Procedura operativa e precauzioni della terapia di agopuntura con inserimento di fili nell'Alzheimer

Riepilogo

Questo studio presenta un protocollo per la terapia di agopuntura con inserimento di fili nei ratti simili al morbo di Alzheimer.

Abstract

La terapia di inclusione del filo (TEAT) è un trattamento che previene e gestisce le malattie inserendo una sutura biodegradabile in un punto di agopuntura, fornendo una stimolazione di lunga durata. TEAT è un approccio semplice che evita il disagio dell'agopuntura regolare e fornisce effetti terapeutici duraturi. Questo articolo discute il potenziale impatto di TEAT sulle capacità di apprendimento e memoria dei ratti con sintomi simili al morbo di Alzheimer. Poiché la degenerazione neuronale indotta chimicamente e i disturbi cognitivi nei ratti non riflettono interamente i veri cambiamenti patologici osservati nella malattia di Alzheimer. Di conseguenza, il nostro gruppo di ricerca ha designato queste manifestazioni come sintomi simili al morbo di Alzheimer. È stato stabilito un protocollo per delineare la selezione dei punti di agopuntura, il processo operativo e le precauzioni necessarie per la testa e la parte bassa della schiena. L'esperimento è stato condotto su tre gruppi: un gruppo di controllo, un gruppo modello e un gruppo TEAT, ciascuno contenente 6 ratti. Per indurre sintomi simili all'Alzheimer, ai ratti è stato iniettato intraperitonealmente D-galattosio per 7 settimane (49 giorni). I ratti del gruppo TEAT hanno ricevuto un trattamento di inclusione del catgut con agopuntura. Dopo il periodo di intervento, è stato condotto un labirinto d'acqua Morris (MWM) per valutare l'apprendimento e la memoria dei ratti. Successivamente, i ratti sono stati sacrificati e il loro tessuto cerebrale è stato esaminato. È stato eseguito un esame istologico per comprendere gli effetti del TEAT sulla patologia dei ratti che presentano sintomi di malattia di Alzheimer. Questo studio suggerisce che TEAT può migliorare l'apprendimento e la memoria nei ratti con sintomi simili al morbo di Alzheimer, indicando un nuovo approccio terapeutico potenzialmente promettente per questa condizione neurodegenerativa.

Introduzione

L'agopuntura con innesco di filo (TEA) prevede l'inserimento di catgut o suture riassorbibili nei punti di agopuntura utilizzando un ago speciale. Questa tecnica ha un effetto prolungato fino a quando le suture non vengono assorbite e degradate. Fornisce una stimolazione continua e prolungata ai punti di agopuntura per una settimana o più¹, ottenendo un risultato comparabile senza la necessità di procedure ripetitive quotidiane². In questo modo si riduce il numero di pazienti che si rivolgono alle cure mediche, risparmiando così in una certa misura le risorse mediche. Negli ultimi anni, TEAT è stato sempre più utilizzato in vari campi medici in Cina, tra cui medicina interna, medicina esterna, dermatologia, tratti del viso, ginecologia e pediatria³. Gli studi hanno dimostrato che è efficace nel produrre effetti affidabili e a lungo termine per alcune malattie croniche e complesse, come l'epilessia⁴ e la paralisi del nervo facciale⁵. Presenta i vantaggi di un trauma minimo e di un funzionamento semplice⁶. Inoltre, è stato riportato che i costi del trattamento di TEAT sono inferiori a quelli dell'elettroagopuntura (EA)⁷. Pertanto, TEAT è sempre più apprezzato nella ricerca clinica e scientifica.

La malattia di Alzheimer (AD) è una condizione neurodegenerativa che progredisce nel tempo. Il suo processo fisiopatologico inizia ad accumularsi circa 20 anni prima della comparsa dei sintomi clinici, ma il suo meccanismo non è ancora completamente compreso⁸. Data la limitata disponibilità di farmaci efficaci per l'AD, la ricerca si sta concentrando sempre più sugli stadi prodromici e preclinici della malattia⁹. La prevenzione è una strategia cruciale per affrontare lo sviluppo e la progressione di AD ^9,10. Negli ultimi anni, la medicina tradizionale cinese (MTC) ha fatto progressi significativi e si prevede che offrirà nuove possibilità per la prevenzione e il trattamento dell'AD^11,12. Come sottotipo di agopuntura, la TEAT è preferita ad altre terapie grazie alla sua ampia gamma di trattamenti, al trauma minimo, al funzionamento semplice, alla bassa frequenza di trattamento e all'efficacia di lunga durata⁶. La letteratura emergente suggerisce che la TEAT può giovare alle persone con obesità^13,14, diabete¹⁵, insonnia¹⁶, osteoporosi postmenopausale¹⁷ e depressione¹⁸, tutti fattori di rischio per l'AD. Migliora anche la senescenza nei ratti anziani regolando la mitofagia², migliora l'apprendimento spaziale e la compromissione della memoria, allevia il danno patologico dell'ippocampo e inibisce la risposta infiammatoria nei ratti con demenza vascolare (VD)¹⁹. Sembrava interessante capire se TEAT potesse agire anche sui processi patologici durante l'AD.

La ricerca attuale manca di uniformità e standardizzazione in diversi elementi critici del funzionamento TEAT, tra cui il metodo di incorporamento, lo strumento di incorporamento, la filettatura e il periodo di intervallo di incorporamento. Questa mancanza di standardizzazione influisce sulla valutazione dell'effetto della terapia e sull'esplorazione dei meccanismi correlati e limita la promozione e la comunicazione esterna. Ricerche precedenti^hanno dimostrato che la somministrazione intraperitoneale di D-galattosio (D-gal) può indurre cambiamenti patologici simili alla malattia di Alzheimer nei ratti, tra cui la degenerazione neuronale e i disturbi cognitivi. Inoltre, è stato dimostrato che l'elettroagopuntura a Baihui (GV20) e Shenshu (BL23) migliora efficacemente il declino cognitivo, mitiga la neuroinfiammazione e riduce il danno neuronale. Questo studio prende come esempio i ratti modello simili alla malattia di Alzheimer per introdurre la selezione dei punti di agopuntura e il processo operativo e le precauzioni del TEAT in questo modello. Discute gli elementi operativi critici di TEAT nella ricerca sperimentale per fornire un riferimento per studi futuri.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti seguendo la Guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono stati approvati dal Comitato per la gestione e l'uso degli animali da laboratorio del Centro provinciale per il controllo e la prevenzione delle malattie di Hubei. Per il test sono stati utilizzati un totale di 18 ratti femmina di Sprague-Dawley (SD) di 3 mesi del peso di 220-250 g. Tutti i ratti sono stati mantenuti con un ciclo luce/buio di 12 ore a 23 ± 1 °C e 40%-50% di umidità, con libero accesso a cibo e acqua. Dopo un periodo di acclimatazione di una settimana, durante il quale i ratti sono stati autorizzati ad abituarsi alle condizioni di laboratorio, gli esperimenti sono stati avviati.

1. Sviluppo del modello

1. Il disegno sperimentale è mostrato nella Figura 1. Dividi casualmente 18 ratti femmina di Sprague-Dawley di 3 mesi del peso di 220-250 g nei gruppi di controllo, modello e TEAT. Ogni gruppo è composto da 6 ratti.
2. Iniettare quotidianamente il gruppo modello e il gruppo TEAT con D-galattosio (D-gal; 120 mg/kg/die), mentre il gruppo di controllo riceve iniezioni di soluzione salina (120 mg/kg/die), per 7 settimane (49 giorni) nell'area ventrale inferiore²². L'iniezione deve essere somministrata quotidianamente tra le 8:00 e le 9:00.
3. Pesare i ratti il 7° giorno di ogni settimana tra le 9:00 e le 10:00. L'esperimento è durato 49 giorni. Seppellisci i fili ogni 14 giorni il 14^°, 28° e 42^{° giorno.} Fissa l'ora per l'incorporamento di ogni thread tra le 9:00 e le 12:00.
4. Continuare la somministrazione intraperitoneale di D-galattosio per 7 settimane per indurre manifestazioni patologiche correlate alla malattia di Alzheimer nei ratti²².

2. Preparazione per la tettarella

1. Sterilizzare gli strumenti chirurgici come forbici oftalmiche, vassoi e pinzette e disinfettare. Pulire accuratamente le superfici dell'ambiente della sala operatoria e disinfettarle.
2. Preparare la piattaforma chirurgica appoggiando un termoforo per piccoli animali sulla superficie, quindi drappeggiandolo con un asciugamano sterile. Successivamente, posizionare la scheda operatoria pulita e disinfettata in modo uniforme sulla parte superiore, con il lato ruvido rivolto verso l'alto. Quindi, accendere il termoforo e impostare la temperatura a 32 °C.
3. Per la procedura, selezionare un ago monouso n. 6 per incorporare il filo con un diametro di 0,6 mm e una sutura chirurgica assorbibile 5-0 (sutura al collagene) con una lunghezza di 2 cm. Tagliare la sutura chirurgica assorbibile 5-0 da 2 cm in pezzi da 0,5 cm e 0,2 cm utilizzando le forbici oftalmiche. Immergere il filo tagliato in soluzione salina allo 0,9% e mettere da parte.
4. Lavarsi le mani con acqua e sapone per 20 s, quindi asciugarle. Successivamente, indossare guanti sterili.
5. Anestetizzare i ratti con un'iniezione IP di idrato di cloralio (300 mg/kg) nell'area ventrale inferiore, assicurandosi che l'anestesia sia confermata quando gli animali non rispondono su un piano chirurgico, in base alla mancanza di risposta da un test di pizzicamento delle dita dei piedi e mantenendo uno stato fisiologico stabile. Inoltre, per prevenire la secchezza corneale e potenziali danni mentre i ratti sono sotto anestesia, applicare una generosa quantità di unguento veterinario sugli occhi, assicurandosi che rimangano lubrificati durante la procedura.
   NOTA: Si consiglia di anestetizzare il ratto, poiché è doloroso per loro sperimentare il piercing.

3. Operazione di inglobamento del filo per Baihui (GV 20)

1. Localizzare il punto di agopuntura Baihui (GV 20) nei ratti nel punto medio destro dell'osso parietale (Figura 2A). Posizionare i ratti in modo da esporre completamente la testa, con le orecchie tirate in avanti per approssimare il metodo utilizzato negli esseri umani per collegare le linee apicali dell'orecchio. Identificare il punto di Baihui (GV 20) palpando la cresta longitudinale centrale del cranio e individuando la posizione approssimativamente nel suo punto medio. Confermare ulteriormente questo agopunto al livello in cui le orecchie entrerebbero in contatto con la testa se stese piatte, allineandosi con l'intersezione della sutura sagittale e dell'osso parietale. Usa un pennarello per segnare Baihui (GV 20).
2. Radere l'area della testa intorno al punto di agopuntura del ratto usando un rifinitore (di solito un regolabarba elettrico da uomo).
3. Prima dell'intervento chirurgico, disinfettare i punti di agopuntura e la pelle circostante applicando una soluzione di iodio allo 0,5% con movimenti circolari, partendo dal centro e spostandosi verso l'esterno. Successivamente, eseguire un triplo processo di disinfezione: utilizzare lo iodoforo 3x, ciascuno seguito da un'applicazione di alcol per garantire una corretta decontaminazione e preparare il sito per la tecnica asettica.
4. Utilizzare una pinza per bloccare la sutura chirurgica riassorbibile da 0,2 cm imbevuta di soluzione fisiologica e posizionarla nell'estremità anteriore del tubo dell'ago. Quindi, collegalo al nucleo dell'ago.
5. Pizzica l'area intorno a Baihui (GV 20) con il pollice e l'indice di una mano, tenendo l'ago con l'altra.
6. Inserire l'ago orizzontalmente e rapidamente con un angolo di 15° rispetto alla superficie della pelle, 0,1 cm sotto la punta di Baihui (GV 20), pizzicando la pelle (Figura 3A).
7. Dopo che la punta dell'ago ha raggiunto 0,1 cm sopra il punto di Baihui (GV 20), spingere il nucleo dell'ago mentre si ritrae il tubo dell'ago per impiantare completamente la sutura chirurgica assorbibile da 0,2 cm nel tessuto sottocutaneo del punto di agopuntura (Figura 3B).
8. Rimuovere lentamente l'ago, assicurandosi che nessuna sutura sia esposta. Premere il foro dell'ago con cotone sterile asciutto per 10 s per evitare sanguinamenti. Se il filo si trova all'esterno del corpo dopo aver incorporato la linea nei punti di agopuntura, estrarlo e riutilizzarlo.

4. Operazione di inglobamento del filo per Shenshu (BL 23)

1. Il punto di agopuntura Shenshu (BL 23) nei ratti si trova a 5 mm lateralmente alla 2a^{vertebra lombare} (Figura 2B). Innanzitutto, individua la 6a^{vertebra lombare} in base al tubercolo dell'anca del ratto. Quindi localizzare la 2a^{vertebra lombare} contando verso l'alto quattro corpi vertebrali. Shenshu (BL 23) sarà 5 mm lateralmente ad esso²³.
   NOTA: La combinazione dei punti di agopuntura Baihui (GV 20) e Shenshu (BL 23) è un insieme frequentemente utilizzato nella teoria della Medicina Tradizionale Cinese (MTC) per la prevenzione e il trattamento dei disturbi cerebrali. Come confermato da precedenti ricerche ^20,21, questa coppia di agopunti è stata stabilita per la sua efficacia.
2. Usa un pennarello per contrassegnare Shenshu (BL 23). Radere la parte posteriore e la zona della vita attorno al punto di agopuntura del ratto usando un rifinitore (di solito un regolabarba elettrico).
3. Prima dell'intervento chirurgico, disinfettare i punti di agopuntura e la pelle circostante applicando una soluzione di iodio allo 0,5% con un movimento circolare, partendo dal centro e spostandosi verso l'esterno. Successivamente, eseguire un triplo processo di disinfezione: utilizzare lo iodoforo tre volte, ciascuna seguita da un'applicazione di alcol per garantire una corretta decontaminazione e preparazione del sito per la tecnica asettica.
4. Utilizzare una pinza per bloccare la sutura chirurgica riassorbibile da 0,5 cm imbevuta di soluzione fisiologica e posizionarla nell'estremità anteriore del tubo dell'ago. Quindi, collegalo al nucleo dell'ago.
5. Tendere la pelle con l'indice e il medio della mano che preme o il pollice e l'indice. Tenere l'ago con la mano che perfora.
6. Inserire rapidamente l'ago perpendicolarmente nel punto 0,25 cm sotto lo Shenshu (BL 23). Vedere la Figura 4A.
7. Dopo che la punta dell'ago ha raggiunto 0,5 cm sotto la pelle, regolare la punta dell'ago, rendendo centripeta la direzione di inserimento, formando un angolo di 45° con la superficie della pelle e inserire obliquamente 0,5 cm (Figura 4B).
   NOTA: È importante prestare attenzione quando si punge lo Shenshu (BL 23), che si trova vicino al rene. L'inserimento profondo o il sollevamento e la spinta ripetuti dell'ago possono causare danni. Pertanto, si consiglia una profondità di inserimento di circa 0,3-0,6 cm.
8. Spingere il nucleo dell'ago mentre si retrae il tubo e impiantare completamente la sutura chirurgica assorbibile da 0,5 cm nel tessuto muscolare del punto di agopunto (Figura 4C).
9. Estrarre lentamente l'ago, assicurandosi che nessuna sutura sia esposta. Quindi, premere il foro dell'ago con cotone sterile asciutto per 10 s per evitare sanguinamenti. Se il filo si trova all'esterno del corpo dopo aver incorporato la linea nei punti di agopuntura, estrarlo e riutilizzarlo.

5. Assistenza post-operatoria

1. Dopo l'intervento, posizionare il ratto su un termoforo per piccoli animali impostato a una temperatura di 32°C per facilitare il recupero dall'anestesia. Assicurarsi che l'animale sia completamente cosciente e che le sue condizioni siano soddisfacenti prima di rimetterlo nel suo recinto.
2. Dopo l'intervento chirurgico, osservare segni di risposte infiammatorie sterili nell'area interessata entro una settimana. Questi segni possono includere arrossamento, gonfiore o secrezione simile al pus. In genere, questi sintomi non richiedono alcun trattamento. Tuttavia, se c'è una quantità eccessiva di essudato, drenare e disinfettare l'area interessata. In questi casi, applicare l'unguento all'eritromicina fino a quando la ferita non si riprende completamente.

6. Test comportamentali ed esame istologico

1. Dopo l'intervento, alla settimana 8, eseguire l'esperimento Morris Water Maze (MWM) ^2,24 per valutare le loro capacità di apprendimento e memoria. Esegui le prove di apprendimento nell'arco di 5 giorni, con quattro prove al giorno. Quindi somministrare una prova della sonda dopo 24 ore dall'ultimo giorno di acquisizione.
2. Esegui confronti statistici utilizzando un software di analisi statistica. Analizzare i dati comportamentali della capacità di apprendimento mediante l'analisi della varianza a una via (ANOVA) e il test di Tukey post-hoc. Valutare la significatività dei dati sulla latenza di fuga mediante l'analisi della varianza a misure ripetute a due vie (ANOVA) seguita dal test di Bonferroni post-hoc. Un valore di p <0,05 è considerato significativo in tutti i test.
3. Dopo la valutazione comportamentale, anestetizzare i ratti come sopra e sopprimere con iniezioni intraperitoneali di 150 mg/kg di peso corporeo di pentobarbital sodico.
4. Fissare il cervello del ratto attraverso la perfusione utilizzando il 4% di paraformaldeide perfusa attraverso il sistema vascolare²⁵.
   1. Inserimento e fissazione dell'ago della sonda
      1. Prepara un ago da 12G e assicurati che sia dritto e adatto a passare attraverso il ventricolo del ratto. Individua il ventricolo del ratto, che in genere è il ventricolo sinistro, e inserisci l'ago attraverso di esso nell'aorta ascendente. Questo passaggio richiede precisione e una buona comprensione dell'anatomia del ratto.
      2. Una volta che l'ago è in posizione, utilizzare un emostatico per bloccare l'ago del gavage vicino al punto in cui entra nell'aorta. Questo aiuterà a fissare l'ago e ad evitare che si muova.
      3. Assicurarsi che il morsetto sia sufficientemente stretto da tenere saldamente l'ago, ma non così stretto da danneggiare l'aorta o ostacolare il flusso sanguigno. L'ago della sonda gastrica deve rimanere nell'aorta ascendente durante tutta la procedura per mantenere una corretta perfusione.
   2. Perfusione con soluzione fisiologica normale
      1. Preparare una siringa da 50cc senza ago per la perfusione. Collegare l'altra estremità dell'ago della navetta, che si trova all'esterno del corpo del ratto, alla siringa riempita con soluzione fisiologica.
      2. Fai una piccola incisione per tagliare l'appendice atriale destra per consentire al sangue di defluire dal cuore. Questo passaggio assicura che il sangue venga spostato dalla soluzione salina durante la perfusione.
      3. Iniziare a iniettare la soluzione fisiologica normale nell'aorta ascendente a una velocità costante e costante. Questo eliminerà il sangue e preparerà i tessuti per la fissazione.
      4. Monitorare il liquido che fuoriesce dall'appendice atriale destra e prepararsi a cambiare la siringa secondo necessità per mantenere una perfusione continua con soluzione fisiologica fresca.
         Posizionato, preparare a perfondere con il fissativo.
      5. Sostituire la siringa contenente soluzione fisiologica con una contenente il 4% di paraformaldeide, un fissativo comunemente usato in istologia. Procedere con la perfusione utilizzando la paraformaldeide per fissare i tessuti in posizione per il successivo trattamento e analisi.
         NOTA: Durante questa procedura, è fondamentale mantenere tecniche asettiche per prevenire l'infezione e maneggiare delicatamente il ratto per ridurre al minimo le lesioni. Inoltre, tutto il personale coinvolto deve essere formato sulla tecnica per garantire coerenza ed efficacia.
5. Rimuovere il cervello di ratto e metterlo in un flacone contenente il 4% di paraformaldeide per 24-48 ore a 4 °C^25,26. Eseguire la disidratazione con etanolo e il trattamento con xilene passo dopo passo, seguiti da sezioni coronali continue convenzionali (4-5 μm) per la misurazione. Valutare la morfologia e la perdita di neuroni ippocampali in ciascun gruppo utilizzando la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) (200x).
   NOTA: Un esame necroscopico per valutare la presenza di lesioni gastrointestinali (GI) non è stato condotto sui roditori sulla base dell'assenza di segni clinici indicativi di disturbi gastrointestinali durante il periodo sperimentale. Gli animali non hanno mostrato reazioni avverse evidenti che suggeriscano la presenza di tali patologie.

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Risultati

Questo articolo introduce il metodo operativo specifico del TEAT nei ratti simili al morbo di Alzheimer. Discute gli elementi operativi critici di TEAT nella ricerca sperimentale per fornire un riferimento per studi futuri.

TEAT migliora l'apprendimento nei ratti simili al morbo di Alzheimer
Come illustrato nel diagramma di flusso (Figura 5), durante il periodo di allenamento adattivo, è stato osservato che i ratti di ciascun gruppo osservavan...

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Discussione

Tempo di intervento
L'eziologia dell'AD è complessa e la sua patogenesi rimane incerta. Attualmente, non esiste un trattamento efficace per la malattia e il suo decorso è irreversibile. Pertanto, la comunità accademica ha raggiunto un consenso sull'importanza di concentrarsi sulla prevenzione e il trattamento dell'AD. Le strategie di prevenzione e trattamento per l'AD enfatizzano l'intervento precoce, seguendo il concetto di MTC di trattare le condizioni prima che si verifichino, enfatizzando il tr...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline, 4% paraformaldehyde, Hematoxylin, Eosin Y (water-soluble), absolute ethanol, 0.01M PBS powder, xylene, hydrochloric acid, embedded paraffin, neutral gum	sinopharm (www.sinopharm.com)
5-0 absorbable surgical suture	bodamedical (www.bodamedical.com)
70% alcohol, iodophor, cotton ball			Used for disinfection.
chloral hydrate	sigma	C8383
coverslips, glass slides	Guangzhou Wuqiang Experimental Equipment Co., Ltd
Dehydrator	Wuhan Junjie JT-12J Computerized Biological Tissue Dehydrator
DELUXE THERMOSTAT HEAT MAT	Zhenhua Instruments		For maintaining the body temperature of rats.
D-galactose	sigma	G0750
electric men's beard trimmer			Used for shaving rats.
Electronic scale for small animals (ZK-DST)	Henan Zhike Information Technology Co., Ltd
erythromycin ointment	frontpharm
glass dish			Used to place cut absorbable sutures.
High-Pressure Steam Sterilization Pot (YM100Z)	Shanghai Sanshen medical equipment factory		For sterilization of surgical instruments.
Ice Maker (CMB40)	Shanghai Sheyan Instrument Co., Ltd.
Microscope (BX-53)	OLYMPUS
milk powder			Used for the MWM test.
Morris Water Maze Video Tracking System & Data Analysis Software (Version: Watermaze 2.0)	Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd
No.6 thread-embedding needle	bodamedical (www.bodamedical.com)
ophthalmic scissors, trays, tweezers
Pathology Microtome  (RM 2016)	LEICA, Germany
pentobarbital	Germany	P11011
permanent marker			Used to mark the acupoint.
Slicing knives (R35)	Feathers, Japanese
soap			Used to wash hands.
sterile gloves