JoVE Logo
Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

La terapia ossea tramite ossificazione endocondrale mediante l'impianto di tessuto cartilagineo artificiale prodotto da cellule staminali mesenchimali ha il potenziale per aggirare gli inconvenienti delle terapie convenzionali. Gli idrogel di acido ialuronico sono efficaci nel ridimensionare gli innesti di cartilagine uniformemente differenziati e nel creare osso integrato con vascolarizzazione tra innesti fusi in vivo.

Abstract

La terapia convenzionale di rigenerazione ossea che utilizza cellule staminali mesenchimali (MSC) è difficile da applicare a difetti ossei di dimensioni superiori a quelle critiche perché non ha un meccanismo per indurre l'angiogenesi. L'impianto di tessuto cartilagineo artificiale fabbricato da MSC induce l'angiogenesi e la formazione ossea in vivo tramite ossificazione endocondrale (ECO). Pertanto, questo approccio ECO-mediato potrebbe essere una promettente terapia di rigenerazione ossea in futuro. Un aspetto importante dell'applicazione clinica di questo approccio ECO-mediato è la definizione di un protocollo per la preparazione di una quantità sufficiente di cartilagine da impiantare per riparare il difetto osseo. In particolare, non è pratico progettare una singola massa di cartilagine innestata di dimensioni conformi alla forma del difetto osseo effettivo. Pertanto, la cartilagine da trapiantare deve avere la proprietà di formare integralmente l'osso quando vengono impiantati più pezzi. Gli idrogel possono essere uno strumento interessante per aumentare gli innesti di ingegneria tissutale per l'ossificazione endocondrale per soddisfare i requisiti clinici. Sebbene molti idrogel di derivazione naturale supportino la formazione di cartilagine MSC in vitro e ECO in vivo, il materiale ottimale per lo scaffold per soddisfare le esigenze delle applicazioni cliniche deve ancora essere determinato. L'acido ialuronico (HA) è un componente cruciale della matrice extracellulare della cartilagine ed è un polisaccaride biodegradabile e biocompatibile. Qui, mostriamo che gli idrogel di HA hanno eccellenti proprietà per supportare la differenziazione in vitro del tessuto cartilagineo a base di MSC e promuovere la formazione di osso endocondrale in vivo.

Introduzione

L'osso autologo è ancora il gold standard per la riparazione di difetti ossei dovuti a traumi, difetti congeniti e resezione chirurgica. Tuttavia, l'innesto osseo autogeno presenta limitazioni significative, tra cui il dolore del donatore, il rischio di infezione e il volume osseo limitato che può essere isolato dai pazienti 1,2,3,4. Numerosi biomateriali sono stati sviluppati come sostituti ossei, combinando polimeri naturali o sintetici con materiali mineralizzati come il fosfato di calcio o l'idrossiapatite 5,6. La formazione ossea in questi materiali ingegnerizzati viene solitamente ottenuta utilizzando il materiale mineralizzato come materiale di priming per consentire alle cellule staminali di differenziarsi direttamente in osteoblasti attraverso il processo di ossificazione intramembrana (IMO)7. Questo processo manca della fase angiogenica, con conseguente insufficiente vascolarizzazione in vivo dell'innesto dopo l'impianto 8,9,10 e, pertanto, gli approcci che utilizzano tale processo potrebbero non essere ottimali per il trattamento di grandi difetti ossei 11.

Le strategie applicate per ricapitolare il processo di ossificazione endocondrale (ECO), un meccanismo innato nella scheletrogenesi durante lo sviluppo, hanno dimostrato di superare problemi significativi associati agli approcci tradizionali basati sull'IMO. Nell'ECO, i condrociti nel modello di cartilagine rilasciano il fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF), che promuove l'infiltrazione vascolare e il rimodellamento del modello di cartilagine nell'osso12. L'approccio ECO-mediato all'osteogenesi attraverso il rimodellamento della cartilagine e l'angiogenesi, che viene attivato anche durante la riparazione delle fratture, utilizza tessuto cartilagineo creato artificialmente derivato da MSC come materiale di priming. I condrociti possono tollerare l'ipossia nei difetti ossei, indurre l'angiogenesi e convertire un innesto di cartilagine senza vascolare in tessuto angiogenico. Numerosi studi hanno riportato che gli innesti di cartilagine a base di MSC generano osso in vivo implementando un tale programma ECO 13,14,15,16,17,18,19,20,21.

Un requisito essenziale per l'applicazione clinica di questo approccio ECO-mediato è come preparare la quantità desiderata di innesto di cartilagine in un contesto clinico. La preparazione di cartilagine clinica di dimensioni che si adattino al difetto osseo effettivo non è pratica. Pertanto, la cartilagine dell'innesto deve formare integralmente l'osso quando vengono impiantati più frammenti22. Gli idrogel possono essere uno strumento interessante per aumentare gli innesti di ingegneria tissutale per l'ossificazione endocondrale. Molti idrogel di derivazione naturale supportano la formazione di cartilagine MSC in vitro e ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; Tuttavia, il materiale di supporto ottimale per soddisfare i requisiti dell'applicazione clinica è rimasto indeterminato. L'acido ialuronico (HA) è un polisaccaride biodegradabile e biocompatibile presente nella matrice extracellulare della cartilagine33. L'acido ialuronico interagisce con le MSC tramite recettori di superficie come CD44 per supportare la differenziazione condrogenica 25,26,28,30,31,32,34. Inoltre, gli scaffold HA promuovono la differenziazione osteogenica mediata da IMO delle cellule staminali della polpa dentale umana35 e gli scaffold combinati con il collagene promuovono l'osteogenesi ECO-mediata36,37.

Qui, presentiamo un metodo per la preparazione di idrogel di HA utilizzando MSC umane adulte derivate dal midollo osseo e il loro utilizzo per la condrogenesi ipertrofica in vitro e la successiva ossificazione endocondrale in vivo38. Abbiamo confrontato le caratteristiche dell'HA con quelle del collagene, un materiale ampiamente applicato nell'ingegneria del tessuto osseo con MSC e un materiale utile per scalare gli innesti artificiali per l'ossificazione endocondrale17. In un modello murino immunocompromesso, i costrutti di HA e collagene seminati con MSC umane sono stati valutati per il potenziale ECO in vivo mediante impianto sottocutaneo. I risultati mostrano che gli idrogel di HA sono eccellenti come impalcatura per le MSC per creare innesti di cartilagine artificiale che consentono la formazione ossea attraverso l'ECO.

Il protocollo è diviso in due fasi. In primo luogo, i costrutti di MSC umane seminati su idrogel di acido ialuronico vengono preparati e differenziati in cartilagine ipertrofica in vitro. Successivamente, i costrutti differenziati vengono impiantati per via sottocutanea in un modello nudo per indurre l'ossificazione endocondrale in vivo (Figura 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

Questo protocollo utilizza topi nudi maschi di 4 settimane. Ospitare quattro topi in una gabbia con un ciclo luce/buio di 12 ore a 22−24 °C e 50%-70% di umidità relativa. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Tokyo Medical and Dental University (ID approvazione: A2019-204C, A2020-116A e A2021-121A).

1. Preparazione di tamponi e reagenti

  1. Preparare il terreno di crescita delle cellule staminali mesenchimali (terreno di crescita MSC) aggiungendo il kit supplementare di terreno di crescita MSC al terreno basale MSC e conservarlo a 4 °C.
  2. Preparare il terreno di coltura Dulbecco Modified Eagle e il terreno F12 (DMEM/F-12) di prosciutto aggiungendo il 10% di siero fetale bovino (FBS), 50 μg/mL di gentamicina, 200 μM di L-alanil-L-glutammina e 1 ng/mL di fattore di crescita fibroblastico basico al terreno e conservarlo a 4 °C.
  3. Preparare il terreno condrogenico aggiungendo l'1% di integratore ITS-G, lo 0,12% di albumina sierica bovina, 50 μg/mL di gentamicina, 0,35 mM di L-prolina, 100 nM di desametasone e 10 ng/mL di TGF-β3 al DMEM appena prima dell'uso.
  4. Preparare il terreno ipertrofico aggiungendo 10 mM di β-glicerofosfato, albumina sierica bovina allo 0,12%, desametasone 10 nM, 200 μM di ascorbato-2-fosfato, 50 nM di L-tiroxina, 50 μg/mL di gentamicina e 50 pg/mL di IL-1β al DMEM appena prima dell'uso.
  5. Rivestire una piastra di coltura a 24 pozzetti con 200 μL di paraffina fusa preriscaldata a 60 °C. Lasciare riposare a temperatura ambiente fino a quando la paraffina non si sarà solidificata.

2. Espansione delle MSC umane

NOTA: Prima di iniziare gli esperimenti, le MSC con un alto potenziale di condrogenesi delle MSC devono essere selezionate in micro coltura di massa come descritto alpunto 17.

  1. Secondo le istruzioni del produttore, coltivare MSC primarie derivate dal midollo osseo umano (passaggio 2) con terreno di coltura MSC in un piatto di 10 cm a una densità di 5 x 103 cellule/cm 2 a 37 °C in incubatrice ad aria umidificata al 5% di CO2 e al 95%.
  2. Cambiare il terreno ogni 2-3 giorni. Una volta che le cellule raggiungono l'80%-90% di confluenza, aspirare il terreno dal piatto di coltura cellulare utilizzando una pompa a vuoto, lavare con 5 mL di PBS, quindi aspirare la soluzione con una pompa a vuoto.
  3. Aggiungere 1 ml di soluzione di tripsina allo 0,05% e EDTA allo 0,02% nel piatto. Incubare la capsula per 5-10 minuti a 37 °C.
  4. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura MSC per fermare la reazione enzimatica. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 50 ml.
  5. Unire la sospensione cellulare di altre piastre nella provetta da 50 ml e tenerla in ghiaccio.
  6. Utilizzare il contatore di cellule per contare le cellule mescolando 10 μL di sospensione cellulare con 10 μL di colorante blu tripano allo 0,4%.
  7. Centrifugare la sospensione cellulare rimanente a 220 x g per 3 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e aggiungere la soluzione di crioconservazione a una concentrazione di 1,0 x 106 cellule per mL.
  8. Erogare 1 mL della sospensione cellulare in ciascun criotubo e conservare a -80 °C per 12 ore prima di trasferire in azoto liquido. Per questo protocollo vengono utilizzate le scorte congelate risultanti (passaggio 3).
  9. Per gli esperimenti, seminare le MSC immagazzinate in un piatto di 10 cm ad una densità di 5 x 103 cellule/cm2. Colture cellulari fino all'80%-90% confluente (passaggio 4) in terreno DMEM/F-12.

3. Preparazione di idrogel incapsulati in MSC

  1. Tripsinizzare le cellule e preparare la sospensione cellulare come descritto nei passaggi 2.3 - 2.6.
  2. Per ottenere 10 costrutti (2,5 x 10 5 cellule per costrutto), aliquotare la sospensione cellulare contenente 2,5 x 106 cellule in un microtubo da1,5 mL.
  3. Centrifugare la sospensione a 220 x g per 3 minuti, rimuovere il surnatante con una pompa a vuoto e tenerlo in ghiaccio.
  4. Portare a temperatura ambiente l'acido ialuronico (HA) tiolo-modificato, il reticolante tiolo-reattivo, il polietilenglicole diacrilato e le bottiglie d'acqua degassata.
  5. In condizioni sterili, aggiungere 1,0 mL di acqua degassata al flacone contenente acido ialuronico (vedere le istruzioni del produttore) utilizzando una siringa con un ago.
  6. Vortice di tanto in tanto riscaldato a 37 °C fino a quando la soluzione diventa limpida, quindi mettere su ghiaccio. Ci vogliono meno di 30 minuti perché i solidi si dissolvano completamente.
  7. In condizioni sterili, aggiungere 0,5 ml di acqua degassata al flacone reticolante utilizzando una siringa con un ago. Sciogliere capovolgendo più volte, quindi mettere sul ghiaccio.
  8. Aggiungere 120 μL della soluzione di HA disciolta al pellet cellulare aliquotato (2,5 x 106 cellule). Risospendere il pellet cellulare pipettando avanti e indietro.
  9. Aggiungere 30 μL della soluzione reticolante disciolta alla provetta contenente l'acido ialuronico e le cellule (passaggio 3.8) e combinare picchiettando la provetta, quindi ruotare brevemente. Combinare la soluzione HA e la soluzione reticolante in un rapporto 4:1.
  10. Far cadere 15 μL della soluzione combinata contenente MSC (2,5 x 105 cellule) sulla piastra a 24 pozzetti rivestita in paraffina e lasciarla solidificare a 37 °C per 30 minuti (Figura 2). A causa dell'elevata viscosità, preparare almeno il 10% in più della miscela cella/idrogel rispetto al necessario.
    NOTA: Le caratteristiche dell'idrogel sono state descritte in precedenza39.

4. Condizioni di differenziazione in vitro

  1. Aggiungere 0,5 mL di terreno di differenziazione condrogenico a un costrutto di idrogel di HA seminati con MSC. Cambiare il terreno ogni 2-3 giorni.
  2. Dopo 3 settimane, passare al terreno di differenziazione ipertrofica (0,5 mL per pozzetto) e coltivare i costrutti per altre 2 settimane.

5. Impianto in vivo di MSC

  1. Dopo un totale di 5 settimane di coltura in vitro, impiantare i costrutti per via sottocutanea nella parte posteriore di topi nudi come descritto in precedenza38,40.
  2. Pesare i topi e somministrare un anestetico combinato preparato con 0,75 mg/kg di peso corporeo (p.c.) medetomidina, 4,0 mg/kg p.c. midazolam e 5,0 mg/kg p.c. butorfanolo mediante iniezione intraperitoneale come descritto38.
  3. Confermare un'adeguata anestesia mediante immobilità agli stimoli chirurgici e monitorare la profondità respiratoria mediante movimenti toracici lenti e regolari e un corretto apporto di ossigeno in base al colore della mucosa rosa periodicamente durante l'operazione. Utilizzare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
  4. Posizionare il topo su un telo chirurgico sterile in posizione prona, sterilizzare il sito di incisione con 50 ppm di acqua acida ipoclorosa (pH 5,0; HAW) e posizionare un telo chirurgico perforato sul topo.
    NOTA: Sterilizzare tutti i materiali chirurgici in autoclave, gas ossido di etilene o HAW. I chirurghi devono lavarsi le dita e indossare camici e guanti chirurgici.
  5. Eseguire due incisioni cutanee lunghe 5 mm a 2 cm di distanza l'una dall'altra nelle zone delle spalle e dei fianchi lungo la linea centrale della colonna vertebrale usando le forbici.
  6. Inserire una spatola per via sottocutanea attraverso l'incisione per creare una tasca sottocutanea.
  7. Inserire due o tre costrutti (~15 μL ciascuno, passaggio 5.1) in ciascuna tasca con una pinza. I costrutti di acido ialuronico impiantati nella stessa tasca sono soggetti a fusione molto frequentemente. Per evitare la fusione, inserire un costrutto HA in ciascuna tasca.
  8. Chiudere le incisioni con suture di seta intrecciata 4-0. Iniettare nel topo un antagonista degli anestetici preparato con 0,75 mg/kg di patipamezolo nel p.c. come descritto38.
  9. Mentre i topi si riprendono dall'anestesia, metti i topi in gabbie di recupero sterili contenenti lettiera sterile senza cibo e bottiglie d'acqua e monitora continuamente la temperatura corporea, il polso e la respirazione.
  10. Non lasciare i topi incustoditi fino a quando non hanno ripreso coscienza sufficiente per mantenere l'inquisizione sternale. Dopo il completo recupero, riportare gli animali nella stanza di allevamento con gli altri animali.
  11. Monitora gli animali ogni due giorni durante il periodo di guarigione per eventuali complicazioni. Sopprimere i topi per inalazione di anidride carbonica con poca sofferenza a 4 e 8 settimane dopo l'impianto.
  12. Incidere la pelle nei siti innestati e rimuovere i costrutti impiantati con una pinza. Fissare i costrutti in paraformaldeide al 4% per 16 ore e poi sottoporli ad analisi.

6. Analisi statistica

  1. Riportare i dati quantitativi come media ± deviazione standard (SD). Eseguire analisi statistiche utilizzando software commerciali.
  2. Utilizzare il test t di Student o l'ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto multiplo di Tukey per determinare differenze significative tra i gruppi. P<0,05 e P<0,01 indicano differenze significative tra i due gruppi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Gli idrogel di HA incapsulati in MSC sono stati coltivati in terreno condrogenico integrato con TGFβ3, un induttore della condrogenesi41 (fase 4.1). Abbiamo confrontato le proprietà dell'HA con quelle del collagene, che ha dimostrato di essere efficace nella creazione di innesti di cartilagine artificiale a base di MSC per l'ossificazione endocondrale, come descritto in precedenza38. Le MSC indifferenziate non sono state incluse come controlli negativi in questo studio pe...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

L'utilizzo di materiali per scaffold appropriati che promuovono la transizione dalla cartilagine ipertrofica all'osso è un approccio promettente per aumentare gli innesti di cartilagine ipertrofica ingegnerizzati basati su MSC e trattare difetti ossei di dimensioni clinicamente significative. Qui, mostriamo che l'HA è un eccellente materiale per scaffold per supportare la differenziazione del tessuto cartilagineo ipertrofico basato su MSC in vitro e per promuovere la formazione di osso endocondrale in vivo...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Divulgazioni

Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi concorrenti.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione per la ricerca scientifica (KAKENHI) della Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (sovvenzione n. JP19K10259 e 22K10032 a MAI).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na SolutionFUJIFILM Wako Pure Chemical 209-16941
AntisedanNippon Zenyaku Kogyo
ascorbate-2-phosphateNacalai Tesque13571-14
BambankerGC LymphotecCS-02-001
basic fibroblastic growth factorReprocellRCHEOT002 
bovine serum albuminFUJIFILM Wako Pure Chemical 012-238817.5 w/v%
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4%InvitrogenC10283
dexamethasoneMerckD8893
DomitorNippon Zenyaku Kogyo
DormicumAstellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle MediumMerckD6429high glucose
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 HamMerckD6421
Fetal bovine serumHycloneSH30396.03
Gentamicin sulfateFUJIFILM Wako Pure Chemical 1676045 10 mg/mL
Haccpper GeneratorTechnoMaxCH-400-5QB50 ppm hypochlorous acid water
Human Mesenchymal Stem CellsLonzaPT-2501
HyStem Cell Culture Scaffold KitMerckHYS020
IL-1ßPeproTechAF-200-01B
ITS-G supplementFUJIFILM Wako Pure Chemical 090-06741×100
L-Alanyl-L-GlutamineFUJIFILM Wako Pure Chemical 016-21841200mmol/L (×100)
L-prolineNacalai Tesque29001-42
L-ThyroxineMerckT1775
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium
BulletKit		LonzaPT-3001
paraffinFUJIFILM Wako Pure Chemical 165-13375
PBS / pH7.4 100mlMedicago09-2051-100
TGF-β3 ProteintechHZ-1090
VetorphaleMeiji Seika Kaisha
Visiocare OintmentSAVAVET/SAVA Healthcare
β-glycerophosphateFUJIFILM Wako Pure Chemical 048-34332

Riferimenti

  1. Goldberg, V. M., Stevenson, S. Natural history of autografts and allografts. Clinical Orthopaedics and Related Research. (225), 7-16 (1987).
  2. Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 40 (5), 363-408 (2012).
  3. Vining, N. C., Warme, W. J., Mosca, V. S. Comparison of structural bone autografts and allografts in pediatric foot surgery. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 32 (7), 719-723 (2012).
  4. Roddy, E., DeBaun, M. R., Daoud-Gray, A., Yang, Y. P., Gardner, M. J. Treatment of critical-sized bone defects: clinical and tissue engineering perspectives. European Journal of Orthopaedic Surgery and Traumatology. 28 (3), 351-362 (2018).
  5. Rezwan, K., Chen, Q. Z., Blaker, J. J., Boccaccini, A. R. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
  6. Swetha, M., et al. Biocomposites containing natural polymers and hydroxyapatite for bone tissue engineering. International Journal of Biological Macromolecules. 47 (1), 1-4 (2010).
  7. Meijer, G. J., de Bruijn, J. D., Koole, R., van Blitterswijk, C. A. Cell-based bone tissue engineering. PLOS Medicine. 4 (2), e9(2007).
  8. Tremblay, P. L., Hudon, V., Berthod, F., Germain, L., Auger, F. A. Inosculation of tissue-engineered capillaries with the host's vasculature in a reconstructed skin transplanted on mice. American Journal of Transplantation. 5 (5), 1002-1010 (2005).
  9. Ko, H. C., Milthorpe, B. K., McFarland, C. D. Engineering thick tissues--the vascularisation problem. European Cells and Materials. 14, 1-19 (2007).
  10. Santos, M. I., Reis, R. L. Vascularization in bone tissue engineering: physiology, current strategies, major hurdles and future challenges. Macromolecular Bioscience. 10 (1), 12-27 (2010).
  11. Almubarak, S., et al. Tissue engineering strategies for promoting vascularized bone regeneration. Bone. 83, 197-209 (2016).
  12. Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
  13. Farrell, E., et al. Chondrogenic priming of human bone marrow stromal cells: a better route to bone repair. Tissue Engineering Part C: Methods. 15 (2), 285-295 (2009).
  14. Scotti, C., et al. Recapitulation of endochondral bone formation using human adult mesenchymal stem cells as a paradigm for developmental engineering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (16), 7251-7256 (2010).
  15. Janicki, P., Kasten, P., Kleinschmidt, K., Luginbuehl, R., Richter, W. Chondrogenic pre-induction of human mesenchymal stem cells on beta-TCP: enhanced bone quality by endochondral heterotopic bone formation. Acta Biomaterialia. 6 (8), 3292-3301 (2010).
  16. Farrell, E., et al. In-vivo generation of bone via endochondral ossification by in-vitro chondrogenic priming of adult human and rat mesenchymal stem cells. BMC Musculoskeletal Disorders. 12, 31(2011).
  17. Scotti, C., et al. Engineering of a functional bone organ through endochondral ossification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3997-4002 (2013).
  18. Harada, N., et al. Bone regeneration in a massive rat femur defect through endochondral ossification achieved with chondrogenically differentiated MSCs in a degradable scaffold. Biomaterials. 35 (27), 7800-7810 (2014).
  19. van der Stok, J., et al. Chondrogenically differentiated mesenchymal stromal cell pellets stimulate endochondral bone regeneration in critical-sized bone defects. European Cells and Materials. 27, 137-148 (2014).
  20. Sheehy, E. J., Vinardell, T., Toner, M. E., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Altering the architecture of tissue engineered hypertrophic cartilaginous grafts facilitates vascularisation and accelerates mineralisation. PLoS One. 9 (3), e90716(2014).
  21. Sheehy, E. J., Mesallati, T., Vinardell, T., Kelly, D. J. Engineering cartilage or endochondral bone: a comparison of different naturally derived hydrogels. Acta Biomaterialia. 13, 245-253 (2015).
  22. Bahney, C. S., et al. Stem cell-derived endochondral cartilage stimulates bone healing by tissue transformation. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (5), 1269-1282 (2014).
  23. Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture. Osteoarthritis Cartilage. 14 (2), 179-189 (2006).
  24. Dickhut, A., Gottwald, E., Steck, E., Heisel, C., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells in gel-like biomaterials in vitro and in vivo. Frontiers in Bioscience. 13, 4517-4528 (2008).
  25. Chung, C., Burdick, J. A. Influence of three-dimensional hyaluronic acid microenvironments on mesenchymal stem cell chondrogenesis. Tissue Engineering Part A. 15 (2), 243-254 (2009).
  26. Erickson, I. E., et al. Macromer density influences mesenchymal stem cell chondrogenesis and maturation in photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels. Osteoarthritis Cartilage. 17 (12), 1639-1648 (2009).
  27. Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Chondrocytes and bone marrow-derived mesenchymal stem cells undergoing chondrogenesis in agarose hydrogels of solid and channelled architectures respond differentially to dynamic culture conditions. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5 (9), 747-758 (2011).
  28. Erickson, I. E., et al. High mesenchymal stem cell seeding densities in hyaluronic acid hydrogels produce engineered cartilage with native tissue properties. Acta Biomaterialia. 8 (8), 3027-3034 (2012).
  29. Ma, K., Titan, A. L., Stafford, M., Zheng, C., Levenston, M. E. Variations in chondrogenesis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in fibrin/alginate blended hydrogels. Acta Biomaterialia. 8 (10), 3754-3764 (2012).
  30. Levett, P. A., et al. A biomimetic extracellular matrix for cartilage tissue engineering centered on photocurable gelatin, hyaluronic acid and chondroitin sulfate. Acta Biomaterialia. 10 (1), 214-223 (2014).
  31. Reppel, L., et al. Chondrogenic induction of mesenchymal stromal/stem cells from Wharton's jelly embedded in alginate hydrogel and without added growth factor: an alternative stem cell source for cartilage tissue engineering. Stem Cell Research & Therapy. 6, 260(2015).
  32. Amann, E., Wolff, P., Breel, E., van Griensven, M., Balmayor, E. R. Hyaluronic acid facilitates chondrogenesis and matrix deposition of human adipose derived mesenchymal stem cells and human chondrocytes co-cultures. Acta Biomaterialia. 52, 130-144 (2017).
  33. Hemshekhar, M., et al. Emerging roles of hyaluronic acid bioscaffolds in tissue engineering and regenerative medicine. International Journal of Biological Macromolecules. 86, 917-928 (2016).
  34. Pfeifer, C. G., et al. Higher Ratios of Hyaluronic Acid Enhance Chondrogenic Differentiation of Human MSCs in a Hyaluronic Acid-Gelatin Composite Scaffold. Materials (Basel). 9 (5), (2016).
  35. La Noce, M., et al. Hyaluronan-Based Gel Promotes Human Dental Pulp Stem Cells Bone Differentiation by Activating YAP/TAZ Pathway. Cells. 10 (11), (2021).
  36. Thompson, E. M., Matsiko, A., Kelly, D. J., Gleeson, J. P., O'Brien, F. J. An Endochondral Ossification-Based Approach to Bone Repair: Chondrogenically Primed Mesenchymal Stem Cell-Laden Scaffolds Support Greater Repair of Critical-Sized Cranial Defects Than Osteogenically Stimulated Constructs In Vivo. Tissue Engineering Part A. 22 (5-6), 556-567 (2016).
  37. Wang, H., et al. Cell-mediated injectable blend hydrogel-BCP ceramic scaffold for in situ condylar osteochondral repair. Acta Biomaterialia. 123, 364-378 (2021).
  38. Yamazaki, S., et al. Hyaluronic acid hydrogels support to generate integrated bone formation through endochondral ossification in vivo using mesenchymal stem cells. PLoS One. 18 (2), e0281345(2023).
  39. Zarembinski, T., Skardal, A. Hydrogels - Smart Materials for Biomedical Applications. , (2019).
  40. Vinardell, T., Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. A comparison of the functionality and in vivo phenotypic stability of cartilaginous tissues engineered from different stem cell sources. Tissue Engineering Part A. 18 (11-12), 1161-1170 (2012).
  41. Mueller, M. B., et al. Hypertrophy in mesenchymal stem cell chondrogenesis: effect of TGF-beta isoforms and chondrogenic conditioning. Cells Tissues Organs. 192 (3), 158-166 (2010).
  42. Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
  43. Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
  44. Chan, C. K., et al. Endochondral ossification is required for haematopoietic stem-cell niche formation. Nature. 457 (7228), 490-494 (2009).
  45. Murdoch, A. D., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow stem cells in transwell cultures: generation of scaffold-free cartilage. Stem Cells. 25 (11), 2786-2796 (2007).
  46. Tortelli, F., Tasso, R., Loiacono, F., Cancedda, R. The development of tissue-engineered bone of different origin through endochondral and intramembranous ossification following the implantation of mesenchymal stem cells and osteoblasts in a murine model. Biomaterials. 31 (2), 242-249 (2010).
  47. Knuth, C. A., Witte-Bouma, J., Ridwan, Y., Wolvius, E. B., Farrell, E. Mesenchymal stem cell-mediated endochondral ossification utilising micropellets and brief chondrogenic priming. European Cells and Materials. 34, 142-161 (2017).
  48. Simmons, C. A., Alsberg, E., Hsiong, S., Kim, W. J., Mooney, D. J. Dual growth factor delivery and controlled scaffold degradation enhance in vivo bone formation by transplanted bone marrow stromal cells. Bone. 35 (2), 562-569 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

Cellule staminali mesenchimaliTerapia di rigenerazione osseaAngiogenesiOssificazione endocondraleTessuto cartilagineo artificialeDifetto osseoApplicazione clinicaProtocolloIdrogelInnesti di ingegneria tissutaleAcido ialuronico HA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati