Modellazione di tumori cerebrali in vivo utilizzando la somministrazione basata sull'elettroporazione di DNA plasmidico che rappresenta le firme di mutazione del paziente

Riepilogo

L'utilizzo di un modello tumorale autoctono immunocompetente guidato da mutazioni comuni dei pazienti per i test preclinici è fondamentale per i test immunoterapici. Questo protocollo descrive un metodo per generare modelli murini di tumore cerebrale utilizzando la somministrazione basata sull'elettroporazione di DNA plasmidico che rappresenta le mutazioni comuni dei pazienti, fornendo così un modello murino accurato, riproducibile e coerente.

Abstract

I modelli tumorali sono fondamentali per i test preclinici dei tumori cerebrali in termini di esplorazione di nuovi trattamenti più efficaci. Con un interesse significativo per l'immunoterapia, è ancora più importante disporre di un modello murino coerente, clinicamente pertinente e immunocompetente per esaminare le popolazioni di cellule tumorali e immunitarie nel cervello e la loro risposta al trattamento. Mentre la maggior parte dei modelli preclinici utilizza il trapianto ortotopico di linee cellulari tumorali consolidate, il sistema di modellazione qui presentato consente una rappresentazione "personalizzata" delle mutazioni tumorali specifiche del paziente in uno sviluppo graduale ma efficace da costrutti di DNA inseriti in cellule precursori neurali (NPC) in divisione in vivo. I costrutti di DNA presentano l'analisi a mosaico con il metodo MADR (dual-recombinase-mediated cassette exchange), che consente la mutagenesi somatica a copia singola delle mutazioni driver. Utilizzando cuccioli di topo appena nati tra la nascita e i 3 giorni di età, gli NPC vengono presi di mira sfruttando queste cellule divisorie che rivestono i ventricoli laterali. La microiniezione di plasmidi di DNA (ad esempio, derivati da MADR, trasposoni, sgRNA diretti da CRISPR) nei ventricoli è seguita dall'elettroporazione utilizzando pale che circondano la regione rostrale della testa. Dopo la stimolazione elettrica, il DNA viene assorbito nelle cellule in divisione, con il potenziale di integrarsi nel genoma. L'uso di questo metodo è stato dimostrato con successo nello sviluppo di tumori cerebrali sia pediatrici che adulti, incluso il tumore cerebrale maligno più comune, il glioblastoma. Questo articolo discute e dimostra le diverse fasi dello sviluppo di un modello di tumore cerebrale utilizzando questa tecnica, compresa la procedura di anestesia di giovani cuccioli di topo, alla microiniezione della miscela plasmidico, seguita dall'elettroporazione. Con questo modello murino autoctono e immunocompetente, i ricercatori avranno la possibilità di espandere gli approcci di modellazione preclinica, nel tentativo di migliorare ed esaminare l'efficacia del trattamento del cancro.

Introduzione

I modelli murini di tumore cerebrale sono cruciali per comprendere i meccanismi di formazione e trattamento del tumore cerebrale. I modelli attuali includono tipicamente trapianti sottocutanei o ortotopici prodotti rapidamente di linee cellulari tumorali comunemente usate, sulla base di un numero limitato di mutazioni driver o modelli di xenotrapianto derivati da pazienti, utilizzando topi immunodeficienti che ostacolano i corretti studi di immunoterapia 1,2,3,4. Inoltre, questi risultati preclinici possono portare a falsi positivi, in quanto tali modelli possono mostrare effetti drammatici, spesso curativi, in risposta alla terapia, ma questo non si traduce nella clinica 2,5,6,7. Avere la capacità di produrre rapidamente modelli murini preclinici geneticamente modificati che riflettano maggiormente le firme delle mutazioni dei pazienti è fondamentale per migliorare la validità dei risultati preclinici.

La somministrazione basata sull'elettroporazione (EP) di plasmidi di DNA per indurre mutazioni sia con perdita di funzione (LOF) che con guadagno di funzione (GOF) consente la generazione di tali modelli. Abbiamo sviluppato un metodo per una rappresentazione ancora più precisa delle mutazioni del driver GOF, chiamato analisi a mosaico con scambio di cassette mediato da doppia ricombinasi, o MADR⁸. Questo metodo consente l'espressione di uno o più geni di interesse in modo controllato e locus-specifico nelle cellule somatiche⁸. In combinazione con altri strumenti molecolari, come le ripetizioni palindrome brevi raggruppate regolarmente interspaziate (CRISPR), diverse mutazioni dei pazienti possono essere combinate per sviluppare modelli murini di tumore cerebrale. Questo metodo è stato utilizzato per diversi tumori cerebrali pediatrici, tra cui gliomi ed ependimomi⁸, nonché modelli di tumore cerebrale adulto, come il glioblastoma (GBM).

Sebbene il metodo EP di modellazione tumorale non sia così comune come un trapianto, quanto segue dimostra finora la facilità e l'elevata riproducibilità di questo sistema di modellazione. I topi mTmG sono utilizzati per l'inserimento del DNA plasmidico^{MADR 8,9}. Questo sistema consente la ricombinazione dei siti bersaglio della ricombinasi (FRT) di loxP e Flp situati nel locus Rosa26 per il successivo inserimento del plasmide di DNA del donatore (cioè il gene GOF di interesse)^8,9. Il seguente protocollo dimostra la semplicità di questo metodo dopo una pratica diligente e la capacità di sviluppare modelli di tumore cerebrale murino in modo autoctono e coerente.

Protocollo

Tutte le procedure di questo protocollo sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali del Cedars Sinai Medical Center (IACUC). I topi omozigoti mTmG sono stati incrociati con topi C57BL/6J per ottenere cucciolate di topi mTmG eterozigoti di sesso misto da utilizzare nel seguente protocollo. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). I cuccioli di topo sono stati elettropolizzati tra i giorni postnatali 0 e 3 (P0-P3).

1. Configurazione chirurgica

1. Spruzzare sul tavolo operatorio un disinfettante chimico (ad es. Vimoba) e strofinare, seguito da etanolo al 70%, quindi pulire di nuovo.
2. Posizionare i seguenti strumenti/materiali sul tavolo operatorio: pipette capillari in vetro tirato (vedere il riferimento¹⁰ su come estrarre le pipette), piccole forbici, contenitore per rifiuti di piccoli oggetti taglienti a rischio biologico, pipettatore da microlitri e puntali per pipette, 2 pezzi quadrati tagliati di pellicola di paraffina, gel per elettrodi, elettrodi, supporto per il microiniettore e miscela di plasmidi di DNA (vedere Tabella dei materiali e file supplementare 1).
3. Posizionare i seguenti accessori sull'apparecchiatura sul tavolo operatorio o sul pavimento quando indicato: pannello di controllo del microiniettore, supporto e spina collegati alla macchina, supporto per tenere il supporto del microiniettore lateralmente (ausilio per la saldatura), pedale del microiniettore (sul pavimento), elettrodi collegati alla macchina e pedale dell'elettrodo (sul pavimento) (vedere Tabella dei materiali).
   NOTA: Il pedale dell'elettrodo è stato posizionato a destra del pedale del microiniettore come promemoria dell'ordine di utilizzo.
4. Accendere i pannelli di controllo del microiniettore e dell'elettrodo.
   1. Verificare che le impostazioni sul microiniettore siano corrette per l'esperimento: la pressione deve essere compresa tra 220-450 hPa, a seconda di come viene prelevata la miscela plasmidico.
   2. Verificare che le impostazioni sul pannello degli elettrodi siano corrette per l'esperimento.
      NOTA: Per l'esperimento in corso (e per la maggior parte dei nostri modelli di tumore al cervello), vengono utilizzati cinque impulsi di 120 V (50 ms; separati da 950 ms).

2. Preparazione pre-chirurgica

1. Preparare la miscela di plasmidi nel microiniettore.
   1. Recuperare una pipetta capillare in vetro estratta e inserirla nel supporto del microiniettore. Assicurarsi che la punta sia avvitata per tenerla in posizione.
   2. Tenere in una mano il porta microiniettore e con l'altra le forbicine; Posizionare la punta della pipetta su un piccolo contenitore per oggetti taglienti a rischio biologico. Con le forbici chiuse, premere leggermente sulla pipetta capillare in vetro allungata. Tagliare nel punto in cui si vede la curva, a circa 2 mm dall'apertura. Se il taglio sembra riuscito, posizionalo con cura di lato.
   3. Posizionare la provetta di miscela di plasmidi disponibile in commercio sul tavolo operatorio e aprirla. Tenere la scatola del puntale della pipetta o un altro oggetto dietro il fondo della provetta per mantenerla stabile durante l'estrazione della miscela plasmidico. Posizionare la pipetta di vetro collegata alla linea del microiniettore sul tavolo e inserirla delicatamente nella provetta della miscela plasmidico, assicurandosi che la punta sia ben inserita nella miscela vicino al fondo della provetta.
      NOTA: A causa dell'aspirazione naturale per gravità, l'aspirazione della miscela plasmidica inizierà nella pipetta di vetro prima di aspirare attivamente.
   4. Con la punta della pipetta di vetro nella miscela plasmidico, utilizzare il pannello del microiniettore per aumentare la quantità aspirata. Partendo da 0, ruotare la manopola destra e il quadrante in direzione negativa verso -60-questo porterà la miscela plasmidica nella pipetta di vetro. Portare solo ~ 1 pollice di miscela di plasmidi. Riportare la manopola su 0, quindi rimuovere il puntale della pipetta dalla miscela.
      NOTA: Non rimuovere il puntale della pipetta dalla miscela mentre si trova nella direzione negativa, poiché ciò sparerà la miscela nel microiniettore ed eventualmente nel tubo.
   5. Testare la quantità di miscela in un'iniezione iniettando la miscela su una striscia di film di paraffina. Utilizzare il pedale e premere una volta per iniettare la miscela sulla pellicola di paraffina. Utilizzare il pipettatore impostato a 1 μL per prelevare la miscela sul film di paraffina per vedere se è esattamente 1 μL.
      NOTA: Se è leggermente inferiore a 1 μL, la pressione del microiniettore può essere aumentata. Se la pressione si avvicina a 450 hPa e ancora inferiore a 1 μL, l'apertura della pipetta di vetro è troppo piccola e dovrà essere tagliata di più. Si consiglia di rimettere la miscela plasmidica nella provetta prima del taglio. Nonostante ciò, ci sarà ancora una miscela residua sulle forbici, quindi è imperativo pulire accuratamente le forbici in seguito con DNase per rimuovere la miscela rimanente. Se l'iniezione è superiore a 1 μL, sarà necessario utilizzare una nuova pipetta di vetro tirata e tagliarla. Quando la quantità di test è esattamente di 1 μL, il puntale della pipetta in vetro è della dimensione giusta.
   6. Ripetere il passaggio 2.1.4 per aspirare un'ulteriore miscela di plasmidi per la procedura, o circa 2-3 pollici nella pipetta di vetro tirata. Assicurarsi che la miscela non penetri troppo nel microiniettore dove non si può vedere la fine.
      NOTA: Quando si aspira la miscela di plasmidi, è fondamentale evitare bolle d'aria. Se sono presenti bolle, è necessario ripetere questo passaggio rimuovendo la miscela plasmidica dalla pipetta di vetro tirata e ricominciando. Le bolle d'aria presenti saranno dannose per i passaggi successivi durante l'iniezione nel ventricolo del cucciolo.
   7. Con la miscela di plasmidi pronta nella pipetta di vetro tirata, posizionare la pipetta pronta di lato sul supporto dell'ausilio di saldatura e in modo che non sia d'intralcio in modo da non toccarla/urtarla accidentalmente.
2. Prepara gli animali per l'esperimento.
   1. Prepara un secchiello per il ghiaccio per anestetizzare i cuccioli. Aggiungere acqua al secchiello del ghiaccio per scioglierlo e aiutare a raffreddare il supporto per anestetizzante (ad es. parte superiore della scatola della pipetta).
   2. Metti la parte superiore della scatola sul ghiaccio sciolto a raffreddare.
   3. Rimuovere con cautela il/i cucciolo/i dalla gabbia e posizionarli nella parte superiore della scatola raffreddata, che rimane sul ghiaccio. Posiziona un'altra parte superiore senza stringere sopra il fondo per aiutare il processo di raffreddamento.
   4. Dopo 2-3 minuti, controlla i cuccioli. Separa i cuccioli l'uno dall'altro rimanendo in posizione prona.
      NOTA: I cuccioli si dimeneranno, ma questo rallenterà quando l'anestesia fredda entra in azione. La parte superiore della scatola può essere lasciata per una facile visualizzazione dei cuccioli.
   5. Per verificare la corretta anestesia, pizzica la coda del cucciolo e cerca una reazione. In caso di reazione, ripetere il passaggio 2.2.4. Se non viene emesso alcun stridio o poco movimento, il cucciolo è pronto per la procedura.
      NOTA: I topi non devono essere tenuti sul ghiaccio per lunghi periodi di tempo in quanto ciò influirà sulla loro capacità di riprendersi dopo la procedura. Solo il numero di cuccioli che possono essere sia iniettati che elettroporati mentre sono ancora sotto anestesia deve essere messo in ghiaccio alla volta; Numeri maggiori si possono fare con l'esperienza.

3. Microiniezione di miscela di plasmidi di DNA nel ventricolo cerebrale

1. Metti un cucciolo sul tavolo in posizione ventrale.
2. Tira leggermente indietro la parte posteriore della testa per visualizzare le suture del cranio attraverso la pelle. Trova lambda sul cranio. Il ventricolo/sito di iniezione sarà a metà strada tra lambda e l'occhio.
   NOTA: Lambda è il punto in cui le suture sagittale e lambdoide si intersecano. Si veda il riferimento¹¹ per l'identificazione di lambda sul cranio del topo.
3. Forare la pelle con la punta della pipetta di vetro ad angolo perpendicolare (la pipetta è diritta verso il soffitto). Osservare una leggera rientranza concava quando si preme sul cranio e una resistenza iniziale. Una volta forato e il puntale della pipetta di vetro penetra attraverso la rientranza concava, viene raggiunto il livello di iniezione appropriato.
4. Tenere il puntale della pipetta in vetro in posizione e premere una volta il pedale del microiniettore per iniettare 1 μL della miscela plasmidico.
   NOTA: Ci sono due modi per vedere chiaramente che l'iniezione è andata a buon fine. Innanzitutto, chiedi a un altro membro del laboratorio di osservare la miscela di plasmidi che scende nella pipetta di vetro mentre viene iniettata. Inoltre, se si utilizza il verde veloce o un altro colorante nella miscela di plasmidi, il colorante si diffonderà visibilmente nel ventricolo sotto la pelle una volta iniettato ed è facilmente visibile quando viene tenuto vicino a una lampada chirurgica.

4. Elettroporazione

1. Metti un pezzo di pellicola di paraffina (un quadrato) sul tavolo e spremi il gel dell'elettrodo sopra la pellicola. Coprire le pale degli elettrodi con gel per elettrodi spennellando una generosa quantità su ciascuna paletta. Il gel in eccesso che gocciola può essere rimosso su un tovagliolo di carta.
   NOTA: Dopo il primo EP, non lasciare che il gel di ciascuna paletta tocchi l'altro lato. Questo trasferirà la carica e, quando si applica alla testa del cucciolo, si sentirà un suono sfrigolante. Ciò accadrà anche se il gel sulla testa del cucciolo da un elettrodo entra in contatto con il gel da un altro.
   ATTENZIONE: Prestare attenzione a tenere le dita lontane dalle pale durante l'elettroporazione.
2. Tieni il corpo del cucciolo in una mano (in genere la mano non dominante), tenendo le dita ben dietro la testa.
   NOTA: Se si è destrimani, è più facile tenere il cucciolo con la mano sinistra e gli elettrodi con la destra. Se sei mancino, fai il contrario.
3. Avvicinare gli elettrodi alla testa del cucciolo per assicurarsi che siano nella posizione corretta, con l'elettrodo positivo all'esterno della testa dove viene puntato il ventricolo (ad esempio, se si prende di mira il ventricolo sinistro, posizionare il positivo sul lato sinistro del cucciolo e il negativo sul lato destro del cucciolo). Durante il posizionamento degli elettrodi, far scorrere delicatamente un dito (in genere il pollice) sul lato dorsale del corpo/collo posteriore alla testa per aiutare a sollevare la testa in posizione.
4. Controllare la profondità dell'anestesia pizzicando la coda e procedere con l'elettroporazione solo se il cucciolo si trova nel piano di anestesia appropriato. Schiacciare leggermente le piastre degli elettrodi sulla parte rostrale della testa del topo, posizionandole sopra gli occhi. Premere una volta il pedale dell'elettrodo per avviare l'elettroporazione. Questo protocollo utilizza cinque impulsi di 120 V (50 ms, separati da 950 ms); Ogni impulso sarà udibile.
   1. Ad ogni impulso, ruotare leggermente le palette dell'elettrodo in senso antiorario in modo che la paletta positiva si muova verso la parte superiore della testa.
      NOTA: Con un'adeguata elettroporazione, si sentirà/vedrà il corpo del cucciolo di topo contrarsi ad ogni impulso.
5. Dopo l'ultimo impulso, rimuovere le pale e metterle da parte. Sposta il cucciolo su un tovagliolo di carta pulito e chiedi a un altro membro del laboratorio di pulire il gel dalla testa del cucciolo e di posizionarlo sotto una lampada riscaldante su una "barca" di carta assorbente.
   NOTA: Assicurarsi che la lampada riscaldante non sia troppo vicina ai cuccioli. Assicurati di avere un altro membro del laboratorio che ti aiuti in questo passaggio e tieni d'occhio costantemente i cuccioli. Spesso aiuta a tenere i cuccioli in mano sotto la lampada riscaldante per aumentare il calore per il cucciolo. Anche massaggiare delicatamente l'addome del cucciolo può aiutare il recupero.
6. Riporta i cuccioli nella gabbia di casa una volta che i loro corpi hanno un sano colore rosato e hanno una risposta cigolante a un leggero pizzicotto della coda.
   NOTA: Prima di rimetterli nella gabbia, prendi una piccola quantità di materiale per la lettiera della gabbia domestica e spazzola leggermente i cuccioli con esso per l'odore della gabbia. Rimetti i cuccioli nella gabbia sotto il materiale della lettiera e torna nella stanza di detenzione.

5. Fasi post-chirurgiche

1. Riportare la miscela di plasmidi inutilizzata dalla pipetta di vetro del microiniettore alla provetta. Se è rimasta una miscela sufficiente, questa può essere utilizzata nelle procedure future. Conservare a -20 °C.
2. Rimuovere il gel dalle piastre degli elettrodi con carta assorbente.
3. Riportare tutte le parti dell'apparecchiatura al loro posto originale.
   NOTA: Se sono state utilizzate delle forbici per tagliare il puntale della pipetta di vetro dopo che la miscela di plasmidi è stata prelevata, lasciare le forbici fuori per pulire accuratamente con la soluzione DNasi.
4. Spruzzare sul tavolo un disinfettante chimico, quindi pulire, seguito da uno spruzzo di etanolo al 70%, quindi pulire di nuovo.

Risultati

Il protocollo sopra descritto è stato utilizzato per sviluppare con successo modelli murini di tumore cerebrale sia pediatrico che adulto, con il primo pubblicato in dettaglio su Kim et ^al.8. Con una tecnica adeguata e un'attenta pianificazione della progettazione dei plasmidi, il successo per lo sviluppo di EP dei tumori è in genere del 100%. L'istologia è il modo più rapido e semplice per verificare il successo dell'inserimento del plasmide del DNA quando viene utilizzata una proteina report...

Discussione

La somministrazione di DNA plasmidico basata sull'elettroporazione consente l'uso in vivo della biologia molecolare, simile a quella utilizzata nei modelli murini geneticamente modificati, ma con la velocità, la localizzazione e l'efficienza della trasduzione virale 8,13,14. Con quest'ultimo, tuttavia, arrivano problemi di sicurezza e risposte immunitarie. Abbiamo dimostrato nel nostro sistema di modellizzazione che ut...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1-2.5 µL 1-channel pipette	Eppendorf	3123000012
2 µL pipette tips	Fisher Scientific	02-707-442
20 µL pipette tips	Fisher Scientific	02-707-432
2-20 µL 1-channel pipette	Eppendorf	3123000098
DNAZap PCR DNA Degradation Solutions	Fisher Scientific	AM9890
ECM 830 Square Porator Electroporator	BTX	45-0662
Electrode Gel	Parker Labs	PLI152CSZ
Fast Green Dye	Sigma-Aldrich	F7258-25G
Helping Hands Soldering Aid	Pro'sKit	900-015
Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp	Roboz	RS-5916
Mouse Strain: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	JAX: 000664
Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J	The Jackson Laboratory	JAX: 007676
Parafilm	Grainger	16Y894
Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV	Addgene	129419
Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter	BTX	45-0488
Sharps container, 1-quart	Uline	S-15307
Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID	World Precision Instruments	1B100F-4	Capillary pipettes need to be pulled - see reference 10 for details.
Vertical Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-30	Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling.
Vimoba Tablet Solution	Quip Laboratories	VIMTAB
XenoWorks Digital Microinjector	Sutter Instruments	BRE
XenoWorks Micropipette Holder	Sutter Instruments	BR-MH