Sviluppo e caratterizzazione di idrogel di matrice extracellulare polmonare decellularizzata

Riepilogo

Il protocollo chiarisce due distinte metodologie di decellularizzazione applicate ai tessuti polmonari bovini nativi, fornendo un resoconto completo delle rispettive caratterizzazioni.

Abstract

L'uso di idrogel derivati dalla matrice extracellulare (ECM) nell'ingegneria tissutale è diventato sempre più popolare, in quanto possono imitare l'ambiente naturale delle cellule in vitro. Tuttavia, mantenere il contenuto biochimico nativo dell'ECM, raggiungere la stabilità meccanica e comprendere l'impatto del processo di decellularizzazione sulle proprietà meccaniche degli idrogel dell'ECM sono impegnativi. In questo studio, sono stati descritti una pipeline per la decellularizzazione del tessuto polmonare bovino utilizzando due diversi protocolli, la caratterizzazione a valle dell'efficacia della decellularizzazione, la fabbricazione di idrogel ECM polmonari decellularizzati ricostituiti e la valutazione delle loro proprietà meccaniche e di citocompatibilità. La decellularizzazione del polmone bovino è stata perseguita utilizzando un metodo fisico (cicli di gelo-disgelo) o chimico (a base di detergenti). La colorazione con ematossilina ed eosina è stata eseguita per convalidare la decellularizzazione e la ritenzione dei principali componenti dell'ECM. Per la valutazione del contenuto residuo di collagene e glicosaminoglicani solfatati (sGAG) all'interno dei campioni decellularizzati, sono state impiegate rispettivamente le tecniche di colorazione del rosso Sirio e del blu Alciano. Le proprietà meccaniche degli idrogel ECM polmonari decellularizzati sono state caratterizzate dalla reologia oscillatoria. I risultati suggeriscono che gli idrogel polmonari bovini decellularizzati possono fornire un'alternativa organotipica affidabile ai prodotti ECM commerciali, conservando la maggior parte dei componenti nativi dell'ECM. Inoltre, questi risultati rivelano che il metodo di decellularizzazione scelto influisce in modo significativo sulla cinetica di gelificazione, nonché sulla rigidità e sulle proprietà viscoelastiche degli idrogel risultanti.

Introduzione

Le condizioni convenzionali di coltura monostrato non offrono una rappresentazione fedele dei microambienti tissutali nativi e non sono in grado di fornire un'impalcatura tridimensionale (3D) con ligandi istruttivi che consentano le interazioni cellula-matrice e cellula-cellula¹. La composizione della matrice extracellulare (ECM) e le proprietà meccaniche sono altamente tessuto-specifiche, tempo-dipendenti e subiscono alterazioni in condizioni patologiche. Pertanto, c'è bisogno di modelli tissutali 3D biomimetici che consentano la sintonizzabilità di tali caratteristiche, la modulazione del comportamento cellulare e il raggiungimento della funzionalità tissutale desiderata. I biomateriali nativi derivati dall'ECM attirano molta attenzione nell'ingegneria tissutale con la possibilità di utilizzare direttamente l'ECM 1,2,3,4,5 tessuto-specifico. I vettori basati su ECM sono stati utilizzati in molte applicazioni che vanno dalla rigenerazione tissutale allo sviluppo di modelli di malattia. Sono utilizzati come scaffold di biomateriali iniettabili o impiantabili ^4,5, in applicazioni di screening farmacologico ^6,7, nello sviluppo di materiali che inducono la crescita cellulare ^8,9,10, come bio-inchiostri 11,12,13, in microfluidica ¹⁴ e in modelli di tessuto tumorale 15,16,17^,18,19.

La decellularizzazione di tessuti e organi è un approccio popolare per la generazione di scaffold che imitano l'ECM tessuto-specifica. La ricostituzione di tessuti e organi decellularizzati in idrogel consente l'inclusione di cellule in modelli tissutali biomimetici^{3D 20}. Le tecniche di decellularizzazione si concentrano principalmente sull'eliminazione dei componenti cellulari mantenendo la composizione dell'ECM. Metodi fisici come i cicli di gelo-disgelo o processi chimici come il trattamento Triton-X-100 sono comunemente applicati per decellularizzare i tessuti. Inoltre, il trattamento con DNasi è preferito per la rimozione del DNA residuo per ridurre al minimo le risposte immunologiche all'inclusione cellulare. È fondamentale ottenere la massima rimozione cellulare e la minima compromissione dell'ECM per ottimizzare le procedure di decellularizzazione²¹. Oltre a questi aspetti, la caratterizzazione delle proprietà biochimiche e meccaniche degli scaffold ricostituiti, tra cui la viscoelasticità e la rigidità, è fondamentale per migliorare i modelli tissutali 3D ingegnerizzati derivati da matrici native²⁰.

L'ECM organo-specifica nell'ingegneria del tessuto polmonare consente di imitare il microambiente polmonare per modellare processi di sviluppo, omeostatici o patologici in vitro e testare terapie in un ambiente fisio-mimetico 20,22,23. Studi precedenti hanno dimostrato la decellularizzazione del tessuto polmonare di diverse specie, come ratti, suini ed esseri umani, ma questi metodi devono ancora essere adattati a specie meno utilizzate come i bovini. Una migliore comprensione dei parametri del processo di decellularizzazione e di come influenzano gli scaffold ECM ricostituiti risultanti per quanto riguarda la composizione biochimica e le proprietà meccaniche consentirà una migliore messa a punto di tali aspetti e aprirà la strada a modelli tissutali più affidabili in salute e malattia. In questo studio, la decellularizzazione del polmone bovino con due metodi distinti, cicli di gelo-disgelo e trattamento con Triton-X-100, è esplicitamente descritta e seguita da analisi biochimiche e meccaniche di idrogel ECM polmonari decellularizzati (dECM). I risultati rivelano che entrambi i metodi producono un'efficace decellularizzazione e ritenzione dei ligandi ECM. In particolare, la scelta del metodo altera significativamente la rigidità e la viscoelasticità risultanti degli idrogel ricostituiti. Gli idrogel derivati dalla dECM bovina dimostrano notevoli analogie biochimiche con la matrice extracellulare del polmone umano e presentano caratteristiche di gelificazione termica affidabili²⁰. Come descritto in precedenza, entrambi i metodi sono adatti per la coltura 3D di cellule tumorali polmonari, cellule epiteliali bronchiali sane e organoidi polmonari derivati da pazienti²⁰.

Protocollo

I polmoni autoctoni freschi di giovani (1-2 anni) donatori bovini sono stati ottenuti da un macello locale e trasportati in un contenitore di plastica sigillato su ghiaccio al laboratorio. Il sacrificio animale viene eseguito per il consumo generale di carne (polmoni scartati come rifiuti) e non è correlato o dovuto allo studio. Confermiamo che il macello è conforme alle leggi e ai regolamenti nazionali in materia di sacrifici animali. Inoltre, confermiamo di aver utilizzato solo materiale di scarto e che il progetto di ricerca non ha influito sul numero di animali sacrificati.

1. Prelievo di organi e preparazione dei tessuti

1. Conservare i tessuti polmonari bovini appena ottenuti a -80 °C fino all'esperimento.
2. Il giorno dell'esperimento, attendere che i tessuti polmonari congelati si scongelino a temperatura ambiente.
3. Sezionare i tessuti con bisturi sterili e forbici per rimuovere la trachea e le vie aeree cartilaginee e tritare ulteriormente in piccoli pezzi (5 mm³).
4. Lavare accuratamente con acqua ultrapura contenente il 2% di penicillina/streptomicina (P/S) almeno 3 volte.

2. Decellularizzazione dei tessuti

NOTA: I tessuti polmonari bovini nativi sono stati decellularizzati utilizzando due protocolli distinti.

1. Metodo di congelamento-scongelamento
   1. Preparare i campioni di tessuto in base al passaggio 1. Immergere i fazzoletti tritati in una soluzione di iodio al 2% in acqua distillata sterile (dH₂O) per 1 min. Eseguire due lavaggi consecutivi in dH₂O sterile.
   2. Trasferire i pezzi di tessuto tritato in una provetta da 50 mL fino al livello di 15 mL e implementare cinque cicli manuali di congelamento-scongelamento utilizzando un contenitore portatile di azoto liquido. Riempire le provette fino all'orlo con dH₂O sterili e congelare le provette per 2 minuti in azoto liquido. Dopo 2 minuti, trasferirli immediatamente a bagnomaria a 37 °C per 10 minuti. Si tratta di 1 ciclo di gelo-disgelo.
   3. Incubare i campioni con 30 mL di soluzione di DNasi (10 U/mL) in tampone 10 mM MgCl₂ (pH 7,5) per 1 ora a 37 °C sotto agitazione costante a 100 giri/min.
   4. Continuare con un lavaggio prolungato con dH₂O sterile per 3 giorni agitando costantemente a 100 giri/min, con reintegro della soluzione ogni 24 ore.
   5. Eseguire la liofilizzazione e la criomacinazione come segue²⁰: Congelare i campioni dECM umidi a -80 °C per 24 ore. Trasferire i campioni congelati in un liofilizzatore e operare in modalità di essiccazione sotto vuoto per 3 o 4 giorni fino a completa essiccazione. Al termine della liofilizzazione, eseguire la macinazione dei campioni in una forma di polvere fine utilizzando un apparecchio di macinazione e ghiaccio secco.
      NOTA: Questo stato di polvere fine è ritenuto necessario a causa delle sue proprietà di solubilità migliorate durante le fasi successive del processo di digestione.
2. Metodo Triton-X-100
   1. Preparare i campioni di tessuto in base al passaggio 1. Trattare i tessuti polmonari con Triton-X-100 all'1% per 3 giorni in leggera rotazione a 4 °C. Sostituzione della soluzione ogni 24 ore.
   2. Incubare i campioni con soluzione di DNasi (10U/mL) in tampone 10 mM MgCl₂ (pH 7,5) per 1 ora a 37 °C sotto agitazione costante.
   3. Proseguire con un lavaggio approfondito con dH₂O sterile per 3 giorni a rotazione delicata, con reintegro della soluzione ogni 24 ore.
   4. Eseguire la liofilizzazione seguita dalla crio-macinazione come descritto al punto 2.1.

3. Digestione della pepsina

1. Digerire campioni di dECM in polvere a una concentrazione di 15 mg/mL (p/v) in soluzione di pepsina (1 mg/mL di pepsina in HCl 0,01 M, pH 2). Eseguire il processo di digestione del campione a temperatura ambiente agitando costantemente per 48 ore e mantenere frequentemente il pH della soluzione per una digestione efficace.
2. Trasferire i digestati in una provetta e centrifugare a 5000 x g per 10 min.
3. Raccogliere il surnatante e neutralizzarlo e tamponarlo in condizioni fisiologiche (pH 7, 1x soluzione salina tampone fosfato (PBS)) attraverso l'aggiunta di 5M NaOH e 10x PBS.
   NOTA: Si consiglia di utilizzare soluzioni alcaline concentrate per la regolazione del pH del digestato acido, in quanto questo approccio evita un'espansione di volume indesiderata che potrebbe influire negativamente sulla gelificazione nelle fasi successive.
4. Conservare i digestati pre-gel a −20 °C per ulteriori studi.

4. Colorazione istologica

1. Fissare una piccola porzione (5^mm3) di campione di tessuto decellularizzato in 1 mL di soluzione di formaldeide al 3,7% a 4 °C per una notte.
2. Incubare i tessuti in provette contenenti 1 ml di soluzione di saccarosio al 30% in PBS per 12 ore a 4 °C su roccia stabile.
3. Per incorporare i tessuti nel composto a temperatura di taglio ottimale (OCT), versare 1 mL di OCT in un criostampo, posizionare il tessuto al centro del criostampo, quindi versare 2 ml di OCT sopra il tessuto.
4. Posizionare i criostampi contenenti tessuti su ghiaccio secco e congelare a scatto utilizzando azoto liquido. I campioni sono pronti quando l'OCT diventa tutto bianco, il che di solito richiede 3 minuti. Conservare i fazzoletti OCT a -20 °C fino all'uso.
5. Ottenere sezioni di 10 μm nel criostato a -25 °C su un vetrino rivestito di poli-L-lisina e trasferire il vetrino a temperatura ambiente per consentire alla sezione di tessuto di fondersi sul vetrino. Conservare i vetrini a -20 °C fino all'utilizzo.
6. Per confermare l'assenza di nuclei dopo la decellularizzazione, eseguire una colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) come descritto di seguito.
   1. Incubare i vetrini a temperatura ambiente per 10 min. Immergere i vetrini in PBS e colorarli con 50 ml di soluzione di ematossilina pronta all'uso in un barattolo colorante per 3 minuti, seguita da un lavaggio di 3 minuti con acqua di rubinetto.
   2. Immergere i vetrini in etanolo al 95% e colorare con 50 ml di soluzione alcolica di eosina allo 0,5% in un barattolo colorante per 45 secondi.
7. Eseguire la colorazione rosso Sirius per mostrare la ritenzione del contenuto di collagene dopo la decellularizzazione.
   1. Idratare i vetrini con PBS e immergerli in 50 ml di rosso Sirio allo 0,1% in una soluzione acquosa satura di acido picrico in un barattolo colorante per 1 ora.
   2. Sciacquare i vetrini in una soluzione di acido acetico allo 0,5% per 5 secondi e disidratare tutti i vetrini immergendoli in etanolo al 70%, 95% e 100% in sequenza per 1 minuto ciascuno.
8. Per analizzare il contenuto di sGAG nei campioni di tessuto, eseguire la colorazione blu Alcian come descritto di seguito.
   1. Immergere i vetrini in 50 ml di blu di Alcian all'1% in una soluzione di acido acetico al 3% (pH 2,5) in un barattolo colorante per 30 minuti. Lavare i vetrini con acqua corrente del rubinetto per 2 min.
   2. Disidratare tutti i vetrini immergendoli in etanolo al 70%, 95% e 100% in sequenza per 1 minuto ciascuno.
9. Aggiungere 0,1 mL di terreno di montaggio sopra i campioni e visualizzare utilizzando la microscopia ottica con ingrandimento 10x.

5. Caratterizzazione meccanica

1. Implementare misure reologiche oscillatorie utilizzando un reometro con geometria a piastre parallele.
2. Versare 250 μL di soluzione pre-gel mantenuta in ghiaccio su una piastra inferiore preraffreddata (4 °C) per evitare una rapida gelificazione.
3. Abbassare la piastra parallela di 20 mm fino a quando la soluzione pre-gel forma un disco con una distanza di 1 mm tra le due piastre.
4. Avviare immediatamente la misurazione. Misurare i moduli di stoccaggio e perdita nel tempo con una frequenza e una deformazione fisse mentre si riscalda la piastra inferiore a 37 °C per 30 minuti per osservare la cinetica di gelificazione. Utilizzare una frequenza fissa di 0,5 Hz e una deformazione dello 0,1%.
5. Eseguire un test di recupero dello scorrimento dopo che il valore del modulo di memorizzazione smette di aumentare e raggiunge un plateau.
6. Applicare una sollecitazione di taglio di 1 Pa all'idrogel per 15 minuti, misurare la deformazione, scaricare il campione dalla sollecitazione e registrare la variazione del valore di deformazione per 15 minuti.
7. Disegna un grafico della tensione in funzione del tempo per mostrare il comportamento di rilassamento dello stress. Ripetere le misurazioni per tre diversi digest dECM come repliche.

Risultati

Decellularizzazione
La decellularizzazione del tessuto polmonare bovino per produrre idrogel dECM che ricapitolerebbero il microambiente polmonare nativo è stata ottenuta sia con metodi fisici (congelamento-disgelo) che chimici (Triton-X-100). Dopo la dissezione, i pezzi di tessuto sono stati lavati in antibiotici contenenti dH₂O per rimuovere gli agenti patogeni che possono successivamente influenzare la sterilità degli idrogel dECM. Un totale di cinque cicli alternati tra azoto liquido ...

Discussione

Gli idrogel derivati da organi sono diventati modelli promettenti che ricapitolano l'ECM tissutale nativa e imitano la funzione cellulare organotipica. Sebbene l'ECM polmonare decellularizzata sia stata spesso utilizzata nell'ingegneria tissutale, una caratterizzazione approfondita della composizione del biomateriale e delle proprietà meccaniche favorirà una migliore comprensione di come le interazioni cellula-ECM possono essere modulate per modellare i processi biologici durante l'omeostasi o la malattia. In particola...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	ISOLAB	64-17-5
Acetic acid	ISOLAB	64-19-7
Alcian blue solution	Sigma-Aldrich	B8438
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Discovery HR-2 rheometer	TA Instruments
Entellan mounting medium	Merck	107960
Eosin solution	Bright-slide	2.BS01-105-1000
Formaldehyde	Electron Microscopy Sciences	50-980-485
Hydrochloric acid	Merck	100317
Iodine	Sigma-Aldrich	3002
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	7786-30-3
Mayer's haematoxylin staining solution	Merck	2.BS01-103-1000
O.C.T compound	Tissue-Tek	4583
Penicillin/Streptomycin	Biowest	L0018-100
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma-Aldrich	P6887
Picric acid	Polysciences	88-89-1
Sirius Red	Polysciences	09400-25
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Triton-X-100	Merck	112298