Modello murino di espianto dell'arto posteriore per lo studio della meccanobiologia del conflitto del tendine d'Achille

Riepilogo

Presentiamo una piattaforma sperimentale personalizzata e un protocollo di coltura tissutale che ricrea il cambiamento fibrocartilagineo guidato dall'impingement dell'inserzione del tendine d'Achille in espianti murini dell'arto posteriore con vitalità cellulare sostenuta, fornendo un modello adatto per esplorare la meccanobiologia dell'impingement tendineo.

Abstract

L'impingement del tendine sull'osso genera un ambiente di deformazione meccanica multiassiale con deformazione compressiva trasversale marcatamente elevata, che suscita un fenotipo localizzato della fibrocartilagine caratterizzato dall'accumulo di matrice ricca di glicosaminoglicani (GAG) e dal rimodellamento della rete di collagene. Mentre la fibrocartilagine è una caratteristica normale nelle regioni colpite dei tendini sani, l'eccesso di deposizione di GAG e la disorganizzazione della rete di collagene sono caratteristiche distintive della tendinopatia. Di conseguenza, l'impingement è clinicamente riconosciuto come un importante fattore estrinseco nell'inizio e nella progressione della tendinopatia. Ciononostante, la meccanobiologia alla base dell'impingement tendineo rimane poco studiata. Gli sforzi precedenti per chiarire la risposta cellulare all'impingement tendineo hanno applicato la compressione uniassiale alle cellule e asportato espianti tendinei in vitro. Tuttavia, le cellule isolate mancano di un ambiente extracellulare tridimensionale cruciale per la meccanorisposta, e sia gli studi in vitro che quelli sull'espianto asportato non riescono a ricapitolare l'ambiente di deformazione multiassiale generato dall'impingement tendineo in vivo, che dipende dalle caratteristiche anatomiche della regione impattata. Inoltre, i modelli in vivo di impingement tendineo mancano di controllo sull'ambiente di deformazione meccanica. Per superare queste limitazioni, presentiamo un nuovo modello murino di espianto dell'arto posteriore adatto allo studio della meccanobiologia dell'impingement del tendine d'Achille. Questo modello mantiene il tendine d'Achille in situ per preservare l'anatomia locale e riproduce l'ambiente di deformazione multiassiale generato dall'impatto dell'inserzione del tendine d'Achille sul calcagno durante la flessione dorsale della caviglia applicata passivamente, mantenendo le cellule all'interno del loro ambiente nativo. Descriviamo un protocollo di coltura tissutale parte integrante di questo modello e presentiamo i dati che stabiliscono la vitalità dell'espianto sostenuta per 7 giorni. I risultati rappresentativi dimostrano una migliore colorazione istologica del GAG e una diminuzione dell'allineamento delle fibre di collagene secondarie al impingement, suggerendo un'elevata formazione di fibrocartilagine. Questo modello può essere facilmente adattato per studiare diversi regimi di carico meccanico e consente la manipolazione di percorsi molecolari di interesse per identificare i meccanismi che mediano il cambiamento fenotipico nel tendine d'Achille in risposta all'impingement.

Introduzione

Una moltitudine di tendini, tra cui il tendine d'Achille e i tendini della cuffia dei rotatori, subiscono un conflitto osseo a causa del normale posizionamento anatomico^1,2,3,4. L'impingement tendineo genera una deformazione di compressione diretta trasversalmente all'asse longitudinale della fibra^5,6,7. Le regioni di conflitto tendineo dimostrano un fenotipo unico della fibrocartilagine in cui le cellule rotonde e rimpicciolite (fibrocondrociti) so....

Protocollo

Tutto il lavoro sugli animali è stato approvato dal Comitato per le risorse animali dell'Università di Rochester.

1. Preparazione dei terreni di coltura tissutale

1. Coltivare tutti gli espianti in Modified Eagle Medium di Dulbecco (1x DMEM) con penicillina-streptomicina all'1% v/v e acido L-ascorbico 200 μM in un incubatore a 37 °C e 5% di CO₂ . Per il pretrattamento iniziale di 48 ore, coltura di ciascun espianto in 70 mL di terreno di coltura integrato con 100 nM di desametasone⁷⁴. Dopo il pretrattamento, coltivare gli arti per altri 7 giorni senza desametasone, cambiando terreno....

Discussione

La piattaforma sperimentale di espianto dell'arto posteriore murino abbinata al protocollo di coltura tissutale descritto in questo studio fornisce un modello adatto per studiare la meccanobiologia della formazione di fibrocartilagine guidata dal conflitto all'inserzione del tendine d'Achille. L'utilità di questo modello di espianto è dimostrata dai risultati rappresentativi, che indicano il mantenimento della vitalità cellulare in concomitanza con un cambiamento significativo e spazialmente eterogeneo nella colorazio.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent underpads	VWR	82020-845	For benchtop dissection
Acrylic bath	Source One	X001G46CB1	Contains the explant platform submerged in culture media
Autoclave bin	Thermo Scientific	13-361-20	Used as secondary containment, holds two platforms
Base	-	-	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Braided line	KastKing	30lb test	Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion
Clip	-	-	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Cover glass	Fisherbrand	12-541-034	Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm
Cytoseal XYL	VWR	8312-4	Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections
Dexamethasone	MP Biomedical LLC	194561	CAS#50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous	Invitrogen by ThermoFisher	D12345	CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions
Double-sided tape	Scotch Brand	34-8724-5195-9	To attach sandpaper to Grip platens
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM)	Gibco by ThermoFisher	11965092	high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine
EDTA tetrasodium salt dihydrate	Thermo Scientific Chemicals	J15700.A1	CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation
Ethanol, 200 proof	Thermo Scientific	T038181000	CAS#64-17-5, 1 L supply
Foam biopsy pads	Leica	3801000	Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification
Forceps, #SS Standard Inox	Dumont	11203-23	Straight, smooth, fine tips
Forceps, Micro-Adson 4.75"	Fisherbrand	13-820-073	Straight, fine tips with serrated teeth
Garnet Sandpaper, 50-D Grit	Norton	M600060 01518	Or other coarse grit sandpaper
Glacial acetic acid	Fisher Chemical	A38S-500	CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution
Grips	ADMET	GV-100NT-A4	Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included
Histobond Adhesive Microscope Slides	VWR	16005-108	Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols
In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red	Roche	12156792910	TUNEL assay
Labeling tape	Fisherbrand	15-959	Or any other labeling tape of preference
L-ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544-100G	CAS#50-81-7, for culture media formulation
Neutral buffered formalin, 10%	Leica	3800600	For sample fixation, 5 gallon supply
Nunc petri dishes	Sigma-Aldrich	P7741-1CS	100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol
Penicillin-streptomycin (100X)	Gibco by ThermoFisher	15140122	Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration
Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament	Hatchbox	-	Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.
Processing cassettes	Leica	3802631	For fixation, decalcification and paraffin embedding
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI	Invitrogen by ThermoFisher	P36931	Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL
Proteinase K	Fisher BioReagents	BP1700-50	CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol
Scissors, Fine	FST	14094-11	Straight, sharp
Slide Staining Set, 12-place	Mercedes Scientific	MER 1011	Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology
Sodium acetate, anhydrous	Thermo Scientific Chemicals	A1318430	CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades	VWR	25608-964	For paraffin sectioning
Toluidine Blue O	Thermo Scientific Chemicals	348601000	CAS#92-31-9
Volume Reduction Insert	-	-	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Xylenes	Leica	3803665	4 gallon supply for histological staining