Supporto composito a matrice microgel-extracellulare per la stampa 3D embedded di costrutti neurali umani

Riepilogo

Questo lavoro descrive un protocollo per la stampa 3D incorporata a forma libera di cellule staminali neurali all'interno di compositi di matrice extracellulare ricottura autorigeneranti. Il protocollo consente la modellazione programmabile di costrutti di tessuto neurale umano interconnessi con alta fedeltà.

Abstract

La stampa 3D incorporata di cellule all'interno di un mezzo di supporto granulare è emersa nell'ultimo decennio come un potente approccio per la biofabbricazione a forma libera di costrutti di tessuti molli. Tuttavia, le formulazioni granulari in gel sono state limitate a un numero limitato di biomateriali che consentono la generazione economica di grandi quantità di microparticelle di idrogel. Pertanto, i supporti di supporto in gel granulare sono generalmente privi delle funzioni adesive e istruttive delle cellule presenti nella matrice extracellulare nativa (ECM).

Per affrontare questo problema, è stata sviluppata una metodologia per la generazione di compositi riutilizzabili autoriparanti a matrice particelle-extracellulare (SHAPE). I compositi SHAPE sono costituiti da una fase granulare (microgel) e da una fase continua (soluzione ECM viscosa) che, insieme, consentono sia la stampa programmabile ad alta fedeltà che un ambiente extracellulare biofunzionale regolabile. Questo lavoro descrive come la metodologia sviluppata può essere utilizzata per la biofabbricazione precisa di costrutti neurali umani.

In primo luogo, le microparticelle di alginato, che fungono da componente granulare nei compositi SHAPE, sono fabbricate e combinate con un componente continuo a base di collagene. Quindi, le cellule staminali neurali umane vengono stampate all'interno del materiale di supporto, seguite dalla ricottura del supporto. I costrutti stampati possono essere mantenuti per settimane per consentire la differenziazione delle cellule stampate in neuroni. Allo stesso tempo, la fase continua del collagene consente la crescita assonale e l'interconnessione delle regioni. Infine, questo lavoro fornisce informazioni su come eseguire l'imaging a fluorescenza delle cellule vive e l'immunocitochimica per caratterizzare i costrutti neurali umani stampati in 3D.

Introduzione

La stampa 3D precisa e programmabile di costrutti di idrogel carichi di cellule che imitano i tessuti molli in vitro rappresenta una grande sfida. Ad esempio, i tentativi basati sull'estrusione diretta di idrogel morbidi sono intrinsecamente problematici, poiché le scarse proprietà meccaniche richieste per ricapitolare il microambiente in vivo portano a una mancanza di integrità strutturale, deformazioni delle caratteristiche predefinite o al completo collasso delle strutture fabbricate. Una soluzione convenzionale per questo problema consiste nel stampare un'impalcatura di supporto da un materiale biocompatibile più rigido che consenta al costrutto finale di mantenere la sua forma. Tuttavia, questo approccio limita notevolmente le possibilità di progettazione e richiede un'attenta messa a punto reologica degli inchiostri adiacenti.

Per superare i limiti della tradizionale stampa 3D basata sull'estrusione strato per strato, la stampa 3D incorporata è emersa negli ultimi anni come una potente alternativa alla fabbricazione di materiali morbidi e tessuti 1,2,3,4,5,6. Invece di estrudere l'inchiostro nell'aria ambiente sopra una superficie, l'inchiostro viene depositato direttamente attraverso un ago da siringa all'interno di un bagno di supporto che è solido a riposo ma fluidifica reversibilmente attorno alla punta dell'ago in movimento per consentire la deposizione precisa di materiale morbido carico di cellule. Il materiale depositato viene mantenuto in posizione mentre il supporto si risolidifica nella scia dell'ago. Pertanto, la stampa 3D integrata consente la fabbricazione a forma libera ad alta risoluzione di strutture complesse da biomateriali morbidi con possibilità di progettazione ampliate ^7,8.

I gel granulari sono stati ampiamente esplorati come materiali da bagno di supporto per la stampa 3D incorporata, poiché possono essere formulati per esibire transizioni solido-liquido lisce, localizzate e reversibili a basse sollecitazioni di snervamento 9,10,11. Mentre mostrano eccellenti proprietà reologiche per la stampa ad alta risoluzione, i gel granulari sono stati limitati a una manciata di biomateriali¹². La mancanza di diversità nelle formulazioni di gel granulari, che è particolarmente evidente se si considera l'ampia gamma di biomateriali disponibili per le formulazioni di idrogel sfuso, è causata dalla necessità di generare un gran numero di microgel utilizzando semplici sostanze chimiche. A causa del limitato panorama di biomateriali di supporti in gel granulare, la messa a punto del microambiente extracellulare fornito dal supporto di stampa rappresenta una sfida sul campo.

Recentemente, è stato sviluppato un approccio modulare per la generazione di supporti di stampa 3D incorporati, definiti compositi ricottura autoriparanti a matrice extracellulare (SHAPE)¹³. Questo approccio combina le distinte proprietà reologiche dei gel granulari con la versatilità biofunzionale delle formulazioni di idrogel sfuso. Il supporto composito SHAPE presentato è costituito da microparticelle di alginato impacchettate (fase granulare, frazione di volume ~ 70%) con uno spazio interstiziale aumentato riempito con una soluzione di pregel ECM a base di collagene viscoso (fase continua, frazione di volume ~ 30%). È stato inoltre dimostrato che il supporto SHAPE facilita la deposizione ad alta risoluzione di cellule staminali neurali umane (hNSCs) che, dopo la ricottura del bagno di supporto, possono essere differenziate in neuroni e mantenute per settimane per raggiungere la maturazione funzionale. La stampa 3D integrata all'interno del bagno di supporto SHAPE supera alcune delle principali limitazioni legate alle tecniche convenzionali per la biofabbricazione del tessuto neurale, fornendo al contempo una piattaforma versatile.

Questo lavoro descrive in dettaglio i passaggi per la stampa 3D incorporata di hNSC all'interno del supporto SHAPE e la loro successiva differenziazione in neuroni funzionali (Figura 1). In primo luogo, le microparticelle di alginato vengono generate attraverso la tosatura durante la gelificazione interna. Questo approccio consente la facile generazione di grandi volumi di microparticelle senza la necessità di attrezzature specializzate e reagenti citotossici. Inoltre, l'alginato è una fonte di materiale ampiamente disponibile ed economica per la formazione di substrati idrogel biocompatibili per una vasta gamma di tipi di cellule. Le microparticelle di alginato generate sono combinate con una soluzione di collagene per formare il materiale di supporto composito SHAPE. Quindi, gli hNSC vengono raccolti e caricati in una siringa come bioink cellulare per la stampa 3D. Una bioprinter 3D viene utilizzata per la stampa embedded basata sull'estrusione di hNSC all'interno del composito SHAPE. Le cellule stampate in 3D sono differenziate in neuroni per dare origine a costrutti neurali umani spazialmente definiti e funzionali. Infine, il protocollo descrive come i costrutti tissutali generati possono essere caratterizzati utilizzando l'imaging delle cellule vive e l'immunocitochimica. Inoltre, vengono forniti suggerimenti per l'ottimizzazione e la risoluzione dei problemi. In particolare, entrambi i componenti della fase granulare e continua potrebbero essere scambiati con altre formulazioni di idrogel per adattarsi a diverse porzioni biofunzionali, proprietà meccaniche e meccanismi di reticolazione, come richiesto da altri tipi di cellule e tessuti oltre le applicazioni neurali.

Protocollo

1. Preparazione dei tamponi e dei reagenti

1. Preparare il terreno di crescita cellulare aggiungendo i seguenti supplementi a DMEM / F12 con L-alanil-L-glutammina dipeptide: 30 mM di glucosio, 5 μM HEPES, 0,5% p/v di albumina sierica bovina ricca di lipidi, 40 μM di L-alanina, 40 μM di L-asparagina monoidrato, 40 μM di acido L-aspartico, 40 μM di acido L-glutammico, 40 μM di L-prolina, 1% di supplemento di N2, 1% di penicillina-streptomicina e 20 ng / L ciascuno di fattore di crescita epidermico (EGF) e fattore di crescita dei fibroblasti (FGF). Eseguire questi passaggi in un banco LAF (laminar air-flow).
2. Preparare una soluzione di alginato all'1% p/v in acqua ultrapura agitando energicamente per 4 ore a 60 °C. Filtrare sterile la soluzione di alginato caldo disciolto con un filtro da 0,45 μm in un banco LAF. Conservare a 4 °C.
   NOTA: Se la temperatura della soluzione di alginato è inferiore a 60 °C, non sarà possibile farla passare attraverso il filtro.
3. Preparare una soluzione di NaHCO₃ da 37 g/L in acqua ultrapura. Regolare il pH della soluzione a 9,5 utilizzando NaOH e filtrare la sterilizzazione in un banco LAF. Conservare la soluzione a 4 °C.

2. Preparazione del materiale composito SHAPE

1. Generazione di microparticelle di alginato
   1. Preparare una soluzione di 2 mg/mL di CaCO₃ in acqua ultrapura in un becher sterile. Mescolare 1:1 con la soluzione di alginato e mescolare per 1 ora a temperatura ambiente utilizzando un agitatore magnetico.
   2. Aggiungere l'acido acetico in un rapporto 1:500 e lasciare mescolare per una notte a 650 giri / min.
      NOTA: La soluzione di alginato inizierà immediatamente a gelificare. Assicurarsi di utilizzare un magnete di agitazione con la stessa lunghezza del diametro della vetreria utilizzata per garantire un'agitazione ottimale e omogenea del gel formante. Il giorno successivo, la soluzione generata agitando durante la gelificazione apparirà viscosa (Figura 2A).
   3. Frammentare meccanicamente la soluzione gelificata di alginato in microparticelle omogeneizzandola a 15.000 giri/min per 10 minuti con un omogeneizzatore posto in un banco LAF (Figura 2B).
   4. Centrifugare le microparticelle a 18.500 × g per 20 minuti (Figura 2C) a temperatura ambiente.
   5. Scartare con cautela il surnatante all'interno del banco LAF, risospendere le particelle in DMEM contenenti 2 mM NaOH e 1% P/S e incubare per una notte a 4 °C (Figura 2D).
      NOTA: il colore della sospensione dovrebbe tornare al rosso. Se la sospensione rimane gialla, aggiungere NaOH a goccia e mescolare fino a quando non diventa rosso (Figura 2E).
   6. Omogeneizzare le particelle a 15.000 giri/min per 3 minuti e centrifugare a 18.500 × g per 10 minuti a temperatura ambiente.
   7. Osservare il pellet (Figura 2F) e rimuovere attentamente il surnatante .
      NOTA: Il pellet di microparticelle di alginato strettamente imballate può essere conservato a 4 °C fino a un ulteriore utilizzo. Se la soluzione di alginato non è stata sterilizzata con filtro, le microparticelle devono essere consumate entro 1 settimana.
2. Formulazione composita SHAPE
   1. Il giorno prima della stampa, risospendere il pellet di microparticelle di alginato in due volte il volume del terreno di crescita contenente il 4% di HEPES (1 M di stock) e il 4% di soluzione di NaHCO₃ in un banco LAF e incubarlo durante la notte a temperatura ambiente.
   2. Centrifugare la sospensione di microgel a 18.500 × g per 10 minuti a temperatura ambiente e gettare il surnatante.
   3. Neutralizzare il collagene da miscelare con le microparticelle di alginato in un banco LAF. Diluire la soluzione madre di collagene per raggiungere una concentrazione finale di 1 mg / ml e neutralizzarla aggiungendo il 4% di HEPES e il 4% di NaHCO₃. Ad esempio, per 3 mL di composito SHAPE, mescolare 2 mL di microparticelle di alginato con 1 mL di collagene neutralizzato (0,12 mL di HEPES, 0,12 mL di NaHCO₃, 0,16 mL di terreno di crescita e 0,6 mL di collagene).
      NOTA: Tutti i materiali miscelati con collagene devono essere maneggiati su ghiaccio per evitare la polimerizzazione del collagene. Non appena il collagene viene neutralizzato, la polimerizzazione inizierà lentamente.
   4. Generare il composito SHAPE mescolando il pellet di microparticelle di alginato con il collagene diluito e neutralizzato in un rapporto 2: 1. Mescolare accuratamente il gel pipettando lentamente su e giù sul ghiaccio in una panca LAF.
      NOTA: Non vortice, poiché ciò introdurrà bolle nel materiale di supporto.
   5. In un banco LAF, trasferire il materiale composito generato in una lastra di micropozzetti raffreddata o in qualsiasi contenitore di stampa adatto e utilizzarlo entro 30 minuti (Figura 3E, F).

3. Coltura hNSC e preparazione del bioink

1. Coltura delle cellule in un matraccio T75 rivestito di membrana basale rivestito di estratto in terreno di crescita. Passare le celle almeno due volte dopo lo scongelamento prima di utilizzarle per un esperimento di stampa 3D.
2. Prima della stampa, dissociare le cellule enzimaticamente utilizzando una soluzione di tripsina allo 0,025% per 5 minuti a 37 °C, neutralizzare la tripsina con terreno di coltura e centrifugare la sospensione cellulare a 400 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 2-3 ml di terreno di crescita.
3. Eseguire un conteggio delle cellule, centrifugare le cellule a 400 × g e risospendere il pellet in terreno di crescita integrato con gomma xantana allo 0,1% (per evitare che le cellule sedimentino) ad una concentrazione finale di 9 × 10⁶ cellule / ml.
4. Utilizzare un ago metallico smussato da 21 G per caricare 100 μL di microparticelle di alginato strettamente imballate in una siringa (Figura 3A).
   NOTA: La creazione di un tappo con le microparticelle di alginato ha due scopi: aiuta a mantenere la stabilità dell'estrusione durante la stampa e consente l'estrusione completa dell'inchiostro cellulare caricato (nessun volume morto).
5. Utilizzando lo stesso ago, caricare la sospensione cellulare preparata nella siringa (Figura 3B).
   NOTA: prestare particolare attenzione a non introdurre bolle d'aria durante le fasi di caricamento della siringa. Le bolle d'aria causeranno instabilità durante la stampa.
6. Sostituire l'ago di carico con un ago metallico smussato da 27 G, che verrà utilizzato per la stampa (Figura 3C).

4. Stampa 3D incorporata

1. Progettare una struttura da stampare utilizzando il software di riferimento (vedere la tabella dei materiali).
   NOTA: Assicurarsi di regolare l'altezza iniziale della struttura stampata entro la profondità del supporto composito SHAPE. I suggerimenti di progettazione possono essere trovati nella Figura 4A (disegni a spirale e a palo).
2. Genera un G-Code facendo clic su Genera.
3. Inserire la siringa di vetro carica di cellule in una testina di estrusione volumetrica su un bioprinter basato sull'estrusione (Figura 3D).
4. Misurare la lunghezza dell'ago della siringa di vetro carica di cellule facendo clic su Misurazione lunghezza ago.
5. Posizionare la piastra o il contenitore del micropozzetto caricato con il composito SHAPE sulla stampante.
   NOTA: Mantenere la piastra cellulare o il contenitore a 4 °C fino alla stampa per evitare la reticolazione prematura del supporto.
6. Misurare l'altezza superficiale di un pozzetto vuoto all'interno della stessa piastra o contenitore del micropozzetto in cui viene caricato il gel SHAPE facendo clic su SHM (misurazione dell'altezza superficiale).
   NOTA: In alternativa, determinare manualmente l'altezza della superficie misurando l'altezza del pozzetto con l'ago.
7. Impostare la velocità di estrusione su 3,6 μL/min e la velocità di avanzamento su 0,3 mm/s.
   NOTA: Assicurarsi di testare l'estrusione prima di stampare. La sedimentazione cellulare può causare l'intasamento dell'ugello e può essere evitata pre-estrudendo un piccolo volume prima della stampa incorporata effettiva o aggiungendo un volume di retrazione alla siringa volumetrica. In alcuni casi, la velocità di avanzamento deve essere mantenuta al di sotto di 0,5 mm/s quando l'ago viene inserito o esce dal gel SHAPE per evitare il trascinamento dell'inchiostro.
8. Caricare il G-Code nell'interfaccia utente della stampante.
   NOTA: un nuovo G-Code deve essere generato ogni volta che vengono apportate modifiche alla struttura progettata.
9. Avviare la procedura di stampa facendo clic su Esegui (Figura 3G).
10. Immediatamente dopo la stampa, posizionare il gel SHAPE a 37 °C in un incubatore per colture cellulari per 30 minuti per la ricottura.
11. Aggiungere delicatamente il terreno di crescita sopra il supporto in gel SHAPE ricotto.
12. Il giorno successivo, sostituire il terreno di coltura con terreno di differenziazione formulato come segue: DMEM/F12 con L-alanil-L-glutammina dipeptide con 30 mM di glucosio, 5 μM HEPES, 0,5% p/v di albumina sierica bovina ricca di lipidi, 40 μM di L-alanina, 40 μM di L-asparagina monoidrato, 40 μM di acido L-aspartico, 40 μM di acido L-glutammico, 40 μM di L-prolina, 1% di supplemento di N2, 1% di penicillina-streptomicina, 100 μM di dibutirril-adenosina monofosfato ciclico (dibutirril-cAMP), e 2 ng/mL di fattore neurotrofico derivato da linee cellulari gliali (GDNF).
    NOTA: assicurarsi di non danneggiare l'idrogel durante i cambi del mezzo. Inclinare la piastra e rimuovere delicatamente il vecchio mezzo. Aggiungere fresco a goccia sulla parete del pozzetto contenente il gel piuttosto che direttamente sopra il gel. Non utilizzare un aspiratore per rimuovere il fluido.
13. Aggiornare il mezzo di differenziazione ogni 2 giorni fino all'endpoint sperimentale.

5. Imaging a fluorescenza a cellule vive

1. Rimuovere il mezzo in eccesso dal gel.
2. Aggiungere un volume uguale di 20 μM di Calceina AM (diluito in mezzo di differenziazione dalla soluzione madre) al volume del gel di supporto.
3. Incubare per 40 min a 37 °C.
4. Rimuovere la soluzione di Calcein AM e aggiungere un volume appropriato di mezzo di differenziazione fresco.
5. Trasferire la piastra al microscopio per l'imaging.

6. Immunocitochimica

1. Rimuovere il mezzo in eccesso dal gel.
2. Utilizzando una piccola spatola, trasferire il gel in un contenitore più grande contenente DPBS.
3. Lavare tre volte per 20 minuti ogni volta con DPBS e trasferire la piastra in una cappa aspirante.
4. Rimuovere il DPBS, aggiungere una soluzione di formaldeide al 4% sufficiente a coprire il gel e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
5. Lavare tre volte con DPBS per 20 minuti ogni volta.
6. Preparare una soluzione bloccante composta da siero d'asino al 5%, detergente allo 0,25% e azoturo di sodio allo 0,02% in DPBS.
   NOTA: Preparare tre volte il volume necessario per coprire il gel; Sarà utilizzato in seguito come base per le soluzioni anticorpali primarie e secondarie.
7. Dopo il lavaggio con DPBS, aggiungere la soluzione bloccante al gel e incubare per 6 ore a temperatura ambiente per evitare un legame non specifico. Culla delicatamente il piatto.
8. Preparare la soluzione anticorpale primaria diluendo l'anticorpo TUBB3 in soluzione bloccante in un rapporto di 1:1.000.
9. Rimuovere la soluzione bloccante dal gel, aggiungere la soluzione anticorpale primaria e incubare per 48 ore a 4 °C. Culla delicatamente il piatto.
10. Lavare tre volte con DPBS per 20 minuti ogni volta.
11. Preparare la soluzione anticorpale secondaria diluendo il 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, 1:1.000) e l'anticorpo secondario (1:200) in soluzione bloccante.
12. Dopo il lavaggio con DPBS, incubare il gel nella soluzione anticorpale secondaria per 24 ore a 4 °C. Culla delicatamente il piatto.
13. Lavare tre volte con DPBS per 20 minuti ogni volta e conservare a 4 °C fino all'imaging.
14. Prima dell'imaging, trasferire il gel colorato con una spatola su un piatto o una piastra a pozzetto con un fondo di imaging sottile.

Risultati

La preparazione del microgel di alginato tramite assottigliamento a taglio durante la gelificazione interna seguita da frammentazione meccanica produce microgel di alginato di dimensioni polidisperse e di forma simile a scaglie come mostrato nella Figura 2G. La dimensione di queste particelle irregolari varia da meno di 1 μm a circa 40 μm di diametro. Quando sono ben imballate, le microparticelle formano un materiale sfuso trasparente che è solo leggermente più opaco del corrisp...

Discussione

L'approccio ai materiali compositi SHAPE fornisce un percorso versatile per la formulazione di bagni di supporto ricottura e biofunzionali per la stampa 3D incorporata di inchiostri cellulari. Mentre questo protocollo fornisce un esempio della stampa 3D di costrutti neurali, la cassetta degli attrezzi SHAPE potrebbe essere facilmente adattata alla biofabbricazione con altre fonti cellulari per l'ingegneria precisa di una gamma di tipi di tessuto target. L'approccio di stampa consentirebbe anche il pattern preciso di più...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Gastight Syringe 1001 TLL	Hamilton	81320
3DDiscovery 3D bioprinter	RegenHU
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
AlbuMAX	ThermoFisher	11020021
Alexa Fluor 488 secondary antibody	ThermoFisher	A-11001	Goat anti-Mouse
Blunt Needle, Sterican (21 G)	Braun	9180109
Blunt Needle (27 G)	Cellink	NZ5270505001
BioCAD software	SolidWorks
Calcein AM	ThermoFisher	65-0853-39
Calcium carbonate	Sigma-Aldrich	C5929
Dibutyryl-cAMP sodium salt	Sigma-Aldrich	D0627
Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL)	R&D Systems	3440-100-01
DAPI	ThermoFisher	62248
DMEM/F-12, GlutaMAX	ThermoFisher	10565018
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663
DPBS	ThermoFisher	14190094
EGF	R&D Systems	236-EG
FGF	R&D Systems	3718-FB
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9	Sigma-Aldrich	100496
GDNF	R&D Systems	212-GD
Geltrex	ThermoFisher	A1569601
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES Buffer (1 M)	ThermoFisher	15630080
L-Alanine	Sigma-Aldrich	5129
L-Asparagine monohydrate	Sigma-Aldrich	A4284
L-Aspartic acid	Sigma-Aldrich	A9256
L-Glutamic acid	Sigma-Aldrich	G1251
L-Proline	Sigma-Aldrich	P0380
Magnetic stirrer RET basic	IKA	3622000
N-2 Supplement	ThermoFisher	17502048
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher	15140122
S25N-10G dispersing tool	IKA	4447100
Sodium Alginate (80-120 cP)	FUJIFILM Wako	194-13321
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizer	IKA	3720000
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Trypsin/EDTA Solution	ThermoFisher	R001100
TUBB3 antibody	BioLegend	801213	Mouse
Xanthan gum	Sigma-Aldrich	G1253