Respirometria ad alta risoluzione per valutare la funzione mitocondriale negli spermatozoi umani

Riepilogo

L'analisi della funzione mitocondriale degli spermatozoi mediante respirometria ad alta risoluzione consente di misurare il consumo di ossigeno degli spermatozoi che si muovono liberamente in un sistema a camera chiusa. La tecnica può essere applicata per misurare la respirazione negli spermatozoi umani, che fornisce informazioni sulle caratteristiche e sull'integrità mitocondriale degli spermatozoi.

Abstract

La qualità dello sperma viene spesso studiata mediante lo spermiogramma di routine, che è descrittivo e spesso inconcludente. L'infertilità maschile è associata a un'alterata attività mitocondriale degli spermatozoi, quindi la misurazione della funzione mitocondriale degli spermatozoi è un indicatore della qualità dello sperma. La respirometria ad alta risoluzione è un metodo per misurare il consumo di ossigeno di cellule o tessuti in un sistema a camera chiusa. Questa tecnica può essere implementata per misurare la respirazione negli spermatozoi umani e fornisce informazioni sulla qualità e l'integrità dei mitocondri degli spermatozoi. La respirometria ad alta risoluzione consente alle cellule di muoversi liberamente, il che è un vantaggio a priori nel caso degli spermatozoi. Questa tecnica può essere applicata con spermatozoi intatti o permeabilizzati e consente di studiare la funzione mitocondriale degli spermatozoi intatti e l'attività dei singoli complessi della catena respiratoria. Lo strumento ossigrafo ad alta risoluzione utilizza sensori per misurare la concentrazione di ossigeno accoppiati a un software sensibile per calcolare il consumo di ossigeno. I dati vengono utilizzati per calcolare gli indici respiratori in base ai rapporti di consumo di ossigeno. Di conseguenza, gli indici sono le proporzioni di due tassi di consumo di ossigeno e sono normalizzati internamente al numero di cellule o alla massa proteica. Gli indici respiratori sono un indicatore della funzione mitocondriale e della disfunzione degli spermatozoi.

Introduzione

Si stima che l'infertilità maschile rappresenti il 40%-50% di tutti i casi di infertilità nelle coppie¹. Lo spermiogramma convenzionale svolge un ruolo cruciale nel determinare la fertilità maschile; Tuttavia, circa il 15% degli uomini infertili ha parametri spermatici normali². Inoltre, lo spermiogramma di routine fornisce informazioni limitate sulla funzione degli spermatozoi e non riflette i difetti sottili degli spermatozoi³.

I mitocondri degli spermatozoi hanno una struttura speciale, in quanto sono disposti come una guaina elicoidale attorno ai flagelli. La guaina mitocondriale contiene un numero variabile di mitocondri collegati da linker intermitocondriali e ancorati al citoscheletro da disposizioni proteiche ordinate sulla membrana mitocondriale esterna ^4,5. Questa struttura rende particolarmente difficile l'isolamento dei mitocondri degli spermatozoi. Pertanto, la maggior parte degli studi sulla funzione mitocondriale degli spermatozoi utilizza analisi in situ o spermatozoi demembranati⁶.

La struttura e la funzione mitocondriale degli spermatozoi sono state costantemente collegate all'infertilità maschile 7,8,9,10,11^, suggerendo che l'analisi della struttura e della funzione di questi organelli può essere un buon candidato per l'inclusione nell'analisi dello sperma.

I mitocondri svolgono un ruolo importante nel metabolismo energetico cellulare, in particolare utilizzando l'ossigeno per produrre adenosina trifosfato (ATP) attraverso la fosforilazione ossidativa (OXPHOS). Negli spermatozoi, in particolare, la fonte di ATP (glicolisi vs. OXPHOS) è controversa e molti dei dati rimangono controversi e dipendono da diversi approcci sperimentali 4,12,13. Le misurazioni della respirazione mediante ossimetria offrono informazioni significative sulla capacità respiratoria mitocondriale, sull'integrità mitocondriale e sul metabolismo energetico della cellula^14,15,16. Tradizionalmente, questa tecnica è stata eseguita utilizzando l'elettrodo di ossigeno Clark, uno strumento che è stato utilizzato per misurare la respirazione mitocondriale per più di 50 anni^17,18. Inoltre, il consumo di ossigeno mitocondriale degli spermatozoi è stato analizzato utilizzando il classico elettrodo di ossigeno Clark 19,20,21. La respirometria ad alta risoluzione (HRR) mediante ossigrafi (Oroboros) fornisce una sensibilità maggiore rispetto all'utilizzo di dispositivi di respirometria classici²². Gli ossigrafi sono composti da due camere con porte di iniezione e ogni camera ha un sensore di ossigeno polarografico. Con questa tecnica è possibile analizzare vetrini di tessuto, cellule e sospensioni mitocondriali isolate. Il campione viene continuamente agitato nella camera e, durante l'esperimento, viene misurato il consumo di ossigeno e i tassi di ossigeno vengono calcolati utilizzando un software specifico. Le camere mostrano una ridotta perdita di ossigeno, che è un vantaggio rispetto ai dispositivi convenzionali con elettrodi di ossigeno^14,23.

Come per altre cellule, nel caso degli spermatozoi, la sensibilità dell'apparecchiatura HRR è superiore a quella della respirometria convenzionale, il che significa che l'apparecchiatura HRR può essere utilizzata per l'analisi di un numero limitato di spermatozoi intatti o permeabilizzati. Esistono due strategie principali per valutare la funzione mitocondriale degli spermatozoi mediante HRR: (a) misurare il consumo di ossigeno nelle cellule intatte, che comporta la riproduzione della funzione respiratoria in un mezzo contenente substrati come il glucosio, o (b) misurare il consumo di ossigeno nelle cellule permeabilizzate utilizzando uno dei complessi OXPHOS, con l'aggiunta di substrati specifici per monitorare ciascuna funzione separatamente.

Nel presente studio, descriviamo l'uso dell'HRR per determinare la respirazione mitocondriale negli spermatozoi umani.

Protocollo

Gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato Etico della Facultad de Medicina de la Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.

Figura 1: Flusso di lavoro per la respirometria ad alta risoluzione per valutare la funzione mitocondriale in spermatozoi umani intatti e permeabilizzati. Il protocollo è stato suddiviso in quattro diverse fasi: 1) preparazione del campione, 2) calibrazione dell'ossigeno nello strumento Oroboros, 3) misurazione del consumo di ossigeno per cellule intatte e permeabilizzate e 4) estrazione dei dati dall'apparecchiatura e analisi. Abbreviazioni: CASA = analisi dello sperma assistita da computer; BWW = Biggers Whitten Whittingham medio; MRM = mezzo di respirazione mitocondriale; ADP = adenosina difosfato; FCCP = cianuro di carbonile -p-trifluorometossifenilidrazone; AA = antimicina A. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

NOTA: Il flusso di lavoro per misurare il consumo di ossigeno negli spermatozoi utilizzando HRR è mostrato nella Figura 1. Le informazioni sui materiali, le attrezzature e i reagenti utilizzati nel protocollo sono presentate nell'Indice dei materiali.

1. Preparazione del campione

1. Raccolta dei campioni
   1. Raccogliere lo sperma umano appena eiaculato mediante masturbazione dopo un'astinenza consigliata di 3 giorni in un contenitore di plastica sterile. Trasportare immediatamente i campioni in laboratorio.
   2. Incubare i campioni per 30-60 minuti a temperatura ambiente (RT) per liquefare completamente²⁴.
   3. Dopo la liquefazione, conservare i campioni a 37 °C fino all'inizio dell'esperimento.
2. Valutazione dello sperma con l'analisi dello sperma assistita da computer (CASA)
   1. Mescolare il campione e caricare 7 μL in una camera per il conteggio degli spermatozoi preriscaldata.
   2. Posizionare la camera sul tavolino preriscaldato (37 °C) di un microscopio a luce diretta.
   3. Aprire il software computerizzato per l'analisi dello sperma ed entrare nel modulo di motilità e concentrazione (cliccare su Mot).
   4. Selezionare la configurazione che corrisponde alle condizioni dello sperma umano.
      NOTA: La configurazione deve essere adattata al tipo e alla profondità della camera, nonché alla specie campione e al sistema CASA.
   5. Analizza in modo casuale 10 campi diversi per camera facendo clic sul pulsante Analizza .
   6. Fare clic su Risultati per ottenere la concentrazione e la motilità del campione.
3. Preparazione delle cellule
   NOTA: Se l'HRR non è calibrato, iniziare con i passaggi 2.1-2.2 prima di preparare le celle (passaggio 1.3). È importante misurare il consumo di ossigeno immediatamente quando gli spermatozoi vengono risospesi nel terreno.
   1. Centrifugare i campioni a 400 x g per 10 minuti a RT.
   2. Rimuovere il plasma seminale e risospendere gli spermatozoi in 2 mL di Biggers Whitten Whittingham (BWW) per esperimenti con cellule intatte o mezzo di respirazione mitocondriale (MRM) per studi con cellule permeabilizzate. Le composizioni dei supporti sono riportate nella Tabella 1.
   3. Ripetere i passaggi descritti al punto 1.2 per gli studi sulla concentrazione degli spermatozoi.

2. Respirometria ad alta risoluzione: analisi OXPHOS

NOTA: HRR integra ossigrafi altamente sensibili (Oxygraph-2 K; Oroboros Instruments GmbH, Innsbruck, Austria) con software (DatLab, versione 4.2; Oroboros Instruments GmbH). I dati sperimentali vengono visualizzati come concentrazione di ossigeno in funzione del tempo (come pmol di O₂/10⁶ cellule·min⁻¹) e come trasformazioni in tempo reale di questi dati, consentendo allo sperimentatore di monitorare la respirazione (consumo di ossigeno, flusso di ossigeno) di campioni biologici e biochimici mentre l'esperimento è ancora in corso. L'HRR può essere utilizzato per seguire la respirazione delle cellule vive e mobili, il che è particolarmente utile per gli spermatozoi, la cui motilità è associata alla qualità dello sperma e al potenziale di fertilità. Il laboratorio utilizza un HRR Oroboros Oxygraph2-k, Oroboros Instruments, con due camere. I passaggi descritti in questo protocollo devono essere eseguiti in modo indipendente per entrambe le camere da 2 mL.

1. Preparazione dell'attrezzatura
   1. Accendere l'HRR e collegarlo al software di respirometria (DatLab) per l'acquisizione e l'analisi dei dati.
   2. Sostituire l'etanolo al 70% nella camera dell'ossigrafo con ddH₂O. Agitare continuamente con l'ancoretta magnetica nella camera a 750 giri/min. Lasciare riposare per 10 minuti e successivamente aspirare la bidistillazione (dd) H₂O.
   3. Lavare la camera tre volte con ddH₂O per 5 minuti ogni volta.
      NOTA: Questo passaggio è necessario per rimuovere l'etanolo rimanente dalle camere. Gli spermatozoi sono molto sensibili all'etanolo. La registrazione potrebbe essere compromessa se questo passaggio viene omesso.
2. Calibrazione dei sensori di ossigeno
   NOTA: La procedura di calibrazione varia leggermente a seconda dello strumento. Eseguire una calibrazione dell'aria del sensore polarografico di ossigeno come descritto dal produttore²⁵. In questa sezione viene spiegato brevemente il protocollo di calibrazione.
   1. Rimuovere il ddH 2 O e pipettare₂mL dello stesso terreno utilizzato per la preparazione delle cellule nella camera. Posizionare i tappi, lasciando una bolla di ricambio d'aria.
      NOTA: È importante conoscere il volume della camera per determinare l'esatto volume di fluido necessario.
   2. Registrare i valori di calibrazione dell'ossigeno (fare clic su Layout > 01 Calibration Exp. Gr3-Temp) per monitorare le prestazioni della membrana del sensore agitando il fluido con l'ancoretta a 750 giri/min per almeno 30 minuti a 37 °C. Utilizzare le altre impostazioni come menzionato: guadagno per sensore: 2; tensione di polarizzazione: 800 mV; Intervallo di registrazione dei dati: 2,0 s.
      NOTA: Si prevede di ottenere una pendenza di O 2 non corretta (linea rossa) entro ±₂ pmol^∙s−1∙mL⁻¹ con un segnale stabile dal sensore polarografico.
   3. Trascinare il mouse tenendo premuto il pulsante sinistro del mouse e il tasto Maiusc per selezionare un'area in cui la variazione della concentrazione di ossigeno (concentrazione di O2 Y1, linea blu) è stabile.
   4. Aprire la finestra Calibrazione O₂ (fare clic su Oxygraph > Calibrazione O2). In Calibrazione aria, modificare il contrassegno selezionato nella regione selezionata al punto 2.2.3. Termina facendo clic su Calibra e copia negli appunti.
   5. Interrompi la registrazione e salva facendo clic su Oxygraph > Ok Control > Salva e Disconnetti.
      NOTA: questo set di dati deve essere salvato in modo che possa essere utilizzato in tutti gli esperimenti del giorno. La calibrazione viene eseguita solo una volta al giorno per ciascun fluido.
3. Titolazione di permeabilizzazione della digitonina
   1. Aprire la camera e aspirare il fluido all'interno.
   2. Caricare nella camera almeno 24 x 10 6 e non più di 70 x 10⁶ spermatozoi in un volume finale di 2 mL di MRM.
      NOTA: È importante misurare il numero di cellule nella camera per regolare il consumo di ossigeno alla fine dell'esperimento. Non è possibile misurare un numero di celle inferiore a quello consigliato.
   3. Chiudere la camera spingendo i tappi fino in fondo e aspirare il liquido rimanente nella parte superiore. Iniziare l'esperimento con le stesse impostazioni della calibrazione: velocità di agitazione: 750 giri/min; temperatura: 37 °C; guadagno per sensore: 2; tensione di polarizzazione: 800 mV; e intervallo di registrazione dei dati: 2,0 s.
   4. Per caricare la calibrazione, fare doppio clic sulla casella Pos Calib nell'angolo in basso. Aprire la calibrazione eseguita al punto 2.2 (fare clic su Oxygraph > O2 Calibration > Copy from File) e fare clic su Calibrate and Copy to Clipboard.
      NOTA: La casella POS Calib cambierà da gialla a verde. I dati vengono visualizzati nei grafici del flusso di ossigeno corretto per volume (Layout 05 Flusso per volume non corretto). Diversi layout sono disponibili in Oxygraph > Layout.
   5. Aggiungere 5 μL di adenosina difosfato 0,5 M (ADP), 10 μL di glutammato 2 M e 2,5 μL di malato 0,4 M (concentrazioni finali: 1,25 mM, 10 mM e 0,5 mM). Misurare il consumo di ossigeno fino a quando il segnale non si stabilizza.
      NOTA: Le microsiringhe Hamilton di precisione vengono utilizzate per l'iniezione attraverso la porta di caricamento nel tappo. Utilizzare una siringa per farmaco per evitare la contaminazione incrociata. Fare clic su F4 per registrarsi e segnare nel registro dell'ossigeno quando viene aggiunto un trattamento.
      NOTA: I substrati vengono preparati in acqua ultrapura e conservati a -20 °C per 3 mesi.
   6. Tritate aggiungendo 1 μL di digitonina 10 mM in fasi successive fino a quando il consumo di ossigeno raggiunge un livello massimo.
      NOTA: Un lavaggio accurato con acqua, etanolo al 70% ed etanolo al 100% è essenziale se la stessa camera viene utilizzata per due esperimenti nello stesso giorno.
      NOTA: Digitonin viene preparato in acqua ultrapura e conservato a -20 °C per 3 mesi.
4. Protocollo di valutazione respiratoria di routine per spermatozoi intatti e permeabilizzati (complesso I o complesso II)
   1. Aprire la camera e aspirare il fluido all'interno.
   2. Caricare nella camera almeno 24 x 10 6 e non più di 70 x 10⁶ spermatozoi in un volume finale di 2 mL di BWW (analisi delle cellule intatte) o MRM (analisi delle cellule permeabilizzate).
   3. Iniziare l'esperimento con le stesse impostazioni della calibrazione (questo è descritto al punto 2.3.3).
   4. Caricare la calibrazione eseguita al punto 2.2 come descritto al punto 2.3.4.
   5. Registrare la respirazione delle cellule per almeno 5 minuti fino a quando non si ottiene un segnale stabile. Questa misurazione corrisponde alla respirazione basale nelle cellule intatte.
   6. Se l'esperimento è con cellule intatte, procedere al passaggio 2.4.9. Per le cellule permeabilizzate, iniettare 4,5 μL di digitonina 10 mM (concentrazione finale: 22,5 μM). Permeabilizzare le cellule per 5 min.
   7. Aggiungere i substrati: 10 μL di glutammato 2 M e 2,5 μL di malato 0,4 M (concentrazioni finali: 10 mM e 0,5 mM, rispettivamente) per il complesso I o 20 μL di succinato 1 M (concentrazione finale: 10 mM) per il complesso II. Misurare il consumo di ossigeno fino a quando il segnale non aumenta e si stabilizza. Questo è lo stato 4, che significa respirazione supportata dal complesso basale I o dal complesso basale II in assenza di ADP.
      NOTA: I substrati vengono preparati in acqua ultrapura e conservati a -20 °C per 3 mesi.
   8. Iniettare 5 μL di ADP 0,5 M (concentrazione finale: 1,25 mM). Misurare il consumo di ossigeno fino a quando il segnale non aumenta e si stabilizza. L'aggiunta di ADP aumenta il segnale corrispondente al massimo consumo di ossigeno attraverso il complesso I o il complesso II (stato 3, nelle cellule permeabilizzate).
   9. Aggiungere 1 μL di oligomicina 4 mg/mL (concentrazione finale: 2 μg/mL), un inibitore dell'ATP sintetasi. Misurare il consumo di ossigeno fino a quando il segnale diminuisce e si stabilizza.
      NOTA: L'oligomicina viene preparata in etanolo e conservata a -20 °C per 3 mesi.
   10. Titolare aggiungendo 1 μL di 0,1 mM a 1 mM di cianuro di carbonile-P-trifluorometossi-fenilidrazone (FCCP) in fasi successive fino a raggiungere una frequenza respiratoria massima disaccoppiata. Misurare il consumo di ossigeno fino a quando il segnale non aumenta e si stabilizza.
       NOTA: FCCP viene preparato in etanolo e conservato a -20 °C per 3 mesi.
   11. La concentrazione finale di FCCP dipende dal campione. Interrompere l'iniezione del farmaco quando il consumo di ossigeno inizia a diminuire.
   12. Infine, iniettare 1 μL di antimicina A 5 mM (concentrazione finale di 2,5 μM). Si tratta di un inibitore del complesso III per discriminare tra il consumo di ossigeno mitocondriale e quello residuo (respirazione non mitocondriale). Per l'analisi del complesso I, aggiungere 1 μL di rotenone 1 mM (concentrazione finale 0,5 μM), un inibitore di questo complesso, invece di AA. Misurare il consumo di ossigeno fino a quando il segnale diminuisce e si stabilizza.
       NOTA: I farmaci sono preparati in etanolo e conservati a -20 °C per 3 mesi.

3. Estrazione e analisi dei dati

Figura 2: Acquisizione di parametri respiratori da un esperimento di respirometria ad alta risoluzione. (A,B) Rappresentazioni schematiche di grafici ottenuti, come descritto in Figura 1, rispettivamente per cellule intatte e permeabilizzate. Questi parametri sono stati descritti in precedenza¹⁵. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Trascinare il mouse premendo il tasto sinistro del mouse e il tasto Maiusc per selezionare le regioni in cui il flusso di ossigeno per volume correlato (Y2 O2 slope uncorr., linea rossa) è stabile dopo l'iniezione di un substrato o di un inibitore. La figura 2 mostra i diversi parametri ottenuti dal registro precedentemente descritto¹⁵.
   NOTA: I parametri dipendono dall'esperimento; tutti sono i seguenti: respirazione basale in cellule intatte e respirazione in presenza di glutammato/malato o succinato (stato 4), ADP (stato 3), oligomicina (perdita di protoni), FCCP (frequenza respiratoria massima), rotenone/AA (respirazione non mitocondriale). Nelle cellule permeabilizzate, la respirazione basale corrisponde allo stato 3.
2. Fare clic sulle finestre Indicatori > statistiche ed esportare i dati.
3. Normalizza i dati ottenuti per 1 milione di spermatozoi. Le unità dei pendii sono pmolO₂·s−1·mL⁻¹·10⁻⁶ cellule.
4. Sottrarre il consumo di ossigeno non mitocondriale da tutti i valori prima di calcolare gli indici.
5. Calcolare gli indici utilizzando le varie equazioni precedentemente descritte¹⁵:
   

Risultati

Determinazione della concentrazione ottimale di digitonina negli spermatozoi
In questo protocollo, presentiamo l'uso dell'HRR per monitorare in tempo reale i cambiamenti in OXPHOS negli spermatozoi umani. Poiché il metodo può essere utilizzato per analizzare spermatozoi intatti o permeabilizzati alle digitonine, presentiamo innanzitutto la standardizzazione della concentrazione di digitonina necessaria per permeabilizzare gli spermatozoi (Figura 3).

Discussione

L'HRR dipende in modo critico da diverse fasi: (a) la manutenzione dell'apparecchiatura, (b) la calibrazione accurata dei sensori di ossigeno, (c) la titolazione del disaccoppiatore²⁶ e, infine, (d) l'uso adeguato degli indici che rappresentano la funzione mitocondriale. La manutenzione dell'attrezzatura è fondamentale. Si raccomanda di sostituire regolarmente le membrane del sensore polarografico di ossigeno e di correggere lo sfondo strumentale. Un lavaggio estensivo dopo il prelievo degli sper...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acid free- Bovine serum albumine	Sigma Aldrich	A8806
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma Aldrich	A5285
Animycin A from streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone	Sigma Aldrich	C2920
DatLab sofware version 4,2	Oroboros Instruments GmbH	N/A
D-glucose	Sigma Aldrich	G7021
Digitonin	Sigma Aldrich	D141
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
L glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L malic acid	Sigma Aldrich	M1000
Magnesium sulphate	Sigma Aldrich	M7506
Microliter Syringes	Hamilton	87900 or 80400
Microscope camera	Basler	acA780-75gc
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+	Nikon	N/A
Monopotassium phosphate	Sigma Aldrich	P5655
MOPS	Sigma Aldrich	M1254
Oligomycin A	Sigma Aldrich	75351
Oxygraph-2 K	Oroboros Instruments GmbH	N/A
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911
Power O2k-Respirometer	Oroboros Intruments	10033-01
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875
Saccharose	Sigma Aldrich	S0389
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Sodium lactate	Sigma Aldrich	L7022
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P2256
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research	Microptic	N/A
Sperm Counting Chamber DRM-600	Millennium Sciences CELL-VU	N/A
Succinate disodium salt	Sigma Aldrich	W327700