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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo articolo descrive un protocollo per l'estrazione del DNA delle diatomee utilizzando un kit di estrazione del DNA comune modificato.

Abstract

Il test delle diatomee è un mezzo ausiliario essenziale nella pratica forense per determinare se il cadavere è annegato in acqua e per dedurre il luogo dell'annegamento. Il test delle diatomee è anche un importante contenuto di ricerca nel campo dell'ambiente e del plancton. La tecnologia di analisi della biologia molecolare delle diatomee, che si concentra sul DNA delle diatomee come oggetto di ricerca primario, è un nuovo metodo di test delle diatomee. L'estrazione del DNA delle diatomee è alla base dei test molecolari delle diatomee. Attualmente, i kit comunemente usati per l'estrazione del DNA delle diatomee sono costosi, il che aumenta il costo della ricerca correlata. Il nostro laboratorio ha migliorato il kit generale di estrazione rapida del DNA genomico del sangue intero e ha ottenuto un effetto soddisfacente di estrazione del DNA delle diatomee, fornendo così una soluzione alternativa economica e conveniente per l'estrazione del DNA basata su perle di vetro per la ricerca correlata. Il DNA di diatomee estratto utilizzando questo protocollo potrebbe soddisfare molte applicazioni a valle, come la PCR e il sequenziamento.

Introduzione

Nella pratica forense, determinare se un cadavere trovato in acqua annegava o è stato gettato in acqua dopo la morte è essenziale per la corretta risoluzione del caso1. È anche una delle questioni difficili che devono essere risolte con urgenza nella pratica forense2. Le diatomee sono abbondanti nell'ambiente naturale (soprattutto nell'acqua)3,4. Nel processo di annegamento, a causa dell'ipossia e della risposta allo stress, le persone avranno intensi movimenti respiratori e inaleranno una grande quantità di liquido di annegamento. Pertanto, le diatomee nell'acqua entrano nel polmone con il liquido di annegamento e alcune diatomee possono entrare nella circolazione sanguigna attraverso la barriera alveolare-capillare e diffondersi agli organi interni con il flusso sanguigno 5,6. Il rilevamento di diatomee nei tessuti interni e negli organi come il polmone, il fegato e il midollo osseo è una forte evidenza di annegamento prima della morte 7,8. Attualmente, l'analisi forense delle diatomee si basa principalmente su metodi di analisi morfologici. Dopo una serie di pre-digestioni del tessuto, vengono effettuate al microscopio le stime morfologiche qualitative e quantitative delle diatomee non digerite. Durante questo periodo, è necessario utilizzare reagenti pericolosi e dannosi per l'ambiente come l'acido nitrico. Questo processo richiede molto tempo e richiede ai ricercatori una solida competenza tassonomica e una vasta esperienza. Tutto ciò comporta alcune sfide per il personale forense9. La tecnologia di test del DNA delle diatomee è una nuova tecnologia per il test delle diatomee sviluppata negli ultimi anni 10,11,12. Questa tecnologia realizza l'identificazione delle specie delle diatomee analizzando la composizione specifica della sequenza di DNA delle diatomee13,14. La tecnologia PCR e la tecnologia di sequenziamento sono metodi tecnici comunemente usati, ma la loro base è l'estrazione di successo del DNA dalle diatomee. Tuttavia, le diatomee hanno una struttura speciale diversa da quella di altri organismi, rendendo diverse anche le loro tecniche di estrazione del DNA.

La parete cellulare della diatomea ha un alto grado di silicizzazione e il suo componente principale è il biossido di silicio 15,16,17. La parete cellulare silicea è molto dura e deve essere distrutta prima di estrarre il DNA. I normali kit di estrazione del DNA sono spesso difficili da utilizzare direttamente per l'estrazione del DNA delle diatomee perché non possono distruggere il guscio siliceo delle diatomee18. Pertanto, la distruzione del guscio siliceo delle diatomee è uno dei principali problemi tecnici da risolvere nell'estrazione del DNA delle diatomee.

Allo stesso tempo, poiché il numero di diatomee contenute nei campioni di ricerca forense, che si tratti di campioni d'acqua o di organi e tessuti di corpi annegati, è spesso limitato, è necessario arricchire le diatomee. L'essenza dell'arricchimento è la separazione delle sostanze. Mentre si cerca di raccogliere le diatomee, ridurre al minimo il contenuto di altri componenti materiali (componenti interferenti). Nel lavoro forense, i laboratori utilizzano spesso metodi di arricchimento della centrifugazione o della filtrazione a membrana per separare le cellule delle diatomee19. Tuttavia, poiché le apparecchiature di pompaggio del vuoto non sono ampiamente utilizzate, il metodo di arricchimento della membrana non viene spesso utilizzato nei normali laboratori forensi primari. Quindi, il metodo di centrifugazione è ancora comunemente l'arricchimento di diatomee nei laboratori forensi20.

L'estrazione del DNA dalle diatomee è attualmente utilizzata principalmente nella pratica forense e ci sono limitazioni significative alla sua applicazione. Attualmente, ci sono pochi kit di estrazione del DNA di diatomee utilizzati nella scienza forense sul mercato e sono generalmente costosi21. Questo articolo fornisce un metodo di estrazione del DNA delle diatomee migliorato, rendendo l'estrazione del DNA delle diatomee semplice, conveniente ed economica. Ciò aumenta l'applicazione dei successivi test di biologia molecolare delle diatomee e può risolvere meglio i problemi legati all'annegamento in medicina legale attraverso il test delle diatomee. Questo metodo rompe le pareti cellulari silicee delle diatomee aggiungendo perle di vetro e impostando un tempo appropriato per il vortice. In questo modo, la proteinasi K e la soluzione di legame lisano rapidamente le cellule e inattivano vari enzimi nelle cellule. Il DNA genomico viene assorbito nella membrana della matrice nella colonna di adsorbimento e infine eluito dal tampone di eluizione. Un kit di estrazione genica del sangue intero così migliorato migliora l'effetto di estrazione del DNA delle diatomee del kit di sangue nei materiali di esame forense, riduce il costo dell'estrazione del DNA delle diatomee nella pratica forense e può essere applicato meglio alla ricerca forense di base.

Protocollo

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Università di Medicina di Hainan. I campioni di tessuto utilizzati in questo studio non sono considerati studi che coinvolgono soggetti umani. Questi campioni sono stati ottenuti ai fini della diagnosi patologica forense e il resto è stato utilizzato per l'estrazione del DNA delle diatomee in questo esperimento. I ricercatori non sono in grado di identificare prontamente gli individui per ottenere il consenso informato dalle parti interessate.

NOTA: Per garantire l'applicabilità generale del metodo di ricerca riportato in questo esperimento, questo esperimento ha sostanzialmente seguito le istruzioni operative del kit utilizzato, e solo alcuni passaggi sono stati modificati. I campioni d'acqua utilizzati in questo esperimento sono stati prelevati in modo casuale da stagni vicino al laboratorio (Figura supplementare 1A). In questo esperimento, il tessuto polmonare del corpo annegato è stato confermato come il tessuto di ricerca per dimostrare il protocollo di estrazione (Figura supplementare 1B). Nella pratica forense, a volte è anche necessario utilizzare altri organi e tessuti di corpi annegati (come fegato, milza, rene, midollo osseo, ecc.) per estrarre il DNA delle diatomee, il che richiede piccoli miglioramenti corrispondenti a questo metodo sperimentale, che saranno spiegati nella sezione corrispondente dell'esperimento. I campioni di tessuto polmonare utilizzati in questo esperimento provenivano da cadaveri che erano stati chiaramente annegati in casi forensi. Sono stati condotti test morfologici per dimostrare che il tessuto polmonare contiene diatomee (Figura 2 supplementare).

1. Pretrattamento dei campioni

  1. Pretrattamento dei campioni d'acqua
    1. Prelevare 10 ml di campione d'acqua nella provetta da centrifuga e centrifugare a 13.400 x g per 5 minuti. Scartare con cautela 9,8 mL di surnatante con una pistola a pipetta e trasferire circa 200 μL di campione di acqua di diatomee arricchita rimasto sul fondo in una provetta da centrifuga da 2 mL.
      NOTA: Il pre-esperimento può essere eseguito prima e la quantità iniziale può essere aumentata se un campione di acqua da 10 ml non è sufficiente per l'arricchimento.
  2. Pretrattamento di campioni di tessuto
    1. Prelevare 0,5 g di tessuto del margine polmonare dal corpo annegato, tritare o macinare completamente il tessuto polmonare fino a quando non diventa fangoso. Prevenire la contaminazione delle diatomee esogene è il fulcro di questa fase. Taglia ripetutamente il tessuto a pezzi usando le forbici.

2. Estrazione del DNA

NOTA: Tutte le fasi di centrifugazione vengono completate a temperatura ambiente. Utilizzando una centrifuga da tavolo con una forza centrifuga di 14.500 x g; prima dell'inizio dell'esperimento è necessario preparare un bagno d'acqua (o un bagno metallico) preriscaldato a 70 °C. Tutte le fasi devono seguire rigorosamente i principi del funzionamento asettico.

  1. Assemblaggio di campioni d'acqua e tessuti
    NOTA: Il campione d'acqua e il metodo di estrazione del DNA delle diatomee tissutali sono gli stessi.
    1. Aggiungere le perle di vetro a una provetta da centrifuga da 2 mL contenente il campione di acqua pretrattata. Invertire 10x-15x per mescolare bene. Le perle di vetro aggiunte sono composte da perle di vetro grandi e piccole mescolate in un rapporto di massa di 1:1. Il diametro delle perle di vetro grandi è di 1,5-2,0 mm e quello delle perle di vetro piccole è di 0,4-0,6 mm.
    2. Prelevare 0,5 g di tessuto tritato finemente, aggiungere le perle di vetro in una provetta da centrifuga da 2 mL contenente il tessuto come descritto sopra. Invertire 10x-15x per mescolare.
  2. Aggiungere 40 μL di proteinasi K (20 mg/mL) alle provette. Mettere a temperatura ambiente per 15 minuti, durante questo periodo, capovolgere e mescolare 10 volte ogni 3 minuti.
    NOTA: Se il tessuto non è completamente digerito, la quantità di proteinasi K può essere opportunamente aumentata fino a quando la soluzione non diventa limpida.
  3. Aggiungere 200 μL di tampone di legame alle provette da centrifuga, vorticare immediatamente e mescolare per 4 minuti (frequenza di miscelazione dell'oscillazione: 3000 giri/min).
    NOTA: In questa fase, l'intensità e il tempo di agitazione devono essere rigorosamente controllati per garantire un'intensità e un tempo di miscelazione sufficienti.
  4. Mettere le provette da centrifuga a bagnomaria a 70 °C per 10 minuti e la soluzione diventa limpida.
  5. Aggiungere 100 μL di isopropanolo alle provette da centrifuga, vorticare e mescolare per 15 s, in questo momento potrebbe apparire una precipitazione flocculante.
    NOTA: È molto importante mescolare bene con la forza appropriata nelle fasi operative di cui sopra, ma l'agitazione vigorosa dovrebbe essere evitata per prevenire il taglio del DNA.
  6. Mettere la soluzione ottenuta nella fase precedente insieme al precipitato flocculante nella colonna di adsorbimento (la colonna di adsorbimento è posta nella provetta di raccolta). La lunghezza della colonna di adsorbimento è di 3,0 cm, il diametro è di 1,0 cm e la matrice di adsorbimento è una membrana a matrice di silicio.
  7. Centrifugare a 8.000 x g per 30 s, scartare il liquido di scarto nella provetta di raccolta e reinserire la colonna di adsorbimento nella provetta di raccolta.
  8. Aggiungere 500 μL di tampone per la rimozione dell'inibitore alla colonna di adsorbimento. Centrifugare a 13.400 x g per 30 s ed eliminare il liquido di scarto nella provetta di raccolta.
  9. Aggiungere 700 μL di tampone di lavaggio alla colonna di adsorbimento. Centrifugare a 13.400 x g per 30 s ed eliminare il liquido di scarto nella provetta di raccolta.
    NOTA: Aggiungere la quantità specificata di etanolo assoluto al flacone tampone di lavaggio prima del primo utilizzo.
  10. Aggiungere 500 μL di tampone di lavaggio alla colonna di adsorbimento. Centrifugare a 13.400 x g per 30 s ed eliminare il liquido di scarto nella provetta di raccolta.
  11. Rimettere la colonna di adsorbimento nella provetta di raccolta vuota. Centrifugare a 14.500 x g per 2 minuti e rimuovere il più possibile il tampone di lavaggio, per evitare che l'etanolo residuo nel tampone di lavaggio inibisca le reazioni a valle.
  12. Estrarre la colonna di adsorbimento e inserirla in una provetta da centrifuga pulita. Aggiungere 100 μL di tampone di eluizione alla parte centrale della membrana di adsorbimento.
  13. Posizionare la colonna di adsorbimento a temperatura ambiente per 3-5 minuti e centrifugare a 13.400 x g per 1 minuto.
  14. Aggiungere nuovamente la soluzione ottenuta nel passaggio precedente alla colonna di adsorbimento centrifugo. Posizionare la colonna di adsorbimento centrifugo a temperatura ambiente per 2 minuti e centrifugare a 13.400 x g per 1 minuto.
    NOTA: Il tampone di eluizione deve essere preriscaldato a bagnomaria a 70 °C per circa 10 minuti. Il volume di eluizione non deve essere inferiore a 50 μL; in caso contrario, la resa del DNA sarà ridotta.
  15. Conservare il DNA di diatomee estratto a 2-8 °C per un uso futuro. Se la soluzione di DNA deve essere conservata per lungo tempo, conservarla a -20 °C.

3. Test PCR

NOTA: Poiché il contenuto di diatomee nei campioni forensi è spesso basso, gli estratti di campioni di tessuto dei corpi annegati possono anche contenere vari gradi di tessuto e organi (come i polmoni in questo esperimento) con il proprio DNA. Pertanto, il rilevamento diretto del DNA totale negli estratti di DNA non riflette la situazione dell'estrazione del DNA delle diatomee. In questo esperimento, sono stati selezionati primer specifici per le diatomee e sono stati utilizzati prodotti PCR per valutare l'estrazione del DNA delle diatomee nell'estratto. I prodotti possono essere osservati e analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio e possono anche essere analizzati mediante curva di fusione PCR quantitativa fluorescente in tempo reale, che ha una maggiore sensibilità.

  1. Aggiungere 2 μL di DNA estratto da campioni d'acqua e tessuti come stampo. Scegliere uno dei due metodi seguenti per l'ispezione.
  2. Test PCR convenzionale
    1. Utilizzare primer22 in grado di amplificare in modo specifico i frammenti di rDNA della diatomea 18S. Per i dettagli, vedere la Tabella 1.
    2. Stabilire il sistema di reazione PCR e le condizioni di amplificazione in base alle caratteristiche dei primer. Per i dettagli, vedere la tabella 2.
    3. Eseguire i prodotti di amplificazione PCR su gel di agarosio al 2%. Osservare e analizzare l'imaging con un gel imager.
  3. Test PCR quantitativo fluorescente
    1. Utilizzare i primer di cui sopra in grado di amplificare in modo specifico i frammenti di rDNA della diatomea 18S per preparare un sistema di reazione di PCR quantitativa fluorescente in tempo reale. Per i dettagli, vedere la tabella 3.
    2. Eseguire l'amplificazione PCR e analizzare la curva di amplificazione ottenuta e i valori di Ct. Allo stesso tempo, impostare un programma, fondere gradualmente i doppi filamenti dei prodotti amplificati in singoli filamenti attraverso la tecnologia della curva di fusione PCR quantitativa fluorescente, quindi analizzare le curve di fusione ottenute.

Risultati

Poiché la soluzione di DNA estratta con il metodo di estrazione del DNA attualmente utilizzato contiene tutti i componenti del DNA provenienti da diverse fonti nel campione, il DNA ottenuto con questo protocollo non ha fatto eccezione. Quindi, la soluzione del DNA non era solo una soluzione del DNA genomico delle diatomee. I primer in grado di amplificare in modo specifico i frammenti di rDNA della diatomea 18S sono stati selezionati consultando la letteratura 22,23,24.

Discussione

Le cellule di diatomee sono protette da pareti cellulari silicee dure17 e questa struttura deve essere distrutta per estrarre il DNA delle diatomee. I kit ordinari non distruggono facilmente il guscio siliceo delle diatomee; quindi è difficile estrarre con successo il DNA21 delle diatomee. Il nostro laboratorio ha migliorato il kit di estrazione del DNA sanguigno più comunemente usato, aggiungendo perle di vetro di diversi diametri e diversi rapporti di massa nel processo...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Riconoscimenti

Questo lavoro è supportato dalla National Natural Science Foundation of China (82060341,81560304) e dall'Academician Innovation Platform Scientific Research Project della provincia di Hainan (YSPTZX202134).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Binding BufferBioTekeB010006022rapidly lysing cells
ChemoHS qPCR MixMonad00007547-120506qPCR Mix
D2000 DNA ladderReal-Times(Beijing) BiotechnologyRTM415Measure the position of electrophoretic bands
D512Taihe BiotechnologyTW21109196forword primer
D978Taihe BiotechnologyTW21109197reverse primer
Elution bufferBioTekeB010006022A low-salt elution buffer washes off the DNA
Glass beadYingxu Chemical Machinery(Shanghai) 70181000Special glass beads for dispersing and grinding
Import adsorption columnBioTekeB2008006022Adsorption column with silica matrix membrane
Inhibitor Removal BufferBioTekeB010006022Removal of Inhibitors in DNA Extraction
IsopropanolBioTekeB010006022Precipitate or isolate DNA
MIX-30S Mini MixerMiulabMUC881206oscillatory action
Proteinase KBioTekeB010006022Inactivation of intracellular nucleases and other proteins
Rotor-Gene Q 5plex HRMQiagenR1116175real-time fluorescence quantification PCR
Speed Micro-CentrifugeScilogex9013001121centrifuge
Tanon 3500R Gel ImagerTanon16T5553R-455gel imaging
Taq Mix ProMonad00007808-140534PCR Mix
Thermo CyclerZhuhai HemaVRB020Aordinary PCR
Wash BufferBioTekeB010006022Remove impurities such as cell metabolites

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