Tomografia fotoacustica, ecografica e angiografica integrata (PAUSAT) per l'imaging non invasivo dell'intero cervello dell'ictus ischemico

Summary

Questo lavoro dimostra l'uso di una piattaforma di imaging multimodale basata su ultrasuoni per l'imaging non invasivo dell'ictus ischemico. Questo sistema consente la quantificazione dell'ossigenazione del sangue attraverso l'imaging fotoacustico e la perfusione alterata nel cervello attraverso l'angiografia acustica.

Abstract

Presentato qui è uno studio sperimentale sull'ictus ischemico utilizzando il nostro sistema di imaging non invasivo di nuova concezione che integra tre tecnologie di imaging basate sull'acustica: fotoacustica, ecografia e tomografia angiografica (PAUSAT). La combinazione di queste tre modalità aiuta ad acquisire la tomografia fotoacustica multispettrale (PAT) dell'ossigenazione del sangue cerebrale, l'imaging ad ultrasuoni ad alta frequenza del tessuto cerebrale e l'angiografia acustica della perfusione sanguigna cerebrale. La piattaforma di imaging multimodale consente lo studio della perfusione cerebrale e dei cambiamenti di ossigenazione nell'intero cervello del topo dopo l'ictus. Sono stati valutati due modelli di ictus ischemico comunemente usati: il modello di occlusione permanente dell'arteria cerebrale media (pMCAO) e il modello fototrombotico (PT). PAUSAT è stato utilizzato per visualizzare lo stesso cervello di topo prima e dopo un ictus e analizzare quantitativamente entrambi i modelli di ictus. Questo sistema di imaging è stato in grado di mostrare chiaramente i cambiamenti vascolari cerebrali dopo l'ictus ischemico, tra cui una significativa riduzione della perfusione sanguigna e dell'ossigenazione nella regione dell'infarto dell'ictus (omolaterale) rispetto al tessuto non danneggiato (controlaterale). I risultati sono stati confermati sia dall'imaging con contrasto laser speckle che dalla colorazione con trifeniltetrazolio cloruro (TTC). Inoltre, il volume dell'infarto da ictus in entrambi i modelli di ictus è stato misurato e convalidato dalla colorazione TTC come verità fondamentale. Attraverso questo studio, abbiamo dimostrato che PAUSAT può essere un potente strumento negli studi preclinici non invasivi e longitudinali sull'ictus ischemico.

Introduction

Il sangue trasporta ossigeno (attraverso la proteina dell'emoglobina) e altri importanti nutrienti ai tessuti del nostro corpo. Quando il flusso di sangue attraverso i tessuti viene interrotto (ischemia), possono verificarsi gravi danni ai tessuti, i cui effetti più immediati sono dovuti alla mancanza di ossigeno (ipossia). L'ictus ischemico è il risultato di un flusso sanguigno interrotto in una certa regione del cervello. Il danno cerebrale derivante da un ictus ischemico può verificarsi entro pochi minuti dal blocco dei vasi e spesso può avere effetti debilitanti e duraturi ^1,2. Una strategia di grande valore per valutare la fisiopatologia dopo ictus ischemico e identificare e testare nuovi trattamenti è l'uso di modelli di piccoli animali in laboratorio. I trattamenti scoperti in laboratorio mirano a essere tradotti in uso clinico e migliorare la vita dei pazienti. Tuttavia, l'uso di animali nella ricerca biomedica deve essere attentamente valutato secondo i principi 3R di Russell e Burch: sostituzione, riduzione e raffinamento³. L'obiettivo della componente di riduzione è ridurre il numero di animali senza compromettere la raccolta dei dati. Con questo in mente, essere in grado di valutare longitudinalmente l'evoluzione della lesione tramite imaging non invasivo consente un grande vantaggio nel ridurre il numero di animali richiesti, oltre a massimizzare le informazioni ottenute da ciascun animale⁴.

La tomografia fotoacustica (PAT) è una modalità di imaging ibrida che combina il contrasto di assorbimento ottico con la risoluzione spaziale dell'imaging a ultrasuoni⁵. Il meccanismo di imaging di PAT è il seguente. Un impulso laser di eccitazione viene illuminato sul bersaglio ripreso. Supponendo che il bersaglio assorba la luce alla lunghezza d'onda del laser di eccitazione, aumenterà di temperatura. Questo rapido aumento della temperatura si traduce in un'espansione termoelastica del bersaglio. L'espansione fa sì che un'onda ultrasonica si propaghi dal bersaglio. Rilevando l'onda ultrasonica in molte posizioni, il tempo necessario affinché l'onda si propaghi dal bersaglio ai rivelatori può essere utilizzato per creare un'immagine attraverso un algoritmo di ricostruzione. La capacità di PAT di rilevare l'assorbimento ottico nelle regioni dei tessuti profondi differenzia la PAT dall'imaging ad ultrasuoni, che rileva i confini delle diverse impedenze acustiche dei tessuti⁵. Negli spettri del visibile e del vicino infrarosso, le principali biomolecole altamente assorbenti che sono abbondanti negli organismi sono l'emoglobina, i lipidi, la melanina e l'acqua⁷. Di particolare interesse nello studio dell'ictus è l'emoglobina. Poiché l'ossiemoglobina e la deossiemoglobina hanno spettri di assorbimento ottico diversi, la PAT può essere utilizzata con lunghezze d'onda laser ad eccitazione multipla per determinare la concentrazione relativa dei due stati della proteina. Ciò consente di quantificare la saturazione di ossigeno dell'emoglobina (sO₂), o ossigenazione del sangue, all'interno e all'esterno della regione dell'infarto ^8,9. Questa è una misura importante nell'ictus ischemico, in quanto può indicare il livello di ossigeno nel tessuto cerebrale danneggiato dopo ischemia.

L'angiografia acustica (AA) è un metodo di imaging ecografico con mezzo di contrasto particolarmente utile per l'imaging della morfologia della vascolarizzazione in vivo¹⁰. Il metodo si basa sull'uso di un trasduttore oscillante a doppio elemento (un elemento a bassa frequenza e un elemento ad alta frequenza) in combinazione con microbolle iniettate nel sistema circolatorio del soggetto di imaging. L'elemento a bassa frequenza del trasduttore viene utilizzato per trasmettere alla frequenza di risonanza delle microbolle (ad esempio, 2 MHz), mentre l'elemento ad alta frequenza viene utilizzato per ricevere i segnali superarmonici delle microbolle (ad esempio, 26 MHz). Quando eccitate a una frequenza di risonanza, le microbolle hanno una forte risposta non lineare, con conseguente produzione di segnali superarmonici che i tessuti del corpo circostante non producono¹¹. Ricevendo con un elemento ad alta frequenza, questo assicura che vengano rilevati solo i segnali a microbolle. Poiché le microbolle sono confinate ai vasi sanguigni, il risultato è un'immagine angiografica della morfologia dei vasi sanguigni. AA è un potente metodo per l'imaging dell'ictus ischemico, poiché le microbolle che fluiscono attraverso il sistema circolatorio non sono in grado di fluire attraverso i vasi bloccati. Ciò consente all'AA di rilevare regioni del cervello che non sono perfuse a causa dell'ictus ischemico, che indica la regione dell'infarto.

La ricerca preclinica sull'ictus ischemico si basa generalmente sull'uso di istologia e test comportamentali per valutare la posizione e la gravità dell'ictus. La colorazione del cloruro di trifeniltetrazolio (TTC) è un'analisi istologica comune utilizzata per determinare il volume dell'infarto dell'ictus. Tuttavia, può essere utilizzato solo in un endpoint, poiché richiede che l'animale venga eutanasia¹². I test comportamentali possono essere utilizzati per determinare la compromissione della funzione motoria in più punti temporali, ma non possono fornire valori anatomici o fisiologici quantitativi¹³. L'imaging biomedico fornisce un approccio più quantitativo allo studio degli effetti dell'ictus ischemico in modo non invasivo e longitudinale 9,14,15. Tuttavia, le tecnologie di imaging esistenti (come la risonanza magnetica per piccoli animali [MRI]) possono avere un costo elevato, non essere in grado di fornire informazioni strutturali e funzionali simultanee o avere una profondità di penetrazione limitata (come la maggior parte delle tecniche di imaging ottico).

Qui, combiniamo la fotoacustica, l'ecografia e la tomografia angiografica (PAUSAT; vedi diagramma di sistema in Figura 1), che consente informazioni strutturali e funzionali complementari della perfusione sanguigna e dell'ossigenazione dopo ictus ischemico¹⁶. Questi sono due aspetti importanti nella valutazione della gravità della lesione e nel monitoraggio del recupero o della risposta ai trattamenti. L'utilizzo di questi metodi di imaging integrato può aumentare la quantità di informazioni ottenute da ciascun animale, riducendo il numero di animali necessari e fornendo maggiori informazioni nello studio di potenziali trattamenti per l'ictus ischemico.

Figura 1: Diagramma PAUSAT. (A) Schema completo del sistema PAUSAT, compresi il laser e l'OPO utilizzati per PAT. (B) Vista interna del sistema PAUSAT, compresi due trasduttori a ultrasuoni. Il trasduttore oscillante a doppio elemento viene utilizzato sia per gli ultrasuoni B-mode che per AA, mentre il trasduttore lineare viene utilizzato per PAT. Entrambi i trasduttori sono montati sullo stesso palco motorizzato 2D, consentendo la scansione per generare dati volumetrici. Questa cifra è stata modificata da¹⁶. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Protocol

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Duke University Medical Center Animal Care and Use Committee e sono state condotte in conformità con la politica del servizio sanitario pubblico degli Stati Uniti sulla cura umana e l'uso di animali da laboratorio. Per questi studi sono stati utilizzati topi maschi e femmine C57BL/6J (vedere Tabella dei materiali). Sono state visualizzate almeno tre immagini di animali per gruppo di modelli di tratto. Vedere la Figura 2 per il flusso di lavoro seguito in questo protocollo.

Figura 2: Riassunto della procedura sperimentale per l'imaging PAUSAT applicata all'ictus. Creato con Biorender.com. La figura mostra il flusso di lavoro della procedura di imaging a partire da (A) i due principali modelli di corsa (pMCAO e PT stroke). (B) Prima di posizionare l'animale sulla membrana PAUSAT deve essere eseguita un'iniezione retroorbitale delle microbolle. (C) In questa configurazione sono necessari una maschera che fornisca anestesia continua e una piastra riscaldante per mantenere stabile la temperatura corporea dell'animale. Il corpo dell'animale viene posizionato sulla piastra riscaldante mentre la testa poggia sulla membrana del sistema. (D) Nella figura viene visualizzato anche l'ordine di acquisizione delle immagini. (E) La colorazione TTC viene eseguita per convalidare i nostri risultati in questo studio. DPI: giorni dopo l'infortunio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

1. Indurre il modello di mouse a tratto

1. Occlusione permanente dell'arteria cerebrale media (pMCAO) con legatura comune dell'arteria carotide (CCA).
   NOTA: Eseguire brevemente la legatura permanente del CCA destro e l'elettrocauterizzazione posteriore dell'arteria cerebrale media destra (MCA)¹⁷. Questa procedura limita il flusso sanguigno cerebrale nella corteccia destra del cervello, causando un ictus ischemico¹⁸.
   1. Indurre l'anestesia in una camera di induzione utilizzando una miscela inalatoria di isoflurano al 5,0% in 30% O 2/70% N₂ fino alla perdita di coscienza (riconosciuta come perdita del riflesso del pedale).
   2. Intubare l'animale utilizzando un catetere da 20 G (Table of Materials) e collegarlo a un ventilatore automatico. Impostare la portata in base al peso corporeo dell'animale e mantenere l'animale anestetizzato utilizzando l'isoflurano 1,5%-2,0% in 30% O 2/70% N₂.
   3. Utilizzando una lampada riscaldante e una sonda rettale collegata a un dispositivo di regolazione della temperatura, mantenere la temperatura corporea dell'animale a 37 °C.
   4. Metti una goccia di unguento per gli occhi lubrificante sugli occhi del topo.
   5. Posizionare l'animale in posizione supina e rimuovere i peli dalla zona del collo usando un tagliacapelli.
   6. Pulire l'area della pelle utilizzando prima un batuffolo di cotone con povidone-iodio e quindi utilizzando un tampone sterile con etanolo al 70%. Eseguilo tre volte.
   7. Verificare la profondità dell'anestesia e l'assenza di dolore pizzicando leggermente la zampa posteriore dell'animale.
   8. Fare un'incisione sagittale di 0,8 cm sulla linea mediana del collo ed esporre il CCA destro.
   9. Preparare una sutura per la legatura CCA dissociando una sutura di seta 4-0 in fili più sottili che compongono il filo principale. Utilizzare una lunghezza di 1,5 cm di uno dei sottothread per legare in modo permanente il CCA.
      NOTA: Dopo aver stretto il nodo, rimuovere il filo in eccesso tagliando l'estensione a una distanza di 1-2 mm dal nodo.
   10. Applicare una goccia di bupivacaina prima di chiudere la ferita.
   11. Chiudere l'incisione utilizzando suture chirurgiche di seta 4-0 interrotte e applicare un triplo unguento antibiotico sulla superficie per prevenire l'infezione.
   12. Muovi il mouse per esporre il lato laterale destro del corpo dell'animale.
   13. Rimuovere i peli nella regione tra l'orecchio e la zona degli occhi utilizzando un tagliacapelli.
   14. Disinfettare l'area chirurgica utilizzando un batuffolo di cotone con povidone-iodio, seguito da un tampone sterile con etanolo al 70%. Ripetere questo passaggio tre volte.
   15. Posizionare un drappo sterile per fissare l'area chirurgica. Quindi, praticare un'incisione di 0,5 cm tra l'occhio destro e l'orecchio dell'animale, esponendo l'articolazione tra il cranio e il muscolo temporale.
   16. Utilizzando un anello di cauterizzazione, cauterizzare il muscolo per separarlo dal cranio ed esporre l'area dell'MCA.
   17. Perforare una finestra da 0,2 mm² per esporre l'MCA utilizzando un trapano elettrico e utilizzare l'elettrocauterizzazione sull'MCA per occludere il flusso sanguigno.
       NOTA: un singolo impulso all'80% di intensità di potenza è sufficiente per cauterizzare l'MCA.
   18. Utilizzando una siringa da 1 ml attaccata a un ago 27G, applicare una goccia di bupivacaina (Table of Materials) nel sito chirurgico.
   19. Chiudere l'incisione cutanea utilizzando punti di sutura monofilamento trasparenti 6-0 interrotti e applicare un triplo unguento antibiotico sulla superficie per prevenire l'infezione.
   20. Dopo aver completato l'intervento, trasferire l'animale in un'incubatrice a temperatura controllata (32 °C) e consentire all'animale di riprendersi.
   21. Dopo 2 ore, trasferire l'animale nella sua gabbia di casa e fornire cibo e acqua ad libitum.
2. Ictus fototrombotico (ictus PT)
   NOTA: In breve, l'ictus PT viene eseguito illuminando il Bengala rosa all'interno dei vasi cerebrali. Il Bengala Rosa viene somministrato per via intraperitoneale e, una volta che è stato ben distribuito in tutto il corpo (5 min), viene illuminato da una luce verde fredda, che attiva il Bengala Rosa per generare specie reattive dell'ossigeno (ROS). Questi ROS danneggiano la membrana delle cellule endoteliali, creando trombi all'interno dell'intera area illuminata e portando all'interruzione del flusso sanguigno cerebrale locale¹⁹.
   1. Indurre l'anestesia in una camera di induzione utilizzando una miscela inalatoria di isoflurano al 5,0% in 30% O 2/70% N₂ fino alla perdita di coscienza (riconosciuta come perdita del riflesso del pedale).
   2. Impostare l'animale su una struttura stereotassica, mantenendo l'animale anestetizzato usando una maschera e isoflurano 1,5% -2,0% in 30% O 2/70% N₂.
   3. Mantenere l'animale a 37 °C utilizzando un riscaldatore a ricircolo di acqua calda e una sonda rettale per misurare la temperatura corporea dell'animale.
   4. Metti una goccia di unguento per gli occhi lubrificante sugli occhi del topo.
   5. Rasare la testa dell'animale usando un tagliacapelli.
   6. Pulire l'area del cuoio capelluto rasata tre volte, prima usando un batuffolo di cotone con iodio povidone, quindi usando un tampone sterile con etanolo al 70%.
   7. Verificare l'assenza di dolore pizzicando leggermente la zampa posteriore dell'animale.
   8. Fai un'incisione sagittale di 1,4 cm sulla linea mediana del cuoio capelluto usando un bisturi ed esponi il cranio.
   9. Usando una matita affilata, fai un segno a 1,5 mm dal bregma verso il lato destro.
   10. Posizionare un foro stenopeico circolare di 2,5 mm di diametro centrato sul segno di 1,5 mm.
       NOTA: Un quadrato contenente un foro stenopeico circolare può essere realizzato utilizzando nastro nero biadesivo e facendo un'apertura di 2,5 mm di diametro al centro utilizzando uno strumento di punzonatura a foro singolo delle dimensioni menzionate.
   11. Posizionare la luce verde fredda sul foro stenopeico circolare, mantenendo al minimo lo spazio tra la luce e il foro stenopeico.
   12. Coprire l'area utilizzando un foglio di alluminio per evitare la diffusione della luce.
   13. Una volta che la configurazione è pronta, iniettare l'animale per via intraperitoneale con 10 mg/kg di Rose Bengal (10 mg/ml in 1x soluzione salina tamponata con fosfato [PBS]) e attendere 5 minuti.
   14. Dopo 5 minuti, accendere la fonte di luce fredda (intensità: 4,25) e mantenere l'esposizione per 15 minuti.
   15. Quindi, spegnere la luce fredda e verificare il tratto ad occhio nudo (l'area dovrebbe essere più bianca dell'area circostante) o utilizzando dispositivi esterni per misurare il flusso sanguigno cerebrale (ad esempio, utilizzando l'imaging a contrasto laser speckle (Tabella dei materiali; vedere il passaggio 5.1).
   16. Utilizzando una siringa da 1 ml attaccata a un ago 27G, applicare una goccia di bupivacaina (Table of Materials) nel sito chirurgico.
   17. Chiudere l'incisione cutanea utilizzando punti di sutura monofilamento trasparenti 6-0 interrotti e applicare un triplo unguento antibiotico sulla superficie per prevenire l'infezione.
   18. Dopo aver completato l'intervento, trasferire l'animale in un'incubatrice a temperatura controllata (32 °C) e consentire all'animale di riprendersi.
   19. Dopo 2 ore, trasferire l'animale nella sua gabbia di casa e fornire cibo e acqua ad libitum.

2. Preparazione di PAUSAT per l'imaging

1. Accendere il laser a 532 nm e lasciarlo acceso per 15 minuti per riscaldarsi.
2. Preparare la piattaforma di imaging per l'animale anestetizzato.
   1. Posizionare una rampa personalizzata (Figura 2C) attaccata al palco regolabile manualmente (Tabella dei materiali) accanto alla membrana di imaging.
   2. Collegare un portadenti per mouse con il tubo di respirazione collegato alla rampa personalizzata e fissare una piastra riscaldante sulla superficie della rampa.
3. Dopo che il laser si è riscaldato, verificare che il percorso del laser e l'accoppiamento nel fascio di fibre siano ben allineati utilizzando una scheda rivelatore nel vicino infrarosso (Table of Materials) posizionando la scheda davanti all'ingresso del fascio di fibre e assicurandosi che la luce laser entri nel fascio.
   NOTA: regolare eventuali specchi del percorso laser in base alle esigenze per assicurarsi che l'ingresso laser sia centrato con l'ingresso del fascio di fibre.

3. Preparare l'animale per PAUSAT

NOTA: PAUSAT viene eseguito 1 giorno dopo l'intervento chirurgico di ictus PT o 3 giorni dopo l'intervento chirurgico pMCAO. La preparazione di PAUSAT per l'imaging (fase 2) richiede circa 20 minuti e deve essere eseguita immediatamente prima di preparare l'animale per PAUSAT.

1. Indurre l'anestesia in una camera di induzione utilizzando una miscela per inalazione di isoflurano al 5% miscelato con il 30% di O 2/70% di N₂ fino alla perdita di coscienza (riconosciuta come perdita del riflesso del pedale).
2. Trasferire l'animale su una piattaforma riscaldata con un portadenti e una maschera e mantenere l'anestesia all'1,5% -2,0% di isoflurano in 30% O 2 / 70% N_2.
3. Utilizzare una lampada riscaldante e una sonda rettale collegata a un dispositivo di controllo della temperatura per mantenere la temperatura corporea dell'animale a 37 °C.
4. Taglia i capelli sulla parte superiore della testa dell'animale usando un rasoio elettrico. Includi la regione da vicino agli occhi a dietro le orecchie.
5. Rasare i peli sulla parte superiore della testa dell'animale applicando una crema depilatoria commerciale per rimuovere completamente i capelli corti rimanenti. Lasciare sulla pelle per 5-6 minuti, quindi pulire con un batuffolo di cotone tamponato in acqua per aiutare a rimuovere completamente la crema. Ripetere fino a quando la pelle è libera dai capelli.
   NOTA: Per l'imaging 1 giorno dopo l'intervento chirurgico, questi passaggi possono essere eseguiti prima di iniziare l'intervento chirurgico; a 1 giorno dopo l'ictus PT, possono essere omessi. Quando l'acquisizione dell'immagine PAUSAT viene eseguita diversi giorni dopo l'intervento, è necessario eseguire questo passaggio.
6. Una volta che l'animale e il sistema sono pronti per l'imaging, e subito prima di trasferire l'animale sulla piattaforma del sistema, iniettare una soluzione da 100 μL di microbolle alla concentrazione dello stock (Table of Materials) retroorbitalmente usando un ago da 27 G.
   NOTA: Una volta che le bolle sono in circolazione nel flusso sanguigno, c'è una quantità limitata di tempo per l'immagine senza una significativa perdita di segnale (~ 10 min).
7. Metti una goccia di lozione protettiva per gli occhi del topo.
   NOTA: Non è consigliabile applicare lubrificante per gli occhi fino a quando non viene eseguita l'iniezione retroorbitale per evitare che sostanze estranee raggiungano il flusso sanguigno dell'animale. Pertanto, l'applicazione della crema depilatoria deve essere eseguita lentamente e con attenzione per evitare di avvicinarsi troppo agli occhi (ma abbastanza per esporre la regione di interesse in cui è previsto l'ictus). La rimozione della crema per capelli viene eseguita con un batuffolo di cotone precedentemente tamponato in acqua, evitando che la crema goccioli, che può danneggiare gli occhi.

4. Imaging PAUSAT

NOTA: Questo viene fatto per visualizzare le regioni contro- e ipsi-laterali del cervello dopo l'ictus

1. Trasferire il mouse sulla piattaforma immagine PAUSAT (Table of Materials) integrata, posizionandolo in posizione supina sulla rampa personalizzata (Figura 2C).
2. Riempire la finestra di imaging con acqua distillata sufficiente sulla superficie per l'accoppiamento acustico.
   NOTA: Si consiglia una rampa opzionale stampata utilizzando una stampante 3D per evitare che il corpo dell'animale si bagni durante l'acquisizione dell'immagine e migliorare il comfort dell'animale. Aiuta anche a mantenere una temperatura corporea stabile. Inoltre, la rampa può essere collegata a un palco manuale (Table of Materials) per regolare la profondità focale del trasduttore oscillante a doppio elemento rispetto alla testa del mouse. Il file di progettazione della rampa personalizzata è disponibile su richiesta agli autori.
3. Fissare la testa del mouse nel supporto del dente e garantire una corretta anestesia e flusso d'aria.
4. Utilizzando una lampada riscaldante e una sonda rettale collegata a un dispositivo di regolazione della temperatura, mantenere la temperatura corporea dell'animale a 37 °C.
5. Apri l'applicazione di imaging (Table of Materials) e vai all'ecografia in modalità B.
6. Utilizzare la finestra ecografica live per regolare manualmente la testa del mouse nella posizione desiderata.
7. Utilizzare la finestra ecografica dal vivo per regolare l'altezza del palco, in modo tale che la profondità focale del trasduttore (19 mm) sia approssimativamente al centro dell'area da riprendere.
8. Imaging con ultrasuoni B-mode
   1. Regolare il valore della frequenza di trasmissione degli ultrasuoni in modalità B (per questi studi, utilizzare 16 MHz).
   2. Immettere le informazioni della directory di salvataggio nell'applicazione di imaging.
   3. Utilizzare la casella mobile per selezionare la regione desiderata per la scansione B-mode del cervello.
   4. Premere il pulsante Acquisisci statico .
   5. Controllare i risultati della scansione nell'applicazione una volta completata l'acquisizione dell'immagine per assicurarsi che sia stata ripresa la regione desiderata.
      NOTA: Evitare inutili ritardi nell'acquisizione dell'imaging B-mode per garantire che una concentrazione sufficientemente elevata di microbolle rimanga nel flusso sanguigno per l'AA.
9. Imaging con AA
   1. Torna a Acquisizione immagini.
   2. Passare alla modalità Angiografia acustica nell'applicazione di imaging (Tabella dei materiali).
   3. Immettere i parametri del protocollo di scansione desiderati (il più importante dei quali è la spaziatura dei fotogrammi e il numero di fotogrammi per posizione, che è stato impostato su 0,2 mm e 10, rispettivamente, per questi studi).
   4. Premere il pulsante Acquisisci statico .
      NOTA: l'acquisizione AA richiede più tempo rispetto all'ecografia B-mode.
   5. Una volta completata la scansione, controllare i risultati della scansione in Analisi immagine per assicurarsi che la qualità dell'immagine sia quella prevista.
      NOTA: Per la modalità AA, è possibile acquisire un volume più rappresentativo dell'intero cervello ripetendo una seconda scansione a una diversa profondità focale all'interno del cervello e successivamente ricombinando le immagini con una corretta post-elaborazione (vedere Figura 3).
10. Imaging con tomografia fotoacustica
    1. Aprire l'applicazione dell'oscillatore ottico parametrico (OPO) (Table of Materials) e impostarla su 756 nm.
       NOTA: gli OPO possono facilmente uscire dalla calibrazione, quindi prima dell'esperimento, assicurarsi che l'OPO sia calibrato correttamente utilizzando uno spettrometro indipendente.
    2. Traslare manualmente il trasduttore ad array lineare nelle coordinate determinate in precedenza per garantire che i volumi oscillanti e i volumi ad array lineari siano automaticamente co-registrati.
       NOTA: È fondamentale che un esperimento di co-registrazione utilizzando una griglia fantasma venga eseguito in anticipo per determinare la distanza esatta necessaria per tradurre lo stadio, in modo tale che i dati risultanti da entrambi i trasduttori siano co-registrati in 3D.
    3. Aprire l'applicazione laser e accendere il laser a 532 nm.
    4. Utilizzando un misuratore di potenza laser, misurare l'energia dell'uscita laser e assicurarsi che sia l'energia desiderata (~ 10 mJ per impulso è stato utilizzato per questi studi).
    5. Selezionare i parametri di scansione desiderati per PAT (dimensione del passo di 0,4 mm, lunghezza di scansione di 20 mm e media di 10 fotogrammi per posizione).
    6. Aprire il sistema di acquisizione dati ad ultrasuoni MATLAB program (Table of Materials) e premere il pulsante Esegui .
    7. Acquisire la scansione PAT premendo il pulsante Start .
    8. Una volta completata la scansione, apri il programma di salvataggio MATLAB. Modificare il nome di salvataggio con il nome del file desiderato e premere il pulsante Esegui .
    9. Modificare la lunghezza d'onda OPO a 798 nm e ripetere i passaggi da 4.10.3 a 4.10.8.
       NOTA: Per uno studio longitudinale, si raccomanda di consentire all'animale di riprendersi mettendolo in un'incubatrice e sotto osservazione per alcune ore (seguendo i punti 1.1.18 e 1.1.19). Se si desidera convalidare il risultato, continuare al paragrafo 5 immediatamente dopo l'imaging PAUSAT.

5. Facoltativo: convalida dei risultati

1. Laser speckle contrast imaging (LSCI).
   1. Anestetizzare l'animale usando isoflurano 1,5%-2,0% in 30% O 2/70% N₂.
   2. Impostare l'animale su una cornice stereotassica, mantenendo l'animale anestetizzato usando una maschera e la suddetta anestesia inalatoria.
   3. Mantenere l'animale a 37 °C utilizzando un riscaldatore a ricircolo di acqua calda e una sonda rettale per misurare la temperatura corporea dell'animale.
   4. Metti una goccia di lozione protettiva per gli occhi del topo.
   5. Verificare l'assenza di dolore pizzicando leggermente la zampa posteriore dell'animale.
   6. Rimuovere i peli sul cuoio capelluto dell'animale usando un tagliacapelli.
   7. Disinfettare l'area chirurgica utilizzando un batuffolo di cotone con povidone-iodio, seguito da un tampone sterile con etanolo al 70%. Ripetere questo passaggio tre volte.
   8. Fare un'incisione sagittale di 1,4 mm sulla linea mediana del cuoio capelluto ed esporre il cranio. Utilizzare una pinza per tenere il cuoio capelluto e impedire che occupi l'area del cervello da scansionare.
   9. Applicare alcune gocce di soluzione salina sul cranio e posizionare il dispositivo del sistema di contrasto a macchie laser (Table of Materials) sulla testa dell'animale.
   10. Nel menu File , impostare il dispositivo in modalità Online, contenuta nel sottomenu Modalità di lavoro.
   11. Selezionare la cartella di archiviazione immagini predefinita nel menu File e nel sottomenu Salva impostazioni .
   12. Nel menu Sorgente luminosa , collegare il laser guida ("Laser acceso") e la luce bianca ("Luce bianca accesa") per posizionare la finestra di imaging nella posizione corretta.
   13. Nel menu Impostazioni , selezionare Impostazioni di ingrandimento, spostare manualmente il cursore su 2.5 e premere Applica e OK per salvare le impostazioni.
   14. Regola lo stato attivo spostando manualmente la barra di messa a fuoco situata nel sottomenu superiore della pagina principale.
   15. Nel menu Impostazioni , selezionare Pseudo impostazione soglia colore, regolare la soglia come desiderato e premere Applica e OK per salvare le impostazioni.
   16. Nel menu Sorgente luminosa , scollegare il laser guida ("Laser off") e la luce bianca ("Luce bianca disattivata") prima di acquisire l'immagine.
   17. Cattura l'immagine selezionando il simbolo Play nel sottomenu in alto della pagina principale.
2. Colorazione del cloruro di trifeniltetrazolio (TTC)
   1. Anestetizzare profondamente l'animale usando isoflurano al 5% in 30% O 2/70% N₂.
   2. Una volta che l'animale ha smesso di respirare, decapitarlo usando forbici affilate.
   3. Rimuovere tutta la pelle intorno alla testa e i muscoli nella zona del collo.
   4. Fai un taglio sagittale nella parte occipitale del cranio fino a raggiungere l'osso parietale.
   5. Fare un taglio orizzontale (~ 5 mm) nel lato sinistro e destro sotto il vaso sanguigno. Rimuovere l'osso occipitale del cranio usando una pinza dritta.
   6. Fai un taglio (~ 5 mm) alla sutura frontonasale del cranio.
   7. Fai un taglio sagittale (~ 10-15 mm) nella linea mediana del cranio - tra gli emisferi - e assicurati che siano completamente separati.
   8. Utilizzando forbici curve taglia #7, rimuovere le ossa parietali sinistra e destra del cranio dal centro ai lati.
   9. Trasferire il cervello in un contenitore pieno di 5 ml di 1x PBS ghiacciato e tenerlo in ghiaccio per 10 minuti.
   10. Trasferire il cervello in una matrice cerebrale in acciaio inossidabile (sezioni spesse 1 mm).
   11. Sezionare il cervello in sezioni coronali di 1 mm usando lamette da barba usa e getta (Table of Materials).
   12. Tenendo le lame per i lati, trasferire in un contenitore pieno di 1x PBS ghiacciato.
   13. Separare accuratamente le sezioni dalle lame una per una.
   14. Trasferire le fette di cervello in una capsula di Petri di 70 mm di diametro contenente 5 ml di TTC al 2% (Table of Materials, 3) in 1x PBS.
   15. Incubare per 15 minuti al buio a temperatura ambiente (R/T).
   16. Dopo 15 minuti, scartare il TTC, sostituirlo con 3 ml di formalina e incubare al buio per almeno 30 minuti a R/T.
   17. Infine, trasferire le fette di cervello su una pellicola di plastica trasparente e scansionare i campioni, incluso un righello nell'immagine di scansione come riferimento per misurazioni future.

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Results

Imaging della morfologia dei vasi sanguigni nel cervello
AA genera immagini morfologiche dei vasi sanguigni eccitando le microbolle nel sistema circolatorio alla loro frequenza di risonanza e ricevendo la risposta super armonica delle microbolle. Utilizzando la rampa personalizzata (Figura 2C) collegata a un palco regolabile manualmente, possiamo visualizzare il cervello del mouse con modalità AA a due diverse profondità focali. Quando le regioni più profonde sono mira...

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Discussion

Ci sono alcuni aspetti vitali di questo metodo che, se fatto in modo errato, può portare a una significativa diminuzione della qualità dell'immagine e dell'analisi quantitativa. Il risultato più comune dell'errore dell'utente nelle immagini PAUSAT è la mancanza di segnale o una potenza del segnale molto bassa, entrambi i quali possono verificarsi per una serie di motivi. Uno di questi motivi è un problema con l'accoppiamento acustico. Grandi bolle d'aria nell'acqua che circonda la testa del topo durante l'imaging po...

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 GA catheter	BD Insyte Autoguard Winged	381534	For mouse intubation
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Sigma	T8877	Necessary for TTC-staining brain for validation
532nm Laser	Quantel	Q-smart 850	Laser used to pump the OPO for PAT
Automatic Ventilator Rovent Jr.	Kent Scientific	RV-JR	To keep mice under anesthesia during surgical procedure
Black braided silk 4-0 USP	Surgical Specialties	SP116	Used for sutures on the neck for pMCAO surgery
Bupivacaine	Hospira	0409-1159-18	Used prior to closing wounds during surgical procedure
C57BL/6 Mice	Jackson Lab	#000664	Mice used for studying ischemic stroke (2-6 month old male/female)
Clear suture	Ethicon	8606	Used for closing wound (PT stroke and pMCAO). A clear suture won't interfere with PAT
Cold Light LED	Schott	KL 1600	Needed to create PT stroke
Disposable Razor Blade	Accutec Blades	74-0002	For sectioning mouse brain
Electric drill	JSDA	JD-700	Used to expose MCA during pMCAO procedure
Electrocauterization tool	Wet-Field	Wet-Field Bipolar-RG	Stops blood flow after drilling during pMCAO procedure
Hair removal gel	Veet	8282651	Used to remove hair from mouse prior to imaging
High Temperature Cautery Loop Tip	BOVIE Medical Corporation	REF AA03	Used to avoid bleeding when separating the temporal muscle from the skull
IR Detector Card	Thorlabs	VRC5	Used to ensure light path is aligned
Laser Power Meter	Ophir	StarBright, P/N 7Z01580	Can be used to calibrate the laser energy prior to imaging
Laser Speckle Imaging System	RWD Life Science Co.	RFLSI-III	Can be used to validate stroke surgery success
Lubricant Eye Ointment	Soothe	AB31336	Can be used to avoid drying of the eyes
Manually adjustable stage	Thorlabs	L490	Used with custom ramp for multiple focal depth AA imaging
Modified Vega Imaging System	Perkin Elmer	LLA00061	System containing both B-mode/AA and PAT transducers
Optical Parametric Oscillator	Quantel	versaScan-L532	Allows for tuning of excitation wavelength in a large range
Programmable Ultrasound System	Verasonics	Vantage 256	Used for PAT part of system
Rose Bengal	Sigma	330000	Necessary to induce PT stroke
Suture	LOOK	SP116	Used for permanent ligation of CCA
Temperature Contoller	Physitemp	TCAT-2	Used to maintain stable body temperature of mice during procedures
VesselVue Microbubbles	Perkin Elmer	P-4007001	Used for acoustic angiography (2.43 × 10^9 microbubbles/mL)