Isolamento, coltura e induzione adipogenica di preadipociti derivati dalla frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo periaortico di topo

Riepilogo

Qui, descriviamo l'isolamento, la coltura e l'induzione adipogenica di preadipociti derivati dalla frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo periaortico di topo, consentendo lo studio della funzione del tessuto adiposo perivascolare e della sua relazione con le cellule vascolari.

Abstract

Il tessuto adiposo perivascolare (PVAT) è un deposito di tessuto adiposo che circonda i vasi sanguigni e presenta i fenotipi di adipociti bianchi, beige e marroni. Recenti scoperte hanno messo in luce il ruolo centrale del PVAT nella regolazione dell'omeostasi vascolare e nella partecipazione alla patogenesi delle malattie cardiovascolari. Una comprensione completa delle proprietà e della regolazione del PVAT è di grande importanza per lo sviluppo di future terapie. Le colture primarie di adipociti periaortici sono preziose per studiare la funzione PVAT e il crosstalk tra adipociti periaortici e cellule vascolari. Questo articolo presenta un protocollo economico e fattibile per l'isolamento, la coltura e l'induzione adipogenica di preadipociti derivati dalla frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo periaortico di topo, che può essere utile per modellare l'adipogenesi o la lipogenesi in vitro. Il protocollo delinea l'elaborazione dei tessuti e la differenziazione cellulare per la coltura di adipociti periaortici da topi giovani. Questo protocollo fornirà la pietra angolare tecnologica a bordo banco per lo studio della funzione PVAT.

Introduzione

Si ritiene che il tessuto adiposo perivascolare (PVAT), una struttura perivascolare composta da una miscela di adipociti maturi e una frazione vascolare stromale (SVF), interagisca con la parete del vaso adiacente tramite il suo secretoma^{paracrino 1}. Come regolatore critico dell'omeostasi vascolare, la disfunzione PVAT è implicata nella patogenesi delle malattie cardiovascolari ^2,3,4. La SVF del tessuto adipocitario è costituita da diverse popolazioni cellulari previste, tra cui cellule endoteliali, cellule immunitarie, cellule del mesotelio, cellule neuronali e cellule staminali e progenitrici adipose (ASPC)^5,6. E' noto che le ASPC che risiedono nella SVF del tessuto adiposo possono dare origine ad adipociti maturi⁵. Si ritiene che la SVF sia una fonte critica di adipociti maturi nel PVAT. Diversi studi hanno dimostrato che PVAT-SVF può differenziarsi in adipociti maturi in specifiche condizioni^di induzione ^6,7,8.

Attualmente, esistono due sistemi di isolamento per isolare SVF dal tessuto adiposo, uno è la digestione enzimatica e l'altro è non enzimatico⁹. I metodi enzimatici in genere determinano una maggiore resa di cellule progenitrici nucleate¹⁰. Ad oggi, i benefici della SVF nel promuovere la rigenerazione vascolare e la neovascolarizzazione nelle malattie della guarigione delle ferite, urogenitali e cardiovascolari sono stati ampiamente dimostrati¹¹, in particolare in dermatologia e chirurgia plastica^12,13. Tuttavia, le prospettive di applicazione clinica delle SVF derivate da PVAT non sono state ben esplorate, il che può essere attribuito alla mancanza di un metodo standardizzato per l'isolamento delle SVF da PVAT. L'obiettivo di questo protocollo è quello di stabilire un approccio standardizzato per l'isolamento, la coltura e l'induzione adipogenica di preadipociti derivati da SVF da PVAT di topo che circondano l'aorta toracica, consentendo ulteriori indagini sulla funzione di PVAT. Questo protocollo ottimizza le tecniche di processamento tissutale e di differenziamento cellulare per la coltura di adipociti periaortici ottenuti da topi giovani.

Protocollo

I protocolli sugli animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali presso l'Ospedale Toracico di Shanghai affiliato alla Scuola di Medicina dell'Università Jiao Tong di Shanghai (numero di approvazione: KS23010) ed erano conformi alle normative etiche pertinenti. I topi C57BL/6 maschi e femmine di età compresa tra 4 e 8 settimane sono da preferire per questo esperimento.

1. Preparazione di strumenti chirurgici, tamponi e terreni di coltura

1. Sterilizzare in autoclave gli strumenti chirurgici (ad es. forbici chirurgiche e pinze standard) a 121 °C per 30 min. Disinfettare gli strumenti microchirurgici con alcol al 75%.
2. Preparare soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) integrata con penicillina-streptomicina all'1% v/v e altri 10 ml di PBS integrata con penicillina-streptomicina al 10% v/v.
   NOTA: Nelle sezioni seguenti, se non espressamente menzionato, il PBS si riferisce al PBS sterile regolare.
3. Preparare il tampone Krebs Ringer HEPES BSA: 1% albumina sierica bovina (BSA), 20 mM di HEPES disciolti nella soluzione Krebs Ringer.
4. Preparare una soluzione fresca per la digestione: collagenasi di tipo 1 (1 mg/ml) e dispasi II (4 mg/ml) disciolte nel tampone Krebs Ringer HEPES BSA. Sterilizzare la soluzione utilizzando un filtro da 0,2 μm.
5. Preparare una piastra a 12 pozzetti rivestita di collagene.
   1. Diluire la soluzione di collagene (1 mg/mL) con acqua deionizzata sterile alla concentrazione di 40 μg/mL. Aggiungere 1 mL della soluzione di collagene diluita sulla superficie di ciascun pozzetto per ottenere una concentrazione di 6-10 μg/cm². Incubare il rivestimento per 1 ora a temperatura ambiente.
   2. Rimuovere la soluzione rimanente e sciacquare ogni pozzetto 2 volte con 1 mL di PBS. Utilizzare immediatamente la piastra o asciugarla all'aria in una cappa a flusso laminare di classe II e conservare la piastra rivestita a 2-8 °C. Durante la conservazione, sigillare le piastre rivestite con parafilm.
6. Preparare il terreno di coltura: Dulbecco's-Modified Eagles Medium (DMEM) ad alto contenuto di glucosio, 10% di siero fetale bovino (FBS), 1% v/v di penicillina-streptomicina. Conservare a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
7. Preparare il terreno di induzione lipogenico: DMEM ad alto contenuto di glucosio, 10% FBS, 1% v/v penicillina-streptomicina, 1 nM triiodotironina, 1 μM rosiglitazone, 1 μM di insulina, 0,5 mM di 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) e 1 μM di desametasone. Conservare a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
8. Preparare il terreno di mantenimento: DMEM ad alto contenuto di glucosio, 10% FBS, 1% v/v penicillina-streptomicina, 1 nM triiodotironina, 1 μM di rosiglitazone e 1 μM di insulina. Conservare a 4 °C per un massimo di 2 settimane.

2. Dissezione e isolamento del tessuto adiposo perivascolare (PVAT)

1. Sopprimere il topo mediante lussazione cervicale in anestesia isoflurana al 2% o con sovradosaggio di anidride carbonica. Spruzzare con alcool al 75% per la disinfezione della pelle.
2. Posizionare il mouse in posizione supina (rivolto verso l'alto).
3. Sollevare la pelle, praticare una piccola incisione e separare bruscamente la pelle e i muscoli addominali con forbici chirurgiche lungo la linea mediana ventrale dal bacino al collo. Esporre il cuore e i polmoni tagliando il diaframma e le costole lungo entrambi i lati della linea mediana.
4. Rimuovere con cautela il fegato, la milza, l'intestino e i reni. Evitare di tagliare la parete intestinale.
5. Rimuovere i polmoni e l'esofago.
6. Sollevare delicatamente il cuore con una pinza in una mano e separare l'aorta dalla colonna vertebrale con le forbici chirurgiche nell'altra mano. Quindi, posizionare il cuore e l'aorta in una capsula di Petri da 60 mm con PBS contenente l'1% v/v di penicillina-streptomicina.
7. Rimuovere le pinze microchirurgiche e le forbici microchirurgiche dall'alcol e risciacquare con 25 ml di PBS per rimuovere l'alcol in eccesso. Sotto uno stereomicroscopio, rimuovere il timo e altri tessuti dal cuore e dall'aorta, quindi rimuovere il cuore, lasciando l'aorta con i PVAT.
8. Trasferire l'aorta con i PVAT in una capsula di Petri pulita da 60 mm con PBS contenente l'1% v/v di penicillina-streptomicina.
9. Utilizzare pinze microchirurgiche per rimuovere i PVAT, con un paio di pinze che fissano l'aorta e l'altra che stacca il tessuto adiposo. Rimuovere il più possibile il tessuto vascolare, riducendo al minimo i danni al tessuto adiposo perivascolare.
10. Raccogliere il PVAT che circonda l'aorta toracica nella provetta da microcentrifuga da 2 mL contenente DMEM ad alto contenuto di glucosio integrato con penicillina-streptomicina all'1% v/v posta su ghiaccio.

3. Isolamento della frazione vascolare stromale (SVF)

1. Sciacquare i tessuti raccolti in sequenza con PBS contenente il 10% v/v di penicillina-streptomicina e PBS contenente l'1% v/v di penicillina-streptomicina.
   NOTA: Da questa fase in poi, tutti gli esperimenti devono essere eseguiti in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare di classe II.
2. Trasferire i tessuti in una capsula di Petri sterile da 60 mm, aggiungere 200 μL di soluzione digestiva e tritarli in^{pezzi da 1 mm 3} utilizzando forbici sterili.
3. Trasferire la miscela in una provetta da centrifuga da 15 mL utilizzando un puntale di pipetta di plastica, l'estremità allargata da un taglio sterile a forbice, e aggiungere 6 mL di soluzione di digestione per avviare la reazione di digestione.
   NOTA: Una reazione di digestione (3 mL di soluzione di digestione) è sufficiente per i depositi PVAT di sei topi.
4. Incubare i tessuti a 37 °C in un incubatore con agitatore orbitale (frequenza 150 giri/min per una miscelazione efficace) per 30-45 minuti. Legare le provette su una griglia per farle scuotere orizzontalmente. Agitare energicamente su e giù a mano per 10 secondi ogni 5-10 minuti.
   NOTA: La digestione può essere interrotta quando si osserva un fluido digestivo omogeneo e giallastro senza frammenti di tessuto rimasti.
5. Filtrare i tessuti digeriti attraverso un colino cellulare da 70 μm in una provetta da centrifuga da 50 mL. Sciacquare il colino cellulare con un volume uguale di terreno di coltura per massimizzare la resa cellulare e fermare la digestione.
6. Trasferire il filtrato in una nuova provetta da centrifuga da 15 mL e centrifugare a 1.800 × g per 10 min. Capovolgere la provetta per scartare il surnatante e risospendere i pellet in 5 mL di PBS. Centrifugare a 1.800 × g per 5 min.
7. Scartare il surnatante capovolgendo la provetta e risospendere i pellet in un volume appropriato di terreno di coltura.
   NOTA: I pellet cellulari raccolti da ogni sei topi vengono risospesi in 1 mL di terreno di coltura e seminati in un pozzetto di una piastra da 12 pozzetti.
8. Seminare le cellule in una piastra a 12 pozzetti rivestita di collagene e incubare a 37 °C in un'atmosfera umida con il 5% di CO₂ per una notte.
9. Il giorno successivo, aspirare il terreno di coltura, lavare le cellule con PBS preriscaldato (37 °C) contenente l'1% v/v di penicillina-streptomicina per rimuovere i detriti cellulari e i globuli rossi e aggiungere nuovamente 1 mL di terreno di coltura fresco per ogni pozzetto.

4. Induzione adipogenica di preadipociti derivati da SVF dal tessuto adiposo periaortico

1. Cambiare il terreno di coltura a giorni alterni fino a quando le cellule raggiungono ~60-70% di confluenza.
   NOTA: Di solito ci vogliono 3-4 giorni prima che le cellule raggiungano il 60-70% di confluenza.
2. Quando le cellule raggiungono il 60-70% di confluenza, aspirare il terreno di coltura e sostituirlo con terreno di induzione adipogenico bruno. Considerare il giorno di induzione della differenziazione adipogenica come giorno 0 di differenziazione.
3. Dopo 72 ore (giorno 3 di differenziazione), rinfrescare il mezzo con il mezzo di mantenimento. Cambiare il mezzo di mantenimento ogni 2 giorni fino a quando le cellule non vengono utilizzate per gli esperimenti.
4. Analizzare le cellule adipogeniche in modo appropriato, come la colorazione Oil Red O¹⁴ e il western blotting¹⁵.

Risultati

Utilizzando questo protocollo sopra descritto, abbiamo isolato accuratamente i PVAT che circondano l'aorta toracica del topo (Figura 1A-D). Dopo aver lavato e tritato i PVAT in piccoli pezzi utilizzando forbici sterili (Figura 1E,F), i frammenti di tessuto sono stati digeriti in una soluzione digestiva contenente collagenasi di tipo 1 (1 mg/mL) e dispasi II (4 mg/mL) e incubati a 37 °C su uno shaker per 30-45 minuti (Fi...

Discussione

Proponiamo un approccio pratico e fattibile per l'isolamento e l'induzione adipogenica di preadipociti derivati da SVF dal tessuto adiposo periaortico di topo. I vantaggi di questo protocollo sono che è semplice ed economico. Un numero adeguato di topi è fondamentale per il successo dell'isolamento, poiché un tessuto insufficiente può causare una bassa densità di SVF e uno scarso stato di crescita, influenzando in ultima analisi l'efficienza lipogenica. Inoltre, l'età del topo è un fattore importante da considerar...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm syringe filters	PALL	4612
12-well plate	Labselect	11210
15 mL centrifuge tube	Labserv	310109003
3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3)	Sigma-Aldrich	T-2877	1 nM
50 mL centrifuge tube	Labselect	CT-002-50A
anti-adiponectin	Abcam	ab22554	1:1,000 working concentration
anti-COX IV	CST	4850	1:1,000 working concentration
anti-FABP4	CST	2120	1:1,000 working concentration
anti-PGC1α	Abcam	ab191838	1:1,000 working concentration
anti-PPARγ	Invitrogen	MA5-14889	1:1,000 working concentration
anti-UCP1	Abcam	ab10983	1:1,000 working concentration
anti-α-Actinin	CST	6487	1:1,000 working concentration
BSA	Beyotime	ST023-200g	1%
C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes	Shanghai Model Organisms Center, Inc.
Cell Strainer 70 µm, nylon	Falcon	352350
Collagen from calf skin	Sigma-Aldrich	C8919
Collagenase, Type 1	Worthington	LS004196	1 mg/mL
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756	1 μM
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G	4 mg/mL
Fetal bovine serum	Gibco	16000-044	10%
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-25G	20 mM
High glucose DMEM	Hyclone	SH30022.01
IBMX	Sigma-Aldrich	I7018	0.5 mM
Incubator with orbital shaker	Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd.	LYZ-103B
Insulin (cattle)	Sigma-Aldrich	11070-73-8	1 μM
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Krebs-Ringer's Solution	Pricella	PB180347	protect from light
Microsurgical forceps	Beyotime	FS233
Microsurgical scissor	Beyotime	FS217
Oil Red O	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	A600395-0050
PBS (Phosphate-buffered saline)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd	B548117-0500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-035-146	1:5,000 working concentration
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-035-144	1:5,000 working concentration
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408	1 μM
Standard forceps	Beyotime	FS225
Surgical scissor	Beyotime	FS001