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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Gli studi strutturali e biochimici dei trasportatori di membrana umani richiedono quantità di milligrammi di proteine stabili, intatte e omogenee. Qui descriviamo metodi scalabili per lo screening, l'espressione e la purificazione di trasportatori di soluti umani utilizzando geni ottimizzati per i codoni.

Abstract

I trasportatori di soluti (SLC) sono trasportatori di membrana che importano ed esportano una serie di substrati endogeni ed esogeni, tra cui ioni, nutrienti, metaboliti, neurotrasmettitori e prodotti farmaceutici. Nonostante sia emerso come interessanti bersagli terapeutici e marcatori di malattia, questo gruppo di proteine è ancora relativamente poco drogato dai farmaci attuali. I progetti di scoperta di farmaci per questi trasportatori sono ostacolati da limitate conoscenze strutturali, funzionali e fisiologiche, in ultima analisi a causa delle difficoltà nell'espressione e nella purificazione di questa classe di proteine incorporate nella membrana. Qui, dimostriamo i metodi per ottenere quantità di milligrammi ad alta purezza di proteine trasportatrici SLC umane utilizzando sequenze geniche ottimizzate per il codone. In combinazione con un'esplorazione sistematica della progettazione dei costrutti e dell'espressione ad alto rendimento, questi protocolli garantiscono la conservazione dell'integrità strutturale e dell'attività biochimica delle proteine bersaglio. Evidenziamo anche i passaggi critici nell'espressione delle cellule eucariotiche, nella purificazione dell'affinità e nella cromatografia ad esclusione dimensionale di queste proteine. In definitiva, questo flusso di lavoro produce preparazioni proteiche pure, funzionalmente attive e stabili adatte per la determinazione della struttura ad alta risoluzione, studi di trasporto, saggi di coinvolgimento di piccole molecole e screening in vitro ad alto rendimento.

Introduzione

Le proteine di membrana sono state a lungo bersagli sia per i ricercatori che per le industrie farmaceutiche. Di questi, i trasportatori di soluti (SLC) sono una famiglia di oltre 400 geni trasportatori secondari codificati all'interno del genoma umano1. Questi trasportatori sono coinvolti nell'importazione e nell'esportazione di numerose molecole, tra cui ioni2, neurotrasmettitori3, lipidi 4,5,6,7, amminoacidi 8, nutrienti 9,10,11 e prodotti farmaceutici 12. Con una tale ampiezza di substrati, queste proteine sono anche implicate in una serie di fisiopatologie attraverso il trasporto di tossine13, il trasporto e l'inibizione da parte di droghe d'abuso 14,15 o mutazioni deleterie16. Gli omologhi batterici sono serviti come prototipi per il meccanismo di trasporto fondamentale di diverse famiglie di SLC 17,18,19,20,21,22,23,24,25. A differenza delle proteine umane, gli ortologhi procariotici sono spesso meglio espressi nel ben noto sistema di espressione di Escherichia coli 26,27 e sono più stabili nei detergenti più piccoli che producono cristalli ben ordinati per la cristallografia a raggi X28. Tuttavia, le differenze di sequenza e funzionali complicano l'uso di queste proteine lontanamente correlate per la scoperta di farmaci29,30. Di conseguenza, lo studio diretto della proteina umana è spesso necessario per decifrare il meccanismo d'azione dei farmaci che hanno come bersaglio le SLC 31,32,33,34,35. Mentre i recenti progressi nella microscopia crioelettronica (Cryo-EM) hanno permesso la caratterizzazione strutturale delle SLC in condizioni più simili a quelle native36,37, la difficoltà nell'esprimere e purificare queste proteine rimane una sfida per lo sviluppo di terapie e diagnostica mirate.

Per alleviare questa sfida, il consorzio RESOLUTE (re-solute.eu) ha sviluppato risorse e protocolli per l'espressione e la purificazione su larga scala delle proteine umane della famiglia SLC38. Partendo da geni ottimizzati per i codoni, abbiamo sviluppato metodi per il clonaggio e lo screening ad alto rendimento di costrutti SLC. Questi metodi sono stati sistematicamente applicati all'intera famiglia di SLC, i geni sono stati clonati nel sistema di espressione virale BacMam e l'espressione proteica è stata testata in linee cellulari umane39 sulla base di metodi precedentemente descritti per il clonaggio ad alto rendimento e il test di espressione40. In sintesi, il gene SLC viene clonato dal plasmide pDONR221 in un vettore pHTBV1.1. Questo costrutto viene successivamente utilizzato per trasporre il gene di interesse in un vettore bacmide per la trasfezione di cellule di insetto, che include un promotore del citomegalovirus e un elemento enhancer per l'espressione nelle cellule di mammifero. Il baculovirus risultante può essere utilizzato per trasdurre cellule di mammifero per l'espressione della proteina SLC bersaglio.

Abbiamo inoltre sviluppato metodi standardizzati per l'espressione su larga scala e la purificazione stabile di SLC selezionati (Figura 1). Questo protocollo include più punti di controllo per facilitare la risoluzione dei problemi e ridurre al minimo la variabilità tra gli esperimenti. In particolare, il monitoraggio di routine dell'espressione e della localizzazione delle proteine, nonché l'ottimizzazione su piccola scala delle condizioni di purificazione per i singoli bersagli, sono stati aiutati dai tag Strep e Green Fluorescent Protein (GFP)41,42.

In definitiva, questi campioni proteici chimicamente puri e strutturalmente omogenei possono essere utilizzati per la determinazione strutturale mediante cristallografia a raggi X o microscopia crioelettronica (Cryo-EM), saggi biochimici di coinvolgimento del bersaglio, immunizzazione per la generazione di leganti e studi funzionali privi di cellule tramite ricostituzione in liposomi chimicamente definiti.

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Protocollo

NOTA: Tutti i geni RESOLUTE SLC ottimizzati per codone sono stati depositati in AddGene43, i cui link sono disponibili nell'elenco dei reagenti pubblici RESOLUTE44. Questi geni sono stati clonati nel plasmide pDONR221 e consentono la clonazione diretta dei geni nel vettore di destinazione utilizzando la clonazione di ricombinazione45. Per massimizzare il parallelismo, le cellule batteriche, di insetto e di mammifero vengono coltivate in formato blocco rispettivamente per la produzione di bacmid (sezione 3), l'amplificazione del baculovirus (sezione 5) e i test di espressione (sezione 6). Per queste fasi, è necessario un agitatore di microespressione per garantire una miscelazione e un'aerazione sufficienti.

1. Clonazione (ad alto rendimento) di SLC in pHTBV1.1 bacmid

NOTA: La fase di clonazione utilizza un protocollo di clonazione di ricombinazione per clonazione e trasformazione efficienti in Escherichia coli (E. coli) utilizzando il metodo dello shock termico46. Il protocollo è progettato per la clonazione parallela e ad alto throughput di più target o costrutti, ma può essere facilmente adattato a scale più piccole.

  1. In una piastra a 96 pozzetti, aggiungere 150 ng del clone SLC pDONR221 e 100 ng del vettore pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW. Portare il volume di reazione a 8 μL con 10 mM Tris pH 8.0, quindi aggiungere 2 μL della miscela di enzimi di ricombinazione.
  2. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora, aggiungere 1 μL di proteinasi K e incubare per 30 minuti a 37 °C.
  3. Utilizzare 4 μL della miscela di reazione per trasformare 50 μL di cellule MACH-1 di E. coli chimicamente competenti utilizzando il metodo dello shock termico46 e il mezzo SOC per il recupero. Piastra su LB-agar contenente il 5% di saccarosio, o agar SOC, integrato con 100 μg/mL di ampicillina.
  4. Identificare le colonie che ospitano il vettore pHTBV1.1 con l'inserto del gene SLC utilizzando primer appropriati (vedere Tabella 1) e protocolli standard per la PCR47 della colonia.
  5. Purificare il plasmide ricombinante da singole colonie con il gene di interesse utilizzando un kit di miniprep plasmidico.

2. Recepimento

NOTA: I seguenti passaggi vengono utilizzati per trasporre i geni SLC dal vettore pHTBV1.1 in un bacmide per la generazione di baculovirus BacMam nelle cellule Sf9. Utilizzando il metodo dello shock termico46, il vettore pHTBV1.1 viene trasformato in cellule di E. coli competenti per DH10Bac, che contengono un bacmide genitore con una fusione lacZ-mini-attTn7. La trasposizione avviene tra gli elementi del vettore pHTBV1.1 e il bacmide genitore in presenza delle proteine di trasposizione fornite da un plasmide helper48. Vedere la Tabella 2 per la composizione delle soluzioni utilizzate in questo protocollo.

  1. Utilizzando 3 μL di DNA vettoriale pHTBV1.1 purificato da 100-200 ng/μL, trasformare DH10Bac utilizzando il metodo dello shock termico in una piastra PCR a 96 pozzetti. Recuperare le cellule incubandole in terreno di recupero per 4-5 ore a 37 °C agitando a 700 giri/min in un agitatore di microespressione.
  2. Distribuire 50 μL di cellule trasformate su piastre di selezione DH10Bac. Incubare le piastre a 37 °C per 48 ore coperte con pellicola.
  3. Prelevare una singola colonia bianca (contenente il DNA ricombinante) e striare per diluire. Incubare a 37 °C per una notte.

3. Produzione di bacmid ad alto rendimento

NOTA: Il protocollo descrive i passaggi per l'estrazione dei bacmidi utilizzando un kit di purificazione bacmide a 96 pozzetti.

  1. Inoculare singole colonie bianche (isolate dalle piastre striate a quelle di diluizione) nei pozzetti di un blocco di 96 pozzetti, contenente 1 mL di terreno 2x LB (Tabella 2).
  2. Coprire con un sigillo poroso e incubare a 37 °C per una notte a 700 giri/min in un agitatore di microespressione.
  3. Preparare una scorta di glicerolo delle cellule mescolando 120 μL di coltura con 30 μL di glicerolo al 60% in una piastra per microtitolazione e conservare a -80 °C.
  4. Centrifugare il blocco a pozzetto profondo a 2.600 × g per 30 min. Travasare il surnatante in un contenitore adatto per la decontaminazione. Capovolgi il blocco e picchietta delicatamente su un tovagliolo di carta. Aggiungere 250 μL di soluzione 1 a ciascun pozzetto del blocco utilizzando una pipetta multicanale.
  5. Risospendere il pellet; Se necessario, utilizzare una pipetta multicanale.
  6. Aggiungere 250 μL di soluzione 2 a ciascun pozzetto e sigillare con un tappetino in silicone. Capovolgere delicatamente 5 volte e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Gira molto brevemente.
  7. Aggiungere 300 μL di soluzione 3 e sigillare con un tappetino in silicone. Mescolare delicatamente ma accuratamente invertendo 5 volte.
  8. Porre il campione su ghiaccio per 20 minuti, quindi centrifugare a 2.600 × g per 30 minuti a 4 °C.
  9. Trasferire il surnatante trasparente in un nuovo blocco da 96 pozzetti. Centrifugare nuovamente a 2.600 × g per 30 minuti a 4 °C.
  10. In un nuovo blocco di 96 pozzetti, erogare 0,8 mL di isopropanolo al 100% per pozzetto. Aggiungere 0,8 mL di surnatanti dai pozzetti corrispondenti.
  11. Pipettare delicatamente su e giù usando una pipetta, quindi incubare su ghiaccio per 30 minuti o per tutta la notte a 4 °C per ottenere più bacmid.
  12. Centrifugare a 2.600 × g per 30 minuti a 4 °C.
  13. All'interno di una cabina di sicurezza biologica, spruzzare l'esterno del blocco con etanolo al 70%, aprire il blocco e scartare il surnatante.
  14. Aggiungere 500 μL di etanolo al 70% (v/v) in ciascun pozzetto e picchiettare delicatamente il blocco per lavare il pellet. Coprire con un sigillo di plastica adesivo e centrifugare a 2.600 × g per 30 minuti a 4 °C.
  15. All'interno di una cabina di sicurezza biologica, aprire il blocco e gettare il surnatante. Picchiettare il blocco molto delicatamente su un tovagliolo di carta per rimuovere l'etanolo. Lasciare asciugare il blocco all'interno della cappa per 1-2 ore o in forno a 50 °C.
  16. Aggiungere 50 μL di tampone TE sterile per risospendere il DNA bacmidico e sigillare con un sigillo di plastica adesivo. Trasferire il contenuto su una piastra per microtitolazione con fondo a V. Conservare il DNA bacmidico a 4 °C fino al completamento della purificazione del test e poi conservarlo a -20 °C.
    NOTA: Anche se non viene misurato di routine, generalmente ci si può aspettare una resa da 500 a 2.000 ng/μL di DNA bacmidico.
  17. Utilizzare i metodi standard di PCRdi colonia 47 e i seguenti primer vettoriali per lo screening dei bacmidi che incorporano con successo il gene bersaglio:
    pFBM-fwd caaaatgtcgtaacaactccgc
    pFBM-rev tagttaagaataccagtcaatctttcac
    NOTA: L'amplicone sarà circa 700 bp più grande del gene bersaglio.

4. Trasfezione

NOTA: Questi passaggi vengono utilizzati per trasfettare le cellule di insetto Sf9 con il bacmid prodotto, che fa sì che le cellule di insetto generino particelle di baculovirus (P0).

  1. Coltivare cellule Sf9 in terreno di trattamento privo di siero fino a una densità di 2,0-2,4 × 106 cellule/mL. Diluire le cellule a 2 × 105 cellule/mL in terreno di trattamento senza siero e distribuire 1 mL delle cellule diluite in una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti. Includi un controllo di sola trasfezione con reagente e un controllo di sole cellule . Incubare la piastra in un incubatore umidificato a 27 °C per 1 ora per consentire l'adesione delle cellule.
  2. Miscelare 38 μL per pozzetto di terreno di coltura privo di siero con 2 μL per pozzetto del reagente di trasfezione. Erogare 40 μL della miscela in una piastra sterile per microtitolazione a fondo piatto a 96 pozzetti. Aggiungere 2 μL di DNA bacmidico ricombinante a 0,5-2,0 μg/μL, coprire la piastra e incubare all'interno della cabina di sicurezza microbiologica per 15 minuti.
  3. Aggiungere 160 μL di terreno di trattamento privo di siero per insetti in ciascun pozzetto della piastra per microtitolazione contenente la miscela di reagenti per la trasfezione del DNA.
  4. Aspirare il terreno dalle cellule nella fase 4.1. Aggiungere delicatamente i 200 μL di miscela reagente-terreno di trasfezione bacmidica sulle cellule, coprire la piastra e incubare per 4 ore in un incubatore umidificato a 27 °C.
  5. Aggiungere 400 μL di terreno di coltura per insetti privo di siero integrato con FBS al 2% in ciascun pozzetto. Per ridurre l'evaporazione, trasferire la piastra in un sacchetto di plastica pulito ma non sigillarlo. Incubare la piastra a 27 °C per 72 ore in incubatrice umidificata.
  6. Dopo 3 giorni, trasferire il terreno dalla piastra in un blocco sterile a 96 pozzetti e centrifugare a 1.500 × g per 20 minuti a temperatura ambiente. Trasferire il surnatante chiarificato contenente il baculovirus P0 in un blocco sterile a 96 pozzetti e conservare a 4 °C al riparo dalla luce.

5. Amplificazione del baculovirus BacMam

NOTA: I seguenti passaggi vengono utilizzati per amplificare il baculovirus P0 iniziale a titoli virali a titolo più elevato; vale a dire P1, P2 e P3. Il titolo finale di P3 è appropriato per la trasduzione e l'espressione proteica. Per l'efficienza e il parallelismo, questo protocollo utilizza rapporti volumetrici fissi per l'amplificazione virale, che sono stati ottimizzati empiricamente. Tuttavia, se le cellule successivamente trasdotte non mostrano fluorescenza GFP e aumento del diametro cellulare al microscopio o se l'espressione proteica fallisce (vedere paragrafi 6 e 8), l'amplificazione del baculovirus deve essere ri-ottimizzata per una bassa molteplicità di infezione ad ogni fase dopo aver quantificato il titolo di baculovirus 49,50,51,52 e l'infezione deve essere monitorata mediante microscopia a fluorescenza GFP e aumento del diametro cellulare 53.

  1. Preparare lo stock di virus P1 facendo crescere le cellule Sf9 in terreno di insetti privo di siero a una densità di 2 × 106 cellule/mL, aggiungere il 2% di FBS e seminare le cellule in un blocco di 24 pozzetti profondi in un volume finale di 3 mL per pozzetto. Aggiungere 120 μL di stock di virus P0 alle cellule.
  2. Incubare il blocco a 27 °C agitando a 450 giri/min in un agitatore di microespressione per 66-72 ore. Centrifugare il blocco a 1.500 × g per 20 minuti a temperatura ambiente e raccogliere il surnatante in blocchi a 96 pozzetti profondi. Conservare come riserva di virus P1 a 4 °C al riparo dalla luce.
  3. Preparare il ceppo di virus P2 infettando 50 mL di cellule Sf9 (2 × 106 cellule/mL di densità cellulare), coltivate in terreno di trattamento privo di siero di insetti integrato con FBS al 2%, con 250 μL di brodo di virus P1. Incubare le cellule a 27 °C agitando a 110 giri/min.
  4. Raccogliere il virus P2 dopo 66-72 ore mediante centrifugazione a 1.500 × g per 20 minuti e conservare a 4 °C al riparo dalla luce.
  5. Preparare il ceppo virale P3 infettando il volume desiderato di cellule Sf9 (2 × 106 cellule/mL di densità cellulare) con un reperto virale P2 1:200 (v/v). Incubare le cellule a 27 °C agitando a 110 giri/min.
  6. Dopo 66-72 ore, centrifugare a 1.500 × g per 20 minuti e raccogliere il virus P3 raccogliendo il surnatante e conservare a 4 °C, al riparo dalla luce.

6. Trasduzione per test di espressione

NOTA: la sezione seguente descrive il test delle espressioni su piccola scala e può essere modificata per il test parallelo di più costrutti utilizzando blocchi di pozzetti profondi.

  1. Preparare una soluzione di polietilenglicole al 20% (p/v) sciogliendo 200 g di PEG 10.000 e 12 g di NaCl in 600 mL di H2O bidistillato. Mescolare e portare a un volume finale di 1.000 mL. Autoclavare la soluzione.
  2. Aggiungere 300 μL di virus P1 raccolto nei pozzetti di un blocco di 24 pozzetti e 75 μL di soluzione PEG in ciascun pozzetto. Incubare il blocco in un agitatore di microespressione a 18 °C agitando a 300 giri/min per 5 minuti e conservare il blocco a 4 °C per una notte.
  3. Agitare nuovamente il blocco a 300 giri/min per 30 minuti a 18 °C e centrifugare il blocco a 3.000 × g per 45 minuti. Scartare il surnatante utilizzando una pipetta in una cabina di sicurezza microbiologica.
  4. Preparare cellule HEK293 adattate in sospensione in terreno HEK293 a una densità di 2 × 106 cellule/mL e seminare 3 mL in ciascun pozzetto contenente il pellet virale, integrando con 5 mM di butirrato di sodio.
  5. Incubare il blocco a 30 °C con l'8% di CO2 agitando a 200-250 giri/min per 72 ore.
    NOTA: Le concentrazioni di CO2 raccomandate dal fornitore durante la coltura cellulare sono diverse per le linee cellulari HEK293 adattate alla sospensione e ancestrali, rispettivamente all'8% e al 5%.
  6. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 900 × g per 20 minuti e lavare bene ciascuna con 1 ml di PBS.
    NOTA: Aspirare 10 μL di cellule risospese e visualizzare le cellule al microscopio a fluorescenza con un cubo filtrante compatibile con GFP per valutare l'espressione e la localizzazione delle proteine. Aspirare 10-15 μL di cellule risospese ed eseguire un gel SDS-PAGE a cellula intera per la rilevazione della fluorescenza GFP in gel54.
  7. Centrifugare nuovamente a 900 × g per 20 min. Congelare il pellet a -80 °C.

7. Purificazione di prova su piccola scala ad alto rendimento

NOTA: I seguenti passaggi descrivono un flusso di lavoro di purificazione del test rapido in un formato a blocchi a 24 pozzetti per lo screening dei livelli di espressione dei singoli SLC. Vedere la Tabella 2 per la composizione delle soluzioni utilizzate in questo protocollo.

  1. Aggiungere 1 mL di tampone di lisi HT a ciascun pozzetto di cellule raccolte e procedere alla sonicazione su ghiaccio per una durata totale di 4 minuti (ciclo a 3 s acceso/15 s spento) in blocchi da 24 pozzetti utilizzando una sonda a 24 testine.
  2. Trasferire il contenuto in un blocco di pozzetti profondo 96, aggiungere 125 μL di detersivo e sigillare con una guarnizione in silicone. Ruotare delicatamente il blocco a 4 °C per 1 h. In alternativa, aggiungere dodecilmaltoside (DDM) ed emisucinato di colesterolo (CHS) direttamente ai blocchi da 24 pozzetti e posizionarli su un rocker-shaker a 4 °C.
  3. Centrifugare il blocco a 2600 × g per 20 minuti a 4 °C e trasferire il surnatante in un nuovo blocco a 96 pozzetti.
  4. Preparare una scorta al 50% di resina Strep-Tactin ad alta capacità preequilibrata con tampone di lisi.
  5. Aggiungere 100 μL di resina in sospensione a ciascun pozzetto.
  6. Coprire il blocco con una guarnizione in silicone e ruotare a 4 °C per 2 ore, quindi centrifugare molto brevemente (fino a 200 × g) per rimuovere il liquido che si attacca al coperchio.
  7. Posizionare una piastra filtrante a 96 pozzetti sopra un blocco vuoto e trasferire la miscela resina/surnatante nella piastra filtrante. Sciacquare i pozzetti del blocco di pozzetti profondi con 800 μL di tampone di lavaggio HT e trasferirli nel blocco filtro per raccogliere la massima quantità di resina.
  8. Lasciare gocciolare il tampone o centrifugare brevemente a 200 × g e raccogliere il flusso. Posizionare la piastra filtrante sopra un nuovo blocco di lavaggio e lavare la resina con 800 μL di tampone di lavaggio HT, lasciando gocciolare il tampone (o centrifugare brevemente). Ripetere la fase di lavaggio altre due volte e centrifugare il blocco a 500 × g per 3 minuti per rimuovere il tampone di lavaggio HT residuo.
  9. Posizionare la piastra filtrante sopra una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti. Aggiungere 50 μL di tampone di eluizione HT e incubare con agitazione a temperatura ambiente per 10 min. Eluire i campioni centrifugando a 500 × g per 3 min.
  10. Eseguire 15 μL del campione eluito su un gel SDS-PAGE colorato con Coomassie per verificare l'espressione proteica. Caricare i campioni rimanenti di eluente su un sistema di cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) o cromatografia ad esclusione dimensionale (FSEC) per valutare la monodispersione proteica in DDM/CHS.

8. Trasduzione per l'espressione su larga scala

NOTA: I seguenti passaggi sono il protocollo RESOLUTE standard per l'espressione SLC. I singoli bersagli richiederanno un'ulteriore ottimizzazione per il tempo di espressione, la temperatura di incubazione e la concentrazione di butirrato di sodio. Inoltre, ottimizziamo di routine la molteplicità dell'infezione da baculovirus testando vari rapporti volumetrici del virus P3 utilizzato per infettare le cellule HEK293 adattate alla sospensione in esperimenti su piccola scala. Questo è efficiente in termini di tempo, utilizza tecniche e attrezzature già a portata di mano e valuta direttamente il risultato sperimentale desiderato. Tuttavia, questo metodo empirico richiede una ri-ottimizzazione ad ogni amplificazione del virus P3 e sono disponibili altri metodi per quantificare le particelledi baculovirus 49,50,51,52.

  1. Aumentare il volume richiesto di cellule HEK293 adattate alla sospensione nel terreno HEK293.
  2. Diluire le cellule HEK293 adattate in sospensione a 1 × 106 cellule/mL e far crescere per 24 ore (a 170 giri/min per i flaconi a rullo da 2 L e a 105 giri/min per i flaconi a rullo da 3 L).
  3. Aggiungere 30 mL di virus P3 per litro di cellule e aggiungere 5 mM di butirrato di sodio. Incubare le cellule a 37 °C per 48 ore o a 30 °C per 72 ore.
  4. Durante e dopo il periodo di incubazione, un passaggio chiave consiste nell'esaminare le cellule utilizzando la microscopia in campo chiaro per verificare la contaminazione microbica e la vitalità cellulare. Valutare l'espressione e la localizzazione delle proteine utilizzando la microscopia a fluorescenza con un cubo filtrante compatibile con GFP.
  5. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 900 × g per 20 min.
  6. Lavare il pellet cellulare risostenendolo in 10-15 mL di PBS per litro di coltura cellulare e pellettarlo nuovamente a 900 × g per 20 min.
  7. Congelare i pellet cellulari in azoto liquido e conservarli a -80 °C.

9. Purificazione delle proteine

NOTA: Di seguito è riportato il metodo RESOLUTE standard per la purificazione SLC per 5 L di coltura cellulare. Per ogni target SLC, il detergente ottimale deve essere determinato empiricamente. Preparare in anticipo il tampone di base, la soluzione madre detergente, il tampone di lavaggio, l'eluizione e il tampone SEC (Tabella 2). Per un elenco dei detergenti standard testati, vedere la Tabella 3. L'ATP e l'MgCl2 nel tampone di lavaggio riducono la contaminazione da proteine da shock termico.

  1. Giorno 1
    1. Scongelare il pellet cellulare congelato a bagnomaria a temperatura ambiente.
    2. Preparare il tampone di solubilizzazione con 135 mL di tampone base e tre compresse di cocktail di inibitori della proteasi. Lasciare sciogliere le compresse.
    3. Risospendere il pellet scongelato con tampone di solubilizzazione. Utilizzare 27 mL di tampone di solubilizzazione per 10-15 g di pellet cellulare, aggiungere DNasi e versare in un omogeneizzatore Dounce ghiacciato. Omogeneizzare la soluzione muovendo lo stantuffo su e giù di circa 20 volte, mantenendo l'omogeneizzatore in ghiaccio.
      NOTA: Il volume di risospensione dovrà essere ottimizzato in base alla proteina bersaglio e alla massa del pellet cellulare, che varierà a causa della densità cellulare al momento del raccolto. La DNasi commerciale può essere aggiunta secondo le istruzioni del produttore. La DNasi può anche essere espressa e purificata internamente utilizzando protocolli consolidati55.
    4. Aggiungere la soluzione madre di detersivo all'1% di concentrazione finale.
      NOTA: Un passo fondamentale per ottimizzare la purificazione delle proteine è identificare il detergente ottimale per la solubilizzazione e la purificazione delle SLC, che deve essere identificato empiricamente. Abbiamo utilizzato regolarmente vari detergenti; ciascuno da solo e in combinazione con colesteril emisuccinato, mantenendo il rapporto tra detersivo e massa CHS a 10:1.
    5. Trasferire la miscela di solubilizzazione in provette coniche da 50 mL. Ruotare lentamente per 1 ora a 4 °C.
    6. Centrifugare la soluzione a 50.000 × g per 30 minuti a 4 °C. Raccogli il surnatante.
    7. Equilibrare il volume del letto di 4-6 mL di resina Strep-Tactin con il tampone di base.
    8. Aggiungere la resina equilibrata al surnatante solubilizzato e ruotare per 2 ore a 4 °C.
    9. Versare la soluzione in una colonna a flusso gravitazionale e lasciarla fluire.
    10. Lavare la resina con 30 volte il volume del letto del tampone di lavaggio per streptococco in 3 fasi di volume uguali.
    11. Aggiungere 3-5 mL di tampone di eluizione, incubare per 15 minuti e raccogliere l'eluato. Ripetere questo passaggio altre quattro volte, raccogliendo separatamente ciascuna frazione di eluizione.
      NOTA: Un passaggio chiave è l'eluizione delle proteine dalla resina Strep-Tactina, dove è importante incubare per 15 minuti dopo ogni aggiunta del tampone di eluizione. Tipicamente, la prima frazione di eluato contiene una concentrazione inferiore di proteine a causa della diluizione del tampone di eluizione da parte del tampone di lavaggio residuo. Pertanto, la prima frazione di eluato può essere scartata se si desidera una concentrazione proteica finale più elevata. In alternativa, la concentrazione proteica in tutte le eluizioni seriali può anche essere analizzata utilizzando SDS-PAGE per ottimizzare il protocollo.
    12. Misurare la concentrazione proteica mediante spettroscopia di assorbanza UV, combinare le frazioni di eluizione desiderate e aggiungere la proteasi 3C nel rapporto da 1:5 (p/p) a 1:10 (p/p).
    13. Ruotare lentamente per una notte a 4 °C.
      NOTA: I passaggi 9.1.12 e 9.1.13 sono necessari solo se il tag GFP deve essere rimosso. Se la rimozione del tag non è necessaria, procedere direttamente al passaggio 9.2.4. In alternativa, la proteina può essere mantenuta a 4 °C durante la notte per continuare il giorno successivo. Inoltre, per le SLC con stabilità ridotta, potrebbe essere necessario ottimizzare la concentrazione di proteasi, il periodo di incubazione e la temperatura. La proteasi 3C è attiva in un'ampia gamma di temperature e consente l'ottimizzazione più adatta per vari SLC.
  2. Giorno 2
    1. Equilibrare 2-4 mL di volume del letto di resina di affinità al cobalto metallico con tampone SEC.
    2. Aggiungere la resina di affinità metallica di cobalto bilanciata alla miscela di reazione 3C durante la notte e ruotare per 1 ora a 4 °C.
    3. Versare la soluzione in una colonna a flusso gravitazionale e raccogliere il flusso.
    4. Concentrare il flusso in un filtro centrifugo cut-off da 100 kDa ruotando a 3.000 × g a 4 °C e miscelare delicatamente il campione ogni 5 minuti fino a raggiungere il volume di iniezione SEC desiderato.
    5. Equilibrare una colonna cromatografica ad esclusione dimensionale a base di destrano-agarosio utilizzando il tampone SEC. La procedura SEC deve essere eseguita a 4 °C (camera raffreddata o cella frigorifera).
      NOTA: Passaggio chiave: A seconda dello stato oligomerico dell'SLC, è possibile utilizzare una colonna diversa, ad esempio una colonna cromatografica ad esclusione dimensionale a base di agarosio, per eseguire la SEC.
    6. Iniettare il campione nel circuito del campione ed eseguire il programma SEC, con una portata tale che la pressione della colonna sia inferiore alle specifiche del produttore della colonna. Utilizzando un raccoglitore di frazioni, raccogli automaticamente frazioni da 0,3 mL durante l'intera corsa SEC.
    7. Raggruppare le frazioni di picco, misurare l'assorbanza UV e concentrare in un concentratore centrifugo cut-off da 100 kDa al volume/concentrazione richiesto ruotando a 3.000 × g a 4 °C.

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Risultati

I geni SLC possono essere clonati da plasmidi resolute pDONR in vettori BacMam per l'espressione nei mammiferi
I protocolli descritti per il clonaggio, l'espressione e la purificazione si sono dimostrati efficaci per molti trasportatori SLC attraverso più ripiegamenti proteici. Tuttavia, le procedure includono diversi punti di controllo per il monitoraggio dei progressi, consentendo l'ottimizzazione per tenere conto delle differenze di espressione, ripiegamento delle proteine, stabilità dipendente d...

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Discussione

Lo sviluppo di terapie mirate a SLC è rimasto ostacolato a causa dell'assenza di una caratterizzazione sistematica della funzione del trasportatore. Ciò ha portato a un numero sproporzionato di farmaci che hanno come bersaglio questa classe proteica rispetto ai GPCR e ai canali ionici63, nonostante i loro numerosi ruoli nei processi normali e fisiopatologici. RESOLUTE è un consorzio internazionale che mira a sviluppare tecniche e strumenti di ricerca all'avanguardia per accelerare e migliorare ...

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Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato svolto nell'ambito del progetto RESOLUTE. RESOLUTE ha ricevuto finanziamenti dall'impresa comune Iniziativa in materia di medicinali innovativi 2 nell'ambito dell'accordo di sovvenzione n. 777372. L'impresa comune riceve il sostegno del programma di ricerca e innovazione Orizzonte 2020 dell'Unione europea e dell'EFPIA. Questo articolo riflette solo il punto di vista degli autori e né l'IMI né l'Unione europea e l'EFPIA sono responsabili per qualsiasi uso che possa essere fatto delle informazioni in esso contenute. Il plasmide pHTBV è stato gentilmente fornito dal Prof. Frederick Boyce (Harvard).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
3C proteaseProduced in-house
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentratorsSartoriusVS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-MaltosideAnatraceC325CYMAL-5
96-well bacmid purification kitMilliporeLSKP09604Montage Plasmid Miniprep
96-well block (2 mL)Greiner Bio-One780271
Adhesive plastic sealsQiagen19570Tape Pads
Agarose size exclusion chromatography columnCytiva29091596Superose 6 Increase 10/300 GL
Benzonase DNAseProduced in-house
BisTrisSigma AldrichB9754
Cholesteryl Hemisuccinate Tris saltAnatraceCH210CHS
Cobalt metal affinity resinTakara Bio635653TALON Metal Affinity Resin
D(+)-BiotinSigma Aldrich851209
Dextran-agarose size exclusion chromatography columnCytiva28990944Superdex 200 Increase 10/300 GL
DigitoninApollo ScientificBID3301
Dounce tissue grinder (40 mL)DWK Life Sciences357546
EDTA-free protease inhibitor cocktailSigma Aldrich4693132001cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail
Fetal Bovine SerumThermo Fisher10500064
Fos-Choline-12AnatraceF308SFS-12
GlycerolSigma AldrichG5516
Glyco-diosgeninAnatraceGDN101GDN
Gravity flow columnsCole-ParmerWZ-06479-25
HEK293 mediumThermo Fisher12338018FreeStyle 293 medium
HEPESApollo ScientificBI8181
Hydrophilic, neutral silica UHPLC columnSepax231300-4615Unix-C SEC-300 4.6 x 150
ImidazoleSigma Aldrich56750
Insect transfection reagentSigma Aldrich71259Reagent
Lauryl Maltose Neopentyl GlycolAnatraceNG310LMNG
Magnesium Chloride HexahydrateSigma AldrichM2670
Micro-expression shakerGlas-Col107A DPMINC24CE
NaClSigma AldrichS9888
n-Decyl-β-D-MaltosideAnatraceD322DM
n-Dodecyl-b-D-MaltopyranosideAnatraceD310DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-OxideAnatraceD360LDAO
n-Nonyl-β-D-GlucopyranosideAnatraceN324SNG
n-Octyl-d17-β-D-GlucopyranosideAnatraceO311DOGNG
Octaethylene Glycol Monododecyl
Ether		AnatraceO330C12E8
Octyl Glucose Neopentyl GlycolAnatraceNG311OGNG
Phosphate Buffered SalineSigma AldrichD8537DPBS
Polyoxyethylene(10)dodecyl EtherAnatraceAP1210C12E10
Polyoxyethylene(9)dodecyl EtherAnatraceAPO129C12E9
Porous seal for tissue culture platesVWR60941-084Rayon Films for Biological Cultures
Proteinase KNew England BiolabsP8107S
Recombination enzyme mixThermo Fisher11791020Gateway LR Clonase II
Serum-free insect mediaGibco10902088Sf-900 II serum-free media
Sodium ButyrateSigma Aldrich303410
Sonicator 24-head probeSonics630-0579
Sonicator power unitSonicsVCX 750
Strep-Tactin resinIBA Life Sciences2-5030-025Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin
SucroseSigma AldrichS7903
Sucrose MonododecanoateAnatraceS350DDS
Suspension-adapted HEK293 cellsThermo FisherA14527Expi293F
Transfection reagentSigma Aldrich70967GeneJuice Transfection Reagent

Riferimenti

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