Produzione e ottimizzazione di LTE, un sistema di espressione proteica libera derivato da Leishmania tarantolae per la produzione di proteine ricombinanti

Riepilogo

L'estratto traslazionale di Leishmania (LTE) è un sistema di espressione proteica eucariotico privo di cellule derivato dal parassita unicellulare Leishmania tarentolae. Questo protocollo ottimizzato rende l'LTE semplice ed economico da produrre. È adatto per varie applicazioni incentrate sull'espressione multiparallela e sullo studio di proteine eucariotiche complesse e delle loro interazioni.

Abstract

Questo protocollo delinea la produzione e l'ottimizzazione di un sistema di espressione proteica eucariotica (CFPS) derivato dal flagellato unicellulare Leishmania tarentolae, denominato Leishmania Translational Extract o LTE. Sebbene questo organismo si sia originariamente evoluto come parassita dei gechi, può essere coltivato facilmente ed economicamente in fiasche o bioreattori. A differenza della Leishmania major, non è patogena per l'uomo e non richiede particolari precauzioni di laboratorio. Un altro vantaggio dell'utilizzo di Leishmania per la CFPS è che l'aggiunta di un singolo oligonucleotide antisenso alla CFPS, mirata a una sequenza leader di splicing conservata sull'estremità 5' di tutti gli RNA codificanti proteine, può sopprimere l'espressione proteica endogena. Forniamo procedure per la disgregazione cellulare e il trattamento del lisato, che sono state semplificate e migliorate rispetto alle versioni precedenti. Queste procedure iniziano con semplici colture in fiaschetta. Inoltre, spieghiamo come introdurre informazioni genetiche utilizzando vettori contenenti siti di inizio della traduzione specie-indipendenti (SITS) e come eseguire l'ottimizzazione dei lotti e il controllo di qualità per garantire una qualità costante dell'espressione proteica.

Introduzione

Negli anni '60, i sistemi di espressione proteica libera da cellule hanno svolto un ruolo fondamentale nella scoperta del codice genetico¹. Tuttavia, i sistemi di espressione proteica liberi da cellule procariotiche, basati principalmente su E. coli, attualmente dominano sia le applicazioni di laboratorio che quelle commerciali. Sebbene i sistemi basati su E. coli offrano vantaggi quali economicità, scalabilità e alte rese di espressione, devono affrontare sfide quando producono proteine multidominio nelle loro forme attive e facilitano l'assemblaggio di complessi proteici

Protocollo

Questo protocollo include ricette dettagliate e passaggi dei terreni che coinvolgono la coltura, la centrifugazione, la misurazione della fluorescenza GFP utilizzando un lettore di piastre multimodale, la misurazione della coltura OD_{600 nm} e la valutazione del lisato Abs_{280 nm}. Copre anche la configurazione e l'imaging dei gel proteici SDS-PAGE. I materiali richiesti o suggeriti per questo protocollo sono elencati nel foglio di calcolo dei materiali. È importante notare che le tipiche risorse di laboratorio come componenti di terreni, centrifughe, provette, spettrofotometri e configurazioni di elettroforesi su ge....

Discussione

I protocolli per la creazione di LTE sono stati pubblicati nell'ultimo decennio⁷ e sono stati sottoposti ad aggiornamenti periodici^25,34. Tuttavia, i neofiti della tecnica incontrano spesso una curva di apprendimento ripida, con conseguenti ritardi nel raggiungimento di un'espressione proteica di alta qualità e ad alto rendimento. Sfide simili sono state segnalate da altri gruppi di ricerca che lavorano c.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
PD-10 SuperDex 25 Columns	Cytiva	17085101	Gel filtration columns
Nitrogen Cavitation cell disrupter	Parr Industries	4635 or 4639	Cell Disrupter
Bovine derived Hemin	Sigma-Aldrich	H5533	Culture additive
Penicillin/Streptomycin 10000U/ml	Thermo-Fisher	15140122	Antibiotic mix
Optiplate 384	Perkin-Elmer	6007290	Multiwell plate for 10ul expressions
Oligonucleotide	IDT synthesis		Oligo with sequence CAATAAAGTACAGAAACTGATAC TTATATAGCGTT
Creatine Phosphokinase	Sigma-Aldrich	9001-15-4	Enzyme
Tecan Spark	Tecan		or similar Multimode Platereader
Chemidoc MP Imager	Biorad		or similar SDS-PAGE gel Imager
4-12% Bis-Tris Gels	Invitrogen	NW04125	SDS-PAGE gels
Biophotometer	Eppendorf		or similar Cuvette Specrophotometer
Nanodrop One	Thermofisher		Nanodrop spectrophotometer
Avanti JXN-26 centrifuge	Beckman Coulter		or similar centrifuge, with rotors/tubes rated 10K and 50K g
5424R microcentrifuge	Eppendorf		or similar microcentrifuge, with 1.5ml microcentrifuge tubes
Flask Incubator Inova S44i	Eppendorf		or similar flask incubator shaker suitable for 5L Flasks
5L glass culture flasks			Baffled glass flasks for culture growth
Bactotryptone	BD	211705	Growth medium
Yeast Extract	Merck	VM930053	Growth medium
Glycerol			Any analytical grade
Glucose			Any analytical grade
KH2PO4			Any analytical grade
K2HPO4			Any analytical grade
UltraPure water	Invitrogen	10977-015	Or output from any MilliQ-type water dispenser