Elettrodeformazione modulata in ampiezza per valutare la fatica meccanica delle cellule biologiche

Riepilogo

Presentato qui è un protocollo per i test di fatica meccanica nel caso dei globuli rossi umani utilizzando un approccio di elettrodeformazione modulata in ampiezza. Questo approccio generale può essere utilizzato per misurare i cambiamenti sistematici nelle caratteristiche morfologiche e biomeccaniche delle cellule biologiche in una sospensione da deformazione ciclica.

Abstract

I globuli rossi (RBC) sono noti per la loro notevole deformabilità. Subiscono ripetutamente una notevole deformazione quando passano attraverso il microcircolo. La ridotta deformabilità è osservata nei globuli rossi fisiologicamente invecchiati. Le tecniche esistenti per misurare la deformabilità cellulare non possono essere facilmente utilizzate per misurare la fatica, la graduale degradazione nelle membrane cellulari causata da carichi ciclici. Presentiamo un protocollo per valutare la degradazione meccanica nei globuli rossi da sollecitazioni di taglio cicliche utilizzando l'elettrodeformazione basata sulla modulazione ASK (Amplitude Shift Keying) in un canale microfluidico. In breve, gli elettrodi interdigitati nel canale microfluidico sono eccitati con una corrente alternata a bassa tensione a frequenze radio utilizzando un generatore di segnale. I globuli rossi in sospensione rispondono al campo elettrico e mostrano una dielettroforesi positiva (DEP), che sposta le cellule verso i bordi degli elettrodi. Le cellule vengono quindi allungate a causa delle forze elettriche esercitate sulle due metà delle cellule, con conseguente allungamento uniassiale, noto come elettrodeformazione. Il livello di sollecitazione di taglio e la deformazione risultante possono essere facilmente regolati modificando l'ampiezza dell'onda di eccitazione. Ciò consente di quantificare la deformabilità non lineare dei globuli rossi in risposta a piccole e grandi deformazioni ad alta produttività. La modifica dell'onda di eccitazione con la strategia ASK induce elettrodeformazione ciclica con velocità di carico e frequenze programmabili. Ciò fornisce un modo conveniente per la caratterizzazione della fatica dei globuli rossi. Il nostro approccio di elettrodeformazione modulato ASK consente, per la prima volta, una misurazione diretta della fatica dei globuli rossi da carichi ciclici. Può essere utilizzato come strumento per test biomeccanici generali, per analisi della deformabilità cellulare e della fatica in altri tipi di cellule e condizioni patologiche, e può anche essere combinato con strategie per controllare il microambiente delle cellule, come la tensione dell'ossigeno e segnali biologici e chimici.

Introduzione

I globuli rossi (RBC) sono le cellule più deformabili nel corpo umano¹. La loro deformabilità è direttamente correlata alla loro funzionalità di trasporto dell'ossigeno. È stato riscontrato che una ridotta deformabilità nei globuli rossi è correlata alla patogenesi di diversi disturbi dei globuli rossi². Le misurazioni della deformabilità ci hanno portato a una migliore comprensione delle malattie correlate ai globuli rossi³. La durata normale dei globuli rossi può variare da 70 a 140 giorni⁴. Pertanto, è importante misurare come la loro deformabilità diminuisce insieme al processo di invecchiamento, ad esempio, il loro comportamento a fatica a causa di sollecitazioni cicliche di taglio³.

La misurazione della deformabilità dei globuli rossi ad alta produttività è impegnativa a causa delle forze della scala di Piconewton (~^10-12 N) che vengono applicate alle singole celle. Negli ultimi dieci anni, sono state sviluppate molte tecnologie per misurare la deformabilità cellulare⁵. Le misurazioni della deformazione dei globuli rossi a livello di singola cellula possono essere eseguite mediante aspirazione di pipette e pinzette ottiche, mentre le analisi di massa vengono eseguite mediante ektacitometria a gradiente osmotico. Le analisi ektacitometriche forniscono un'abbondanza di dati, che offre l'opportunità di diagnosticare disturbi del sangue ^6,7. La deformabilità dei globuli rossi può anche essere analizzata utilizzando la teoria viscoelastica mediante microscopia a forza atomica con sonda colloidale. In questo metodo, l'analisi computazionale viene applicata per stimare il modulo elastico dei globuli rossi, considerando sia le risposte dipendenti dal tempo che quelle stazionarie. La deformabilità dei singoli globuli rossi può essere misurata utilizzando il metodo dell'array di microcamere a cella singola. Questo metodo analizza ogni cellula attraverso la membrana e i marcatori fluorescenti citosolici per fornire informazioni sulla deformabilità dei globuli rossi e sulla distribuzione delle caratteristiche cellulari in popolazioni complesse di RBC per rilevare disturbi ematologici⁸.

La fatica è un fattore chiave nella degradazione delle proprietà dei materiali ingegnerizzati e dei biomateriali. I test a fatica consentono un'analisi quantitativa dell'integrità e della longevità di una struttura sottoposta a carico ciclico. L'analisi della fatica nelle cellule biologiche è stata a lungo ostacolata dalla mancanza di un metodo generale, facilmente applicabile, ad alto rendimento e quantitativo per l'implementazione della deformazione ciclica nelle membrane cellulari. Ciò è possibile con l'utilizzo di modulazione del segnale elettrico e tecniche di elettrodeformazione implementate in un ambiente microfluidico. La tecnica ASK (Amplitude Shift Keying) come modulazione digitale viene applicata tramite la modulazione OOK (On-Off Keying) in questo articolo. Il concetto di keying si riferisce alla trasmissione di segnali digitali sul canale, che richiede un segnale portante sinusoidale per funzionare⁹. I tempi di accensione e spegnimento possono essere impostati uguali. Sotto ON-keying, i globuli rossi entrano in uno stato deformato mentre sono esposti a una forza di elettrodeformazione esterna (F_dep)¹⁰ creata dal campo elettrico non uniforme. Sotto OFF-keying, i globuli rossi sono nel loro stato rilassato. Osserviamo la fatica dei globuli rossi, ovvero un progressivo degrado della loro capacità di allungarsi con l'aumentare dei cicli di carico. La perdita di deformabilità indotta dalla fatica nei globuli rossi può fornire informazioni sul danno accumulato dalla membrana durante la circolazione sanguigna, permettendoci di studiare ulteriormente le connessioni tra affaticamento cellulare e stati patologici.

Qui forniamo procedure passo-passo su come la prova di fatica dei globuli rossi è implementata in un dispositivo microfluidico tramite elettrodeformazione modulata ASK e le impostazioni del sistema come il dispositivo microfluidico, il carico meccanico e l'immaginazione microscopica per la caratterizzazione della degradazione graduale nella deformabilità meccanica dei globuli rossi.

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Protocollo

Il sangue intero umano non identificato è stato ottenuto commercialmente. Il lavoro che coinvolge i campioni di sangue è stato eseguito in un laboratorio di livello di biosicurezza 2 utilizzando protocolli approvati dal Comitato istituzionale per la biosicurezza presso la Florida Atlantic University.

1. Preparazione del dispositivo microfluidico

1. Fissare con nastro adesivo il wafer di silicio master SU-8 per il design del canale microfluidico all'interno di una capsula di Petri di plastica da 14 cm e pulirla con gas N₂ .
2. Pesare 60 g di base di polidimetilsilossano (PDMS) e 6 g di agente polimerizzante PDMS in un bicchiere di carta. Mescolare le due parti usando una spatola di legno fino a quando il composto è di un colore bianco torbido.
3. Versare la miscela PDMS nella capsula di Petri di plastica contenente il wafer di silicio. Posizionare la capsula di Petri in un essiccatore sottovuoto con un rubinetto a 3 vie. Ruotare la valvola del rubinetto di arresto per collegare il vuoto alla camera dell'essiccatore per rimuovere le bolle d'aria dal PDMS.
4. Reintrodurre l'aria nella camera dell'essiccatore regolando la valvola del rubinetto di arresto per collegare la camera dell'essiccatore all'ambiente in cicli di circa 5 minuti. Ripetere l'operazione fino a quando tutte le bolle d'aria vengono rimosse dalle caratteristiche dei canali.
5. Posizionare la piastra di Petri all'interno di un forno a 70 °C per 4 ore. Una volta trascorso il tempo, rimuovere la capsula di Petri, lasciarla raffreddare a temperatura ambiente e posizionarla su un tappetino da taglio.
6. Utilizzando un bisturi, ritagliare la porzione del PDMS sopra il wafer di silicio. Posizionare il PDMS ritagliato tra i due fogli di pellicola avvolgente da laboratorio. Lo spazio formato tra la rientranza del microcanale e il film semitrasparente facilita l'identificazione della posizione del canale microfluidico e della sua rispettiva entrata e uscita.
7. Utilizzando una lametta da barba, ritagliare un singolo canale dal grande PDMS. Perforare un foro di ingresso da 3 mm e un foro di uscita da 1,5 mm utilizzando punzoni per biopsia rispettivamente alle due dimensioni (Figura 1A).
8. Posizionare il canale perforato, con il lato del canale rivolto verso l'alto, su un vetrino pulito. Posizionare un substrato di vetro di 20 mm x 15 mm contenente elettrodi interdigitati con ossido di indio-stagno (ITO) a film sottile sullo stesso vetrino con gli elettrodi rivolti verso l'alto.
9. Posizionare delicatamente il vetrino con PDMS e il substrato in un detergente al plasma. Chiudere la valvola del gas, accendere l'interruttore della pompa e attendere 2 minuti per ottenere una lettura del sensore di 600 - 800 mTorr.
10. Accendere l'interruttore di alimentazione e attendere 30 secondi. Ruotare la manopola di alimentazione RF da bassa a alta e attendere 1 minuto.
11. Quindi, invertire la sequenza ruotando la manopola RF su OFF, l'interruttore di alimentazione su OFF, l'interruttore della pompa su OFF e aprendo la valvola del gas.
12. Immediatamente dopo aver aperto la camera del pulitore al plasma, sollevare e ruotare il PDMS in modo che il lato del canale sia rivolto verso il basso (180°). Posizionare il canale sulla parte superiore del substrato ITO. Il processo di incollaggio è iniziato.
13. Utilizzando una pinzetta, premere delicatamente sugli angoli del PDMS per circa 3 s. Evitare di premere sul canale stesso.
    NOTA: Il processo di incollaggio avviene spontaneamente al contatto fisico tra le due superfici trattate.
14. Caricare il mezzo di adescamento in una siringa da 1 mL con un ago da 23 G. Bagnare accuratamente il canale inserendo l'ago direttamente nel pozzetto di ingresso e quindi rilasciando il mezzo. Operare lentamente. Non introdurre bolle d'aria. Incubare per almeno 3 min.
15. Rimuovere il mezzo principale utilizzando una punta della pipetta da 10 μL. Lavare il canale con DEP medium 3 volte inserendo il mezzo DEP nel canale. Mantenere il canale sempre bagnato.

2. Dispositivo di prova

NOTA: Il dispositivo di prova è progettato utilizzando un software CAD 3D e include un'unità di alloggiamento di base e un'unità superiore (Figura 1B). Quindi, viene prodotto utilizzando una fresatrice CNC a 3 assi con un limite di tolleranza standard di circa ± dimensione di 0,005 pollici del dispositivo di prova viene controllata utilizzando una pinza elettronica (non mostrata). La sterilità dell'apparecchio non è richiesta per i test biomeccanici in vitro.

1. Fili di pre-saldatura nelle estremità della tazza di saldatura di due set di connettori a pistone a molla.
2. Inserire i connettori del pistone a molla nell'unità superiore e creare un incollaggio permanente aggiungendo una goccia di colla epossidica.

3. Preparazione del tampone di lavoro per elettrodeformazione

1. Per preparare il mezzo DEP, pesare 12,75 g di saccarosio e 0,45 g di destrosio utilizzando una bilancia.
2. Sciogliere entrambe le polveri in un unico contenitore con 150 ml di acqua deionizzata (DI) e 3,5 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS).
3. Utilizzando un tester di conducibilità a bassa gamma, misurare la conducibilità e assicurarsi che sia 0,04 S/m (Figura 2).
   NOTA: è possibile utilizzare un valore di conducibilità diverso, che potrebbe modificare il segno e la grandezza della forza DEP risultante¹¹. L'elettrodeformazione, tuttavia, richiede una forza DEP positiva.
4. Utilizzando un osmometro, confermare che l'osmolarità rientra nel range normale del plasma sanguigno, da 275 a 295 mOsm/kg di acqua (Figura 3). Conservare a 4 °C. Il mezzo DEP è ora pronto.
5. In una provetta da 15 ml, sciogliere 0,5 g di albumina sierica bovina (BSA) in 10 mL del terreno DEP. Mescolare accuratamente. Il supporto principale del dispositivo è ora pronto.

4. Preparazione della sospensione cellulare

1. Lavare 20 μL di sangue intero centrifugando il sangue con 1 mL di PBS a 268 x g per 3 minuti. Scartare il surnatante.
2. Risospendere i globuli rossi in 1 mL di PBS. Pipettare delicatamente per mescolare. Lavare i globuli rossi per 3 minuti a 268 x g ed eliminare il surnatante.
3. Estrarre 5 μL di pellet di globuli rossi utilizzando una punta di micropipetta da 10 μL ed erogare completamente in 1 mL di mezzo DEP. Lavare le celle centrifugando a 268 x g per 3 min.
4. Eliminare il surnatante e risospendere i globuli rossi in 1 mL di terreno DEP. Pipettare delicatamente per mescolare.
5. Lavare i globuli rossi per 3 minuti a 268 x g ed eliminare il surnatante. Pipettare 2 μL di pellet RBC in 500 μL di mezzo DEP. La sospensione cellulare viene ora preparata con una concentrazione compresa tra 62 e 104 cellule/μL¹², che può essere confermata utilizzando un vetrino standard per il conteggio delle cellule.

5. Configurazione dell'elettrodeformazione e test di fatica

1. Posizionare il dispositivo microfluidico nella parte inferiore del dispositivo di prova. Allineare la parte superiore del dispositivo al dispositivo e assemblare le due parti utilizzando due set di viti e dadi in nylon (Figura 4).
2. Posizionare il dispositivo di prova sul palco del microscopio. Individuare un set desiderato di elettrodi al microscopio.
3. Collegare la coppia corrispondente di fili dell'elettrodo che corrispondono all'elettrodo posizionato al terminale di uscita del generatore di funzioni (Figura 4).
4. Rimuovere 5 μL del mezzo DEP dall'ingresso di 3 mm del canale microfluidico. Caricare lentamente 5 μL della sospensione della cella nell'ingresso utilizzando una punta per pipetta da 10 μL.
5. Lasciare che le cellule si stabilizzino per 1 minuto. Se necessario, aggiungere un ulteriore mezzo DEP all'ingresso per spingere le celle nel canale.
6. Osservare il canale con ingrandimento 20x. Utilizzare un filtro passa banda 414/46 nm per migliorare il contrasto dell'immagine.
7. Premere il pulsante Sinusoidale e definire un'onda sinusoidale con ampiezza 2 V_RMS alla frequenza di 3 MHz. Premere il pulsante Mod per abilitare la modulazione. Modificare la modalità onda in ASK premendo l'opzione Tipo .
8. Impostare la frequenza di modulazione su 250 mHz, che corrisponde a un periodo di carico-scarico di 4 s (Figura 5A). Attivare l'uscita del generatore di funzioni.
9. Registra un video di 1 minuto ogni 10 minuti a 30 fotogrammi per s (fps).

6. Caratterizzazione della deformazione dei globuli rossi

1. Utilizzando un'applicazione di editing video, aprire .avi i file registrati nel passaggio precedente premendo CTRL+O. Utilizzare la timeline per scegliere un fotogramma di interesse e impostare i fotogrammi iniziali e finali della selezione in modo che siano identici premendo il tasto Home e quindi il tasto Fine sulla tastiera.
2. Esportate la cornice dell'immagine. Selezionare il formato di output da JPEG e premere OK.
3. Aprire l'applicazione ImageJ e caricare le immagini salvate nel passaggio precedente. Iniziare impostando le misure necessarie premendo Analizza > Imposta misure e assicurandosi che le caselle di controllo Area, Perimetro e Adatta ellisse siano selezionate. Premere OK.
4. Quindi, converti l'immagine in scala di grigi scegliendo Immagine > Tipo > 8 bit.
5. Quindi convertire l'immagine in binario utilizzando Image > Adjust > Thresholding. Nella finestra di dialogo Soglia, regolate i due dispositivi di scorrimento in base alle esigenze. Premere Applica e quindi chiudere la finestra di dialogo Soglia.
6. Scegliere Analizza > Tools > Gestione ROI. In Gestione ROI, premere la casella di controllo Mostra tutto. Non chiudere questa casella.
7. Selezionare lo strumento bacchetta (ricalco), selezionare una cella applicabile nell'immagine e premere T sulla tastiera. La cella selezionata verrà numerata. È possibile selezionare nuovamente una nuova cella. Selezionare tutte le celle applicabili da misurare. Le celle applicabili sono identificate come quelle isolate dalle altre cellule. Il numero di queste celle potrebbe variare da 50 a 200 in un singolo campo visivo.
8. Tornare alla casella ROI Manager e premere Misura. Verrà visualizzata la casella Risultati. Le colonne etichettate Maggiore e Minore sono le lunghezze degli assi maggiore e minore dell'ellisse adattata (in pixel), rispettivamente. Scegliere File > Salva con nome per esportare le misurazioni come file in formato CSV.
9. Utilizzando qualsiasi software di analisi computazionale appropriato, calcolare il quoziente di Maggiore e Minore.

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Risultati

Quando la sospensione cellulare è stata caricata nel canale microfluidico, è stata osservata una distribuzione relativamente uniforme delle cellule. All'uscita del segnale (ad esempio, una semplice onda sinusoidale o una fase On-Keying di ASK) dal generatore di funzioni, gli elettrodi interdigitati a film sottile generavano un campo elettrico a corrente alternata non uniforme. Le cellule sospese hanno risposto spontaneamente a questa eccitazione elettrica e hanno mostrato un comportamento DEP positivo, cioè spostandos...

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Discussione

La modulazione ASK OOK di un'onda sinusoidale che induce forza DEP può essere utilizzata per testare la fatica meccanica dei globuli rossi per un lungo periodo di tempo. In questo protocollo, abbiamo limitato il test di fatica in vitro a 1 ora per prevenire i potenziali effetti metabolici avversi sulla deformabilità cellulare. Le condizioni complete di prova di fatica possono essere programmate utilizzando la tecnica di elettrodeformazione modulata ASK. È possibile programmare parametri come la frequenza di caricament...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balance Scale	ViBRA	HT-224R
Bandpass filter	BRIGHTLINE	414/46 BrightLine HC
BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL	Fisher Scientific	14-823-30
Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm	Fisher Scientific	12-460-403
Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm	Fisher Scientific	12-460-407	1.5 mm and 3 mm diameter
Blunt needle, 23-gauge	BSTEAN	X001308N97
Bovin Serum Albumin	RMBIO	BSA-BSH
Centrifuge	SCILOGEX	911015119999
Conical Tube, 50 mL	Fisher Scientific	05-539-13
Dextrose	Fisher Scientific	MDX01455	MilliporeSigma™
EC Low Conductivity meter	ecoTestr	358/03
Eppendorf   Snap-Cap MicrocentrifugeTubes	www.eppendorf.com	05-402-25
Excel	Microsoft		Graph plotting
Function Generator	SIGLENT	SDG830
Glass/ITO Electrode Substrate	OSSILA	S161
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/
Inverted Microscope	OLYMPUS	IX81 - SN9E07015
Lab Oven	QUINCY LAB (QL)	MODEL 30GCE	Digital Model
Matlab	MathWorks		Graph plotting
Micro Osmometer - Model 3300	Advanced Instruments Inc.	S/N: 03050397P
Parafilm Laboratory Wrapping Film	Fisher Scientific	13-374-12
Petri dish	FALCON	SKU=351006	ICSI/Biopsydish 50*9 mm
Phosphate Buffered Saline (PBS)	LONZA	04-479Q
Plasma Cleaner	Harrick plasma PDCOOL	NC0301989
Solidworks	Dassault Systemes		CAD software
Sucrose	Fisher Scientific	50-188-2419
Vacuum Desiccator	SPBEL-ART	F42400-2121
Wooden spatula	Fisher Scientific	NC0304136	Tongue Depressors Wood NS 6"