitori di polipropilene trasparente contenenti ~ 100 ml di acqua deionizzata appena sterilizzata per la schiusa. Aggiungere 2-3 gocce di liquame di mangime per pesci macinati per l'alimentazione ad libitum . Rivesti la parte superiore dei contenitori con rete o organza, fissata con un elastico.
8. A 2-3 giorni dalla schiusa, togliete le cartine d'uovo dall'acqua e lasciatele asciugare per una notte mettendole in un nuovo contenitore coperto con un coperchio o una rete e rimettendole nell'insetto.
9. Schiudi nuovamente le cartine per uova negli stessi contenitori rimettendole nel contenitore dell'acqua.
10. A 3-5 giorni dalla schiusa iniziale, ispezionare visivamente le larve (dal 2^° al 4^° stadio) per un marcatore transgenico (se applicabile). Calcola il contributo maschile come il numero di larve transgeniche F₂ diviso per il numero di larve totali per linea di zanzara.

8. Determinazione della longevità delle zanzare

1. Trasferire 50 zanzare maschi e 50 femmine di zanzare WT o transgeniche di età non alimentate con sangue in un recinto adeguato. Utilizzare cartoni da 64 once, con l'apertura superiore foderata con collant, attorcigliati e annodati, per un facile accesso e manipolazione delle zanzare man mano che l'esperimento procede (Figura 7).
   NOTA: Si consiglia di farlo in triplice copia a fini statistici.
2. Fornisci una fonte di zucchero e acqua. Qui venivano usati uvetta e una tazza piena d'acqua foderata con una garza, fissata con due elastici.
3. Tieni traccia del numero di zanzare maschi e femmine morti ogni giorno. Calcola la longevità come il numero medio di giorni trascorsi prima che le zanzare muoiano nelle gabbie, omettendo le zanzare che muoiono per cause non informative (cause non dovute alla durata della vita delle zanzare, come essere schiacciate o annegare nello zucchero) e omettendo le zanzare che sono ancora vive alla fine dello studio.
   NOTA: La sopravvivenza è definita come la probabilità di essere vivi fino al tempo t, o la funzione S(t) = Pr(T>t). La sopravvivenza mediana è il momento in cui la probabilità di sopravvivenza è 0,5, o T_0,5 = ^S-1 x 0,5.

Risultati

Seguendo il protocollo di cui sopra, è stata valutata l'idoneità di due linee di zanzara: (1) knock out mediato da CRISPR/Cas9 della proteina salivare Ae. aegypti D7L1 (AAEL006424) e (2) linee di Ae. aegypti che esprimono gene drive autonomi mediati da CRISPR/Cas9⁹. Nel primo caso, è stata stabilita una linea di knock-out omozigote D7L1 sfruttando la via di giunzione delle estremità non omologhe (NHEJ) per generare l'interruzione dopo la microiniezione di embrioni con sgRNA s...

Discussione

Gli studi di fitness di Ae. aegypti sono spesso eseguiti in laboratorio per valutare i costi di fitness associati al carico transgenico (ad esempio, elementi gene drive) o knock out genici, come discusso in questo manoscritto; tuttavia, questi studi possono essere eseguiti per una varietà di scopi, qualsiasi che miri a valutare la salute di un gruppo di Ae. aegypti, come^30,31 infetto da Wolbachia,^32,33<...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 oz. translucent plastic souffle cups	WebstaurantStore	301100PC
2 oz. translucent polystyrene souffle cups	WebstaurantStore	760P200N
3 mL plastic pipettors	Cornin	357524
50 mL conical tubes	Any brand
64 oz. white double poly-coated paper food cup	WebstaurantStore	999SOUP64WB	for mosquito enclosement
65 mm lens	Canon	MP-E 65mm f/2.8 1-5x Macro Photo	Canon Macro Photo MP-E 65mm, 7D-65mm-1X; zoom=1, 200, 6.3, ISO=100; for photographing wings or egg papers, although other cameras are likely sufficient
Aedes aegypti mosquitoes	BEI	multiple strains as eggs are available
Artifical membrane feeders	https://lillieglassblowers.com/	Meduim membrane feeder, Custom made, 33mm	Chemglass also offers, but sizes are wrong for us. Ours are about 3 cm?
ATP	MP Biomedical	ICN15026605	Any good quality ATP, 10mM filter sterile aliquots at -20
Autoclave			for sterilizing water for hatching
Canon EOS 7D camera	Canon	3814B004	for photographing wings or egg papers, although other cameras are likely sufficient
defibrinated sheep blood	Colorado Serum Co.	60 ml, every 2 weeks	https://colorado-serum-com.3dcartstores.com/sheep-defibrinated
Dual Gooseneck Microscope Illuminator	Dolan Jenner Fiber-Lite 180	181-1 System
Ethanol
Forceps	Dumont	5SF
Gauze		omnisorb ii	4" non-woven sponges
glass microscope slide	Fisher Scientific	12-544-2
Glass Petri dishes, 100 × 15 mm	VWR	75845-546	for anesthesizing/manipulating mosquitoes on ice
Hogs' gut	Any Deli		we buy in bulk, split, wash and store in small aliquots of ~4X12" at -20 in 50 ml conical
Ice
Ice bucket
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666A
Leica GZ4 StereoZoom microscope			for screening transgenic mosquitoes (if applicable)
Paintbrush	AIT synthetic brush	size 10-0	for manipulating larvae/pupae (Amazon)
Panty hose	Walmart	L'eggs Everyday	Women's Nylon Plus Knee Highs Sheer Toe, 16 pairs (plus fits the carton)
Pencils	Any brand
Plastic containers for 2° storage of cartons	Walmart		Sterilite 58 Qt Storage Box Clear Base White Lid Set of 8
Plastic containers for growing larvae	Walmart		Sterilite 28 Qt. Storage Box Plastic, White, Set of 10
Plastic containers for hatching larvae	Walmart		Sterilite 6 Qt. Storage Box Plastic, White
polypropylene clear deli containers	WebstaurantStore	127DM12BULK	12 oz, or 16 oz if needed for bigger (127RD16BULK)
Rubber bands	Office Max	#100736/#909606 /#3777415	12", #64 and #10
Rubber stopper	VWR	217-0515	for mosquito enclosement
Sugar source, such as sugar cubes or raisins
Tetramin flake food	Tetramin	16106
tpsDig	Stony Brook Morphometrics		A free morphometric image-processing software distributed online available at https://www.sbmorphometrics.org/
tpsUtil	Stony Brook Morphometrics		A free morphometric image-processing software distributed online available at https://www.sbmorphometrics.org/
White organza fabric 8” × 8”	FabricWholesale.com	4491676	Joann Casa Collection Organza Fabric by Casa Collection
Whitman Grade 1 Qualitative Filter paper	Whitman	1001-824	for egg papers. The white color makes it easier to see the black eggs.