Efficace perfusione sanguigna rapida in Xenopus

Riepilogo

Presentato qui è un efficace protocollo di perfusione sanguigna rapida per preparare campioni di tessuto da rane artigliate africane per studi di trascrittomica e proteomica.

Abstract

Gli xenopus sono stati potenti organismi modello per comprendere lo sviluppo e le malattie dei vertebrati per oltre 100 anni. Qui viene definito un protocollo di perfusione sanguigna rapida in Xenopus, volto a una riduzione costante e drastica del sangue all'interno di tutti i tessuti. La perfusione viene effettuata inserendo un ago direttamente nel ventricolo del cuore e pompando soluzione salina eparinizzata tamponata fosfato (PBS) attraverso il sistema vascolare. La procedura può essere completata in circa 10 minuti per animale. Il sangue è dominato da poche proteine e tipi di cellule molto abbondanti, creando numerosi problemi poiché queste proteine mascherano la maggior parte delle altre molecole e tipi di cellule di interesse. La caratterizzazione riproducibile di tessuti adulti di Xenopus con proteomica quantitativa e trascrittomica monocellulare trarrà beneficio dall'applicazione di questo protocollo prima del prelievo d'organo. I protocolli per il campionamento dei tessuti sono definiti in documenti di accompagnamento. Queste procedure mirano alla standardizzazione delle pratiche in Xenopus di diverso sesso, età e stato di salute, in particolare X. laevis e X. tropicalis.

Introduzione

La perfusione di anfibi su tutto il corpo viene regolarmente completata ai fini della conservazione e della fissazione 1,2,3,4,5,6. Tuttavia, queste procedure avvengono a una velocità che limita il numero di campioni freschi che possono essere prelevati per animale. L'obiettivo di questo lavoro è quello di sviluppare un protocollo di perfusione sanguigna efficace in Xenopus, dando priorità alla velocità della tecnica. Il protocollo richiede meno di 10 minuti per animale per X. tropicalis e meno di 15 minuti per X. laevis animale. Le priorità secondarie sono la facilità di replica e l'uso di apparecchiature facilmente acquisibili in modo che i campioni di alta qualità possano essere ampiamente condivisi tra i laboratori Xenopus.

Le rane Xenopus sono ampiamente utilizzate nella ricerca biomedica per studiare i processi biologici e patologici fondamentali conservati tra le specie. Questo tetrapode ha una relazione evolutiva più stretta con i mammiferi rispetto ad altri modelli acquatici, avendo polmoni, un cuore a tre camere e arti con dita. La comunità internazionale utilizza efficacemente Xenopus per ottenere una comprensione più profonda delle malattie umane attraverso modelli approfonditi della malattia e analisi molecolare della funzione genica correlata alla malattia. I numerosi vantaggi di Xenopus come modello animale li rendono strumenti inestimabili per studiare le basi molecolari dello sviluppo umano e delle malattie; Questi vantaggi includono: grandi dimensioni di ovociti ed embrioni, alta fecondità, facilità di alloggiamento, rapido sviluppo esterno e facilità di manipolazione genomica. È stato stimato che Xenopus condivida ~ 80% dei geni della malattia umana identificati⁷.

Rispetto ai modelli di mammiferi popolari, Xenopus è un modello rapido ed economico, con la facilità di abbattimento del morfolino e la disponibilità di transgenici efficienti e mutazioni genetiche mirate utilizzando CRISPR⁸. La spettrometria di massa quantitativa e la trascrittomica monocellulare sono state applicate con successo agli embrioni di Xenopus^9,10, ma un recente atlante cellulare di Xenopus laevis mostra che la composizione della maggior parte dei tessuti è dominata dai tipi di cellule del sangue ¹¹. Sviluppando una tecnica che dissangua il tessuto a un ritmo rapido e utilizzando mezzi refrigerati, la freschezza del campione è minimamente influenzata dalla perfusione. Ciò è particolarmente importante per le applicazioni in cui l'obiettivo è quello di profilare l'espressione fisiologicamente imperturbata di mRNA o proteine.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le regole e i regolamenti della Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3).

NOTA: Sebbene il metodo primario di eutanasia descritto sia considerato una tecnica accettabile per l'eutanasia dall'American Veterinary Medical Association¹², non è stato trovato per portare alla cessazione di un battito cardiaco¹³. Anche il metodo secondario frequentemente usato di doppia pithing non impedisce questo, né rimuove il cuore dall'animale. Il dissanguamento di animali anestetizzati è considerato un metodo umano ed efficace per l'eutanasia di successo¹². Poiché mantenere i tessuti freschi attraverso l'eutanasia è l'obiettivo di questo protocollo, è utile che il cuore continui a battere attraverso l'eutanasia primaria con MS-222 e che la perfusione sia essa stessa un metodo di eutanasia secondario attraverso il dissanguamento.

1. Preparazione

1. Assicurarsi che l'istituto di ricerca abbia approvato la tecnica di eutanasia e perfusione descritta in questo protocollo.
2. Preparare una soluzione di 5 g/L MS-222 (tricaina metansolfonato) e 5 g/L di bicarbonato di sodio. Il volume dovrebbe essere maggiore del volume richiesto per coprire completamente gli animali sottoposti a eutanasia. Controllare il pH per assicurarsi che sia ≥7.
3. Preparare 500 μL di 180 U/mL di eparina in soluzione salina tamponata fosfato (PBS) per X. laevis o 200 μL per X. tropicalis.
4. Eseguire l'eutanasia primaria ponendo lo Xenopus in questa soluzione (dal punto 1.2); L'animale rimarrà sommerso per un totale di 1 ora.
5. Conferma che lo Xenopus ha perso la sua risposta al dolore pizzicando il piede 15 minuti nell'eutanasia. Se l'animale è reattivo, riportarlo alla soluzione di eutanasia fino a quando questa risposta non viene persa.
6. Pesare lo Xenopus ed effettuare eventuali misurazioni aggiuntive necessarie prima del campionamento.
7. Utilizzando un ago da 31 G, iniettare X. laevis con 250 μL e X. tropicalis con 100 μL di 180 U/mL di eparina in PBS (dal punto 1.3) nella muscolatura di ciascun arto anteriore.
8. Preparare una soluzione di 1 mL/g del peso animale di 54 U/mL di eparina in PBS perfufato. Gli individui più esperti con questo protocollo possono scoprire che è necessario meno media per completare la perfusione.
9. Utilizzare un ago ipodermico da 22 G per perfondere X. laevis e un ago ipodermico da 25 G per X. tropicali s. Smussare l'ago di perfusione tagliando la punta con tronchesi (Figura 1)¹⁴.
   NOTA: Questo riduce la probabilità che l'ago penetri attraverso il ventricolo se spostato. Oltre a smussare, l'ago può essere leggermente macinato con una pietra o una lima affilante, ma rimanendo comunque abbastanza affilato da perforare il ventricolo.
10. Preparare la pompa attaccando l'ago tagliato e facendo circolare 54 U/mL di perfusato di PBS eparinizzato (dal punto 1.8). Assicurarsi di eliminare tutte le bolle d'aria dal tubo per eliminare la possibilità di embolia d'aria, che porta a una diminuzione dell'efficienza di perfusione o al guasto (vedere Tabella 1). Mantenere il mezzo di perfusione sul ghiaccio per tutta la durata della procedura.
11. Se la pompa non è programmabile, con l'ago in posizione, misurare il volume pompato del fluido con le diverse impostazioni per determinare quali impostazioni sono più vicine a 5 mL/min e 10 mL/min. Queste portate saranno utilizzate indipendentemente dalla specie. Se la pompa di perfusione è programmabile, calibrarla con l'ago in posizione, seguendo le istruzioni del produttore.
12. Posizionare la superficie di dissezione (vassoio o foglio di schiuma) su un'inclinazione all'interno di un contenitore secondario o disporla per facilitare il drenaggio del sangue.
13. Una volta che la rana è stata nella soluzione per 1 ora, l'eutanasia primaria è stata completata. Rimuovere la rana e ricontrollare la perdita di risposta al dolore eseguendo un pizzico del piede.
14. Posizionare la rana sul dorso e fissare ogni arto (Figura 2). Se è necessario preservare il tessuto degli arti, è possibile posizionare spilli sottili attraverso le dita o graffette a forma di U intorno agli arti.
15. Usando le forbici da dissezione, taglia la pelle, lungo la linea mediana e poi lateralmente, facendo due lembi. (Figura 2)
16. Utilizzare una pinza per afferrare la linea alba e allontanarla dalla cavità celomica (Figura 3). Usa con attenzione le forbici per tagliare la muscolatura. Fai due lembi fuori dalla parete della cavità e taglia o appunta tutti i lembi fuori strada.
17. Utilizzare le forbici da dissezione per tagliare le ossa coracoidi e tagliare via il tessuto in eccesso per ottenere un migliore accesso al cuore (Figura 3).
18. Il cuore dovrebbe ancora battere. Se il cuore ha smesso di battere prima della perfusione, notare che la freschezza del campione è stata compromessa.

2. Perfusione

1. Identificare lo stomaco e spostarlo delicatamente in modo che sia sopra il lobo sinistro del fegato (alla destra dello spettatore), con la sua vascolarizzazione visibile per tutta la durata della procedura. Identificare un polmone e afferrarlo per la punta usando una pinza tissutale. Tirare il polmone all'esterno della cavità celomica e fissarlo attraverso la punta (Figura 4). Fallo delicatamente, poiché i vasi sanguigni rotti non si fondono bene. Nota se il sangue è visibile all'interno del lobo, in quanto ciò influenzerà la capacità di determinare il completamento della procedura.
2. Prendere un'immagine della cavità celomica per valutare meglio l'efficienza della perfusione e potenzialmente identificare i tessuti anomali in un secondo momento.
3. Identificare il pericardio sottile e tirarlo insegnato con una pinza tissutale (Figura 5). Perforare delicatamente il pericardio usando la punta delle forbici per iridectomia, facendo attenzione a non tagliare i tessuti sottostanti. Staccare il pericardio dalle tre camere del cuore.
4. Utilizzare una pinza per afferrare delicatamente il ventricolo dal suo apice. Applicare una pressione limitata in modo che vi sia spazio sufficiente tra le superfici di trazione della pinza per il passaggio dell'ago di perfusione (Figura 6).
5. Inserire l'ago attraverso la chiusura della pinza nella camera del ventricolo, facendo attenzione a non perforare attraverso il ventricolo (Figura 7). Bloccare la pinza tissutale in posizione utilizzando un supporto per aghi utilizzando un emostato.
   NOTA: Questa tecnica stabilizza la posizione dell'ago, che è ancora affilato. Anche il serraggio dell'ago direttamente al ventricolo causerà danni inutili, rendendo più difficile il riserraggio in caso di necessità (vedere Tabella 1).
6. Avviare il flusso della pompa a circa 5 ml/min. Le tre camere del cuore e del tronco arterioso si ingorgeranno (Figura 8; vedi Tabella 1).
7. Con le forbici, lanciare con attenzione il padiglione auricolare destro (alla sinistra dello spettatore); Il sangue si riverserà. Impostare la portata a 5 ml/min o aumentarla a 10 ml/min.
8. Continuare fino a quando la vascolarizzazione dello stomaco sbianca (vedi Tabella 1), quindi lanciare il padiglione auricolare sinistro del cuore (alla destra dello spettatore). Se la portata è ancora di 5 ml/min, aumentarla a circa 10 ml/min.
9. Utilizzare una pipetta di trasferimento per sciacquare la cavità celomica nei mezzi di perfusione, per aiutare a mantenere la visibilità e per valutare meglio il colore del perfusato che scorre dai padiglioni auricolari.
10. Tenere l'ago in posizione fino a quando il perfusato che scorre dai padiglioni auricolari è chiaro (vedere Tabella 1) e il polmone ha perso la sua tonalità rossa (vedere Tabella 1; Figura 9).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Dopo una perfusione riuscita, tutti i tessuti (escluso il fegato in Xenopus pigmentato) saranno nettamente più leggeri e meno saturi di sangue. I principali vasi sanguigni diventeranno meno evidenti (Figura 10) e i tessuti (escluso il fegato) risciacqueranno in modo pulito nel tampone dopo essere stati campionati. Mentre la corretta esecuzione del protocollo può essere confermata solo dalla qualità dei dati provenienti da campioni di tessuto dissanguato, diversi problemi tipici, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

Questo protocollo descrive le tecniche tradizionali di dissezione per accedere alla cavità celomica. Anche altre tecniche sono accettabili, a condizione che causino danni minimi ai tessuti, che il cuore sia accessibile e che il polmone e lo stomaco siano visibili. Allo stesso modo, la maggior parte degli strumenti di dissezione elencati può essere facilmente sostituita con elementi comparabili.

Mentre sono stati fatti tentativi per ottimizzare l'efficacia di questa procedura, i risultati pos...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5x Magnifying glass with LED light and stand	amazon.com	B08QJ6J8P1	light must not produce heat
Disposable transfer pipets	VWR	414004-036
Dissecting fine-pointed forceps	Fisher Scinetific	08-875
Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5"	VWR	76457-374
Dissection tray	Fisher Scinetific	14-370-284	styrofoam sheets are an acceptable alternative
Euthanasia container	US Plastic	Item 2860	alternative opaque containers acceptable
Euthanasia container lid	US Plastic	Item 3047
Fine dissection pins	Living Systems Instrumentation	PIN-#3
General use hypodermic needles, 22 G	Fisher Scientific	14-826-5A	for X. laevis
General use hypodermic needles, 25 G	Fisher Scientific	14-826AA	for X. tropicalis
Heparin, porcine intestinal mucosa	MilliporeSigma	37-505-410MG
Iridectomy scissors 6"	vwr	470018-938	iris scissors are an acceptable alternative
Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring	amazon.com	B09PTX6M2Z	size will be dependant on the hosing of the pump used
Mayo-Hegar needle holder	Fisher Scinetific	08-966	mosquito forceps are an acceptable alternative
MS-222: Syncaine (formerly tricaine)	Pentair AES	TRS1
PBS 1x	Corning	21-040-CV
Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min	amazon.com	B07PWY4SM6	any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable
Sharpening stone	VWR	470150-112	optional; for dulling needles
Sodium bicarbonate, powder, USP	Fisher Scientific	18-606-333
Specimen forceps, serrated	VWR	82027-442
T-Pins for dissecting	Fisher Scinetific	S99385
Ultra-fine short insulin syringes, 31 G	VWR	BD328438
Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers	amazon.com	B087P191LP