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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Descriviamo un protocollo per stabilire un modello di coltura di interfaccia aria-liquido (ALI) utilizzando cellule epiteliali delle vie aeree tracheali neonatali (nTAEC) ed eseguire l'esposizione all'iperossia fisiologicamente rilevante per studiare l'effetto dello stress ossidativo indotto dall'atmosfera sulle cellule derivate dall'epitelio della superficie delle vie aeree neonatali in via di sviluppo.

Abstract

L'epitelio neonatale pretermine è costantemente esposto a fattori di stress ambientale. Uno di questi fattori di stress nei neonati con malattie polmonari include la tensione dell'ossigeno (O2) superiore a quella dell'atmosfera ambientale, definita iperossia (>21% O2). L'effetto dell'iperossia sulle vie aeree dipende da vari fattori, tra cui lo stadio di sviluppo delle vie aeree, il grado di iperossia e la durata dell'esposizione, con esposizioni variabili che possono portare a fenotipi unici. Sebbene siano state condotte ricerche approfondite sull'effetto dell'iperossia sull'alveolarizzazione polmonare neonatale e sull'iperreattività delle vie aeree, poco si sa sull'effetto sottostante a breve e lungo termine dell'iperossia sulle cellule epiteliali delle vie aeree neonatali umane. Una delle ragioni principali di ciò è la scarsità di un modello in vitro efficace per studiare lo sviluppo e la funzione epiteliale delle vie aeree neonatali umane. Qui, descriviamo un metodo per isolare ed espandere le cellule epiteliali delle vie aeree tracheali neonatali umane (nTAEC) utilizzando aspirati tracheali neonatali umani e coltivando queste cellule in coltura di interfaccia aria-liquido (ALI). Dimostriamo che gli nTAEC formano un monostrato di cellule polarizzate mature in coltura di ALI e vanno incontro a differenziamento mucociliare. Presentiamo anche un metodo per l'esposizione moderata all'iperossia del monostrato cellulare in coltura di ALI utilizzando un incubatore specializzato. Inoltre, descriviamo un test per misurare lo stress ossidativo cellulare a seguito di esposizione all'iperossia in coltura di ALI utilizzando la quantificazione fluorescente, che conferma che l'esposizione moderata all'iperossia induce stress ossidativo cellulare ma non causa danni significativi alla membrana cellulare o apoptosi. Questo modello può potenzialmente essere utilizzato per simulare l'esposizione all'iperossia clinicamente rilevante riscontrata dalle vie aeree neonatali nell'Unità di Terapia Intensiva Neonatale (NICU) e utilizzato per studiare gli effetti a breve e lungo termine dell'O2 sulla programmazione epiteliale delle vie aeree neonatali. Gli studi che utilizzano questo modello potrebbero essere utilizzati per esplorare modi per mitigare il danno ossidativo precoce alle vie aeree in via di sviluppo, che è implicato nello sviluppo di malattie delle vie aeree a lungo termine negli ex neonati prematuri.

Introduzione

L'ossigeno terapeutico (O2) è una delle terapie più utilizzate nell'unità di terapia intensiva neonatale (NICU)1. Di conseguenza, l'esposizione all'iperossia (>21% O2) è un fattore di stress atmosferico comune riscontrato dai neonati con e senza malattia polmonare significativa. Le risposte polmonari all'iperossia possono variare a seconda dell'intensità e/o della durata dell'esposizione e della posizione anatomica, del tipo di cellula e dello stadio di sviluppo polmonare 2,3,4,5,6. La maggior parte della ricerca sul danno polmonare da iperossia neonatale si è concentrata sull'effetto dell'esposizione all'iperossia nel contesto dell'alveolarizzazione postnatale per modellare la displasia broncopolmonare (BPD) - la malattia polmonare cronica più comune che colpisce i neonati pretermine 6,7,8,9,10,11. La gravità del BPD è classificata in base alla quantità di supporto respiratorio e all'O2 necessario a 36 settimane dopo l'età mestrualedi 9 anni. La maggior parte dei bambini con BPD migliora clinicamente nel tempo man mano che i polmoni continuano a crescere, con la maggior parte che svezza il supporto respiratorio prima del primo compleanno12,13. Indipendentemente dalla gravità della BPD dopo la nascita, le morbilità significative che colpiscono gli ex neonati prematuri includono un aumento di 5 volte del rischio di respiro sibilante in età prescolare, asma, infezioni respiratorie ricorrenti durante l'infanzia e broncopneumopatia cronica ostruttiva ad esordio precoce 12,14,15,16,17,18,19. L'effetto dell'iperossia sulla malattia a lungo termine delle vie aeree e sulle infezioni polmonari nei neonati pretermine è stato studiato utilizzando modelli animali in vitro e in vivo 20,21,22,23,24. Tuttavia, la maggior parte di questi modelli si è concentrata sul ruolo del tessuto mesenchimale, dell'epitelio alveolare e della muscolatura liscia delle vie aeree 25,26,27,28.

L'epitelio della superficie delle vie aeree riveste l'intero percorso dell'apparato respiratorio, estendendosi dalla trachea fino al bronchiolo terminale, terminando appena prima del livello degli alveoli29. Le cellule basali delle vie aeree sono le cellule staminali primarie nell'epitelio delle vie aeree, con la capacità di differenziarsi nell'intero repertorio di linee epiteliali mature delle vie aeree, che includono cellule ciliate e secretorie (cellule club: non produttrici di muco e cellule caliciformi: produttrici di muco)29,30,31,32. Gli studi sulle colture cellulari nel contesto del danno polmonare iperossico neonatale hanno utilizzato principalmente linee cellulari di cancro adulto umano o di topo33,34. Inoltre, la maggior parte degli esperimenti in vitro ha utilizzato sistemi di coltura sommersi, che non consentono la differenziazione delle cellule in un epitelio mucociliare delle vie aeree simile all'epitelio delle vie aeree in vivo nell'uomo35. Di conseguenza, vi è una lacuna nelle conoscenze riguardo agli effetti del danno polmonare indotto dall'iperossia nello sviluppo delle cellule epiteliali delle vie aeree dei neonati umani. Uno dei motivi è la scarsità di modelli traslazionali per studiare gli effetti dell'esposizione atmosferica sull'epitelio delle vie aeree neonatali umane. Il danno polmonare iperossico all'inizio della vita può portare a malattie delle vie aeree a lungo termine e ad un aumento del rischio di infezione, con conseguenti conseguenze che alterano la vita negli ex neonati prematuri 14,36,37. Nei neonati non sopravvissuti con BPD grave, l'epitelio della superficie delle vie aeree presenta anomalie distinte, tra cui iperplasia delle cellule caliciformi e sviluppo ciliare disordinato, che denotano un'anormale clearance mucociliare e un aumento dell'altezza epiteliale che compromette il calibro38 delle vie aeree. Nell'ultimo decennio, c'è stato un crescente interesse per la coltura di cellule epiteliali primarie delle vie aeree all'interfaccia aria-liquido (ALI) per studiare lo sviluppo epiteliale delle vie aeree postnatale 39,40,41,42. Tuttavia, i modelli ALI di cellule epiteliali delle vie aeree neonatali non sono stati utilizzati nel contesto di modelli di perturbazione redox atmosferica come l'esposizione all'iperossia.

Utilizzando un metodo39 precedentemente pubblicato, abbiamo utilizzato campioni di aspirato tracheale neonatale ottenuti da neonati intubati in terapia intensiva neonatale e isolato ed espanso con successo le cellule epiteliali delle vie aeree tracheali neonatali primarie (nTAEC). Abbiamo utilizzato inibitori della segnalazione Rho, Smad, glicogeno sintasi chinasi (GSK3) e bersaglio della rapamicina nei mammiferi (mTOR) per aumentare la capacità di espansione e ritardare la senescenza in queste cellule, come descritto in precedenza 39,42, il che consente un passaggio efficiente e successivo dei nTAEC. Il protocollo descrive i metodi per stabilire colture 3D di ALI utilizzando nTAEC ed eseguire l'esposizione all'iperossia sui monostrati nTAEC. L'inibizione di Rho e Smad viene utilizzata per i primi 7 giorni di coltura di ALI (giorni ALI da 0 a 7), dopodiché questi inibitori vengono rimossi dal terreno di differenziazione per il resto della durata della coltura di ALI. La superficie apicale del monostrato di cellule epiteliali delle vie aeree coltivate con ALI rimane esposta all'ambiente43, il che consente studi di perturbazione atmosferica e assomiglia molto alla patobiologia di una via aerea neonatale in via di sviluppo esposta all'iperossia in vivo. La concentrazione di O2 utilizzata in precedenti studi su colture cellulari (indipendentemente dalle cellule immortalizzate o primarie) di danno polmonare iperossico neonatale varia significativamente (dal 40% al 95%), così come la durata dell'esposizione (che varia da 15 minuti a 10 giorni)36,44,45,46,47. Per questo studio, il monostrato di cellule ALI è stato esposto al 60% di O2 per 7 giorni dal giorno 7 al 14 di ALI (dopo la rimozione degli inibitori Rho/Smad dai terreni di differenziazione). L'esposizione all'iperossia è stata eseguita durante la fase iniziale-media della differenziazione mucociliare (ALI da 7 a 14 giorni) rispetto all'epitelio maturo completamente differenziato e quindi simula l'epitelio delle vie aeree in via di sviluppo in vivo nei neonati pretermine. Questa strategia di esposizione riduce al minimo il rischio di tossicità acuta da O2 (che è prevista con concentrazioni più elevate di O2) pur esercitando lo stress ossidativo entro un intervallo fisiologicamente rilevante e assomiglia alla finestra critica di transizione dall'ambiente intrauterino relativamente ipossico a un ambiente esterno iperossico nei neonati umani pretermine.

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Protocollo

I campioni di aspirato tracheale neonatale sono stati raccolti solo dopo il consenso informato dei genitori e il protocollo utilizzato per la raccolta, il trasporto e la conservazione è stato approvato dall'Institutional Review Board (IRB) dell'Health Sciences Center dell'Università dell'Oklahoma (IRB 14377).

1. Preparazione all'isolamento, al passaggio e alla coltura ALI di nTAEC

  1. Preparazione dei terreni
    1. Terreno epiteliale bronchiale delle vie aeree (BLEAM) con inibitori (BLEAM-I): preparare 500 ml (1 flacone, conservato a 4 °C) di BLEAM aggiungendo 1,25 ml di integratore HLL (500 μg/mL di albumina sierica umana, 0,6 μM di acido linoleico, 0,6 μg/mL di lecitina), 15 ml di L-glutammina (6 mM), 2 ml di estratto P (0,4%, estratto ipofisario bovino), 5 ml di TM1 (1 μM di adrenalina, 5 μg/mL di transferrina, 10 nM di triiodotironina, 0,1 μg/mL di idrocortisone, 5 ng/mL di fattore di crescita epidermico (EGF), 5 ng/mL di insulina), 1 mL di soluzione antibiotica (Normocin, 0,1 mg/mL). Per prevenire la senescenza delle cellule primarie e migliorare l'efficienza dell'espansione, aggiungere i seguenti inibitori del fattore di crescita come precedentemente descritto39: Y-27632 (proteina chinasi Rho-associata o inibitore ROCK) con una concentrazione finale di 5 μM, A83-01 (inibisce la segnalazione di Smad) con una concentrazione finale di 1 μM, CHIR 99021 (glicogeno sintasi chinasi-3 o inibitore di GSK3) con una concentrazione finale di 0,4 μM e Rapamicina (inibitore del bersaglio molecolare della rapamicina o mTOR) con un finale concentrazione di 5 nM. Filtrare il terreno attraverso un filtro poroso da 0,22 μm. Fare riferimento alla Tabella 1 per un elenco dei componenti multimediali.
    2. Terreno ALI a cellule epiteliali bronchiali/tracheali umane (HBTEC): preparare 500 ml di terreno HBTEC scongelando il flacone a 37 °C e aggiungendo 1 ml di soluzione antibiotica (Normocin, 0,1 mg/mL). Una volta aggiunto, filtrare il terreno attraverso un filtro poroso da 0,22 μm.
    3. Terreni HBTEC con inibitori (HBTEC-I): Preparare i supporti HBTEC come sopra. Prima di filtrare, aggiungere i seguenti inibitori: Y-27632 con una concentrazione finale di 5 μM e A83-01 con una concentrazione finale di 0,5 μM. Filtrare il mezzo attraverso un filtro poroso da 0,22 μm.
      NOTA: Conservare i terreni BLEAM-I, HBTEC e HBTEC-I a 4 °C, datati ed etichettati, al buio (avvolti in un foglio di alluminio) e riscaldare solo le aliquote necessarie (la durata di conservazione è di 30 giorni).
    4. HEPES/FBS: aggiungere 500 mL di soluzione salina tamponata con HEPES e 88 mL di FBS (la concentrazione finale è del 15%). Una volta aggiunta, filtrare la soluzione attraverso un filtro poroso da 0,22 μm e conservarla a 4 °C, datata ed etichettata.
      NOTA: Aliquotare e scaldare BLEAM, HEPES-FBS e Tripsina-EDTA a 37 °C (almeno 30 minuti) prima dell'uso.
  2. Palloni di coltura di rivestimento e inserti per colture cellulari ALI con un terreno condizionato 804G
    1. Preparare terreni condizionati con matrice di cellule 804G (linea cellulare epiteliale della vescica di ratto) come descritto in precedenza39.
    2. Rivestire il matraccio per colture cellulari e i foglietti illustrativi per colture cellulari con terreno condizionato a 804G per almeno 4 ore nell'incubatore a 37 °C, CO2 al 5%. Fare riferimento alla Tabella 2 per le quantità di terreno necessarie per rivestire i diversi palloni di coltura e inserti per colture cellulari.

2. Isolamento ed espansione dei nTAEC e preparazione per la successiva coltura di ALI

  1. Acquisire un aspirato tracheale fresco (circa 1 ml) durante l'aspirazione di routine del tubo endotracheale dei neonati intubati e raccogliere l'aspirato in una trappola per muco. Se il volume di aspirazione è insufficiente per raggiungere la trappola del muco, sciacquare il catetere di aspirazione con 1-3 ml di soluzione fisiologica sterile.
  2. Etichettare il campione e conservarlo in un sacchetto per il rischio biologico sul ghiaccio.
    NOTA: I campioni possono essere conservati con ghiaccio a 4 °C per un massimo di 24 ore. Tuttavia, la resa è maggiore con campioni freschi.
  3. Trasportare il campione dalla terapia intensiva neonatale al laboratorio. Rivestire un matraccio T25 con terreno condizionato con 804G e prepararsi per l'inoculazione del campione al momento del trasporto dell'aspirato tracheale in laboratorio.
  4. Rimuovere la trappola per il muco dalla sacca per il rischio biologico e pulire accuratamente le superfici esterne con etanolo al 70% per evitare qualsiasi contaminazione. Aprire con cautela il tappo della trappola per muco sotto una cappa sterile per colture cellulari.
  5. Diluire il campione di aspirato tracheale con PBS sterile a 5 mL (per diluire il muco) e trasferire l'intero contenuto in una provetta conica da 50 mL.
  6. Centrifugare la provetta a 250 x g, 20 °C-23 °C per 5 minuti ed eliminare il surnatante (compreso il muco).
    NOTA: Tutte le centrifugazioni qui vengono eseguite a 250 x g, 20 °C-23 °C per 5 minuti, se non diversamente specificato.
  7. Risospendere il pellet in 5 mL di BLEAM-I.
  8. Rimuovere il pallone T25 dall'incubatore ed eliminare il terreno condizionato 804G prima di placcare il campione.
  9. Placcare il campione nel pallone T25 e metterlo nell'incubatore a 37 °C, 5% di CO2 (questo sarà chiamato Passaggio 0 o P0).
  10. Sostituire il fluido con BLEAM-I 24 ore dopo la placcatura per lavare le celle non attaccate e successivamente ogni 48 ore.
    NOTA: Dopo aver processato il campione di aspirato tracheale e averlo incubato in terreno BLEAM-I, le cellule di forma cuboidale compaiono 7-10 giorni dopo la placcatura. Entro circa 3 settimane dalla placcatura, le celle sono densamente impacchettate e richiedono la tripsinizzazione per il successivo passaggio, espansione e conservazione. Le celle di passaggio precoce (P1 - P2) vengono poste in crioprovette (2,5 x 10,6 cellule per 500 μL di terreno di congelamento per criotubo) e conservate in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
  11. Scongelare rapidamente le cellule congelate dall'azoto liquido in un bagno d'acqua a 37 °C e trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile di dimensioni adeguate contenente BLEAM-I.
  12. Contare le cellule per determinare il numero totale e vivo di cellule utilizzando una macchia blu di tripano e un contatore di cellule automatico o manuale come descritto in precedenza48. Diluire la sospensione cellulare con un volume appropriato di BLEAM-I, in modo che la concentrazione finale sia 2,1 x 106 cellule in 15 mL di sospensione cellulare (per il pallone T75).
    NOTA: Per un matraccio T25, per la semina vengono generalmente utilizzate0,7 x 10 6 cellule in 5 mL di sospensione cellulare.
  13. Trasferire la sospensione cellulare da 15 mL in un matraccio T75 e incubare per una notte a 37 °C, 5% CO2.
  14. La mattina seguente, scambia i media con il nuovo BLEAM-I. Quindi, sostituisci il supporto con un nuovo BLEAM-I ogni 2 giorni. Una volta che le cellule sono intorno all'80%-90%, sono pronte per essere tripsinizzate per la coltura di ALI.
  15. Applicare 5 mL di tripsina-EDTA (T75) sul monostrato cellulare.
    NOTA: Ricordarsi di utilizzare tripsina fresca. Evitare l'uso di tripsina che è stata riscaldata più volte.
  16. Incubare il matraccio a 37 °C per 5 minuti nell'incubatore. Quindi, picchiettare il lato del pallone 8x-10x per rimuovere le celle. Controllare al microscopio per confermare che le cellule siano state rimosse dopo la tripsinizzazione. Se sul pallone rimane il >50% delle cellule, lavare con PBS 2x e ripetere la fase di tripsinizzazione con un tempo di incubazione ridotto di 2-3 minuti.
  17. Arrestare la reazione con 15 mL di HEPES-FBS e pipettare su e giù 4x-5x. Trasferire le cellule in una provetta sterile di dimensioni adeguate e centrifugare a 250 x g per 5 minuti per pellettare le cellule.
  18. Dopo la centrifugazione, aspirare con cura il surnatante. Sciogliere il pellet cellulare in 1 mL di BLEAM-I pipettandolo delicatamente su e giù 5x-10x.
  19. Conta le celle per determinare il numero totale e il numero di cellule vive. Diluire la sospensione cellulare con un volume appropriato di BLEAM-I, in modo che la concentrazione finale sia 1 x 105 cellule vive per 100 μl di sospensione cellulare.

3. Cultura ALI dei nTAEC

NOTA: I foglietti illustrativi per colture cellulari devono essere rivestiti con terreno condizionato con 804G e incubati per almeno 4 ore a 37 °C, 5% di CO2 prima della fase successiva (vedere la fase 1.2).

  1. Rimuovere le piastre per colture cellulari a 24 pozzetti contenenti gli inserti per colture cellulari dall'incubatore ed eliminare il terreno condizionato con 804G.
  2. Aggiungere 1 mL di BLEAM-I nella camera basolaterale (inferiore) di ciascun pozzetto di ALI. Aggiungere 100 μL di sospensione cellulare (1 x 105 cellule) alla camera apicale degli inserti di coltura cellulare ALI e incubare le cellule a 37 °C, 5% CO2. Questa fase è definita come ALI giorno -2.
  3. Il giorno seguente, sostituire il terreno nelle camere basolaterale (1 mL) e apicale (100 μL) con BLEAM-I fresco. Quando si cambia il terreno nella camera apicale, fare attenzione a non disturbare il monostrato cellulare. Questa fase è definita come ALI giorno -1.
  4. Il giorno seguente, rimuovere il terreno sia dalla camera basolaterale che da quella apicale.
    NOTA: Occorrono 2 giorni affinché le cellule sulla membrana della coltura cellulare diventino confluenti in condizioni di immersione. In questa fase, ALI può essere costituito.
  5. Aggiungere 1 mL di terreno HBTEC-I alla camera basolaterale, ma lasciare il terreno della camera apicale libero ed esposto all'aria. Questa fase è definita come ALI giorno 0.
  6. Continuare a sostituire il terreno HBTEC-I (1 mL) nella camera basolaterale ogni 48 ore dal giorno 0 al giorno 6 dell'ALI. Passare ai normali terreni HBTEC (senza inibitori) il giorno 7 di ALI fino al momento di raccolta desiderato.
    NOTA: Durante i primi 7 giorni di coltura ALI, i terreni dalla camera basolaterale possono fuoriuscire nella camera apicale. Questo terreno deve essere aspirato con cura ogni giorno per mantenere la salute dello strato cellulare e consentire loro di differenziarsi.
  7. Raccogli cellule, inserti di colture cellulari e terreni basolaterali in diversi punti temporali per tecniche molecolari, saggi e analisi.
    1. Per questo protocollo, nei giorni ALI 0, 7 e 28, prelevare le cellule per l'analisi dell'espressione genica qPCR (protocollo standard del produttore) dei marcatori di differenziazione epiteliale. Nei giorni 0, 7, 14 e 28 dell'ALI, raccogliere i foglietti di coltura cellulare per testare la funzione di barriera (metodi descritti di seguito).
    2. Nei giorni 0 e 28 dell'ALI, utilizzare inserti di coltura cellulare fissati in formalina per la colorazione immunofluorescente con marcatori di differenziazione epiteliale (utilizzando il protocollo precedentemente pubblicato)49. Il giorno 14 dell'ALI, raccogliere i terreni basolaterali per il rilascio di lattato deidrogenasi (LDH) (protocollo standard del produttore), i lisati cellulari per la qPCR dei marcatori di stress ossidativo e l'immunoblot con anticorpi caspasi-3 e caspasi-3 scissa (protocollo standard del produttore) e inserti di coltura cellulare per il test dello stress ossidativo (metodo descritto di seguito).

4. Test della funzione di barriera durante la differenziazione ALI

  1. Misurazione della resistenza elettrica transepiteliale (TEER)
    NOTA: Misurare il TEER utilizzando l'EVOM (Epithelial Volt/Ohm Meter) durante la differenziazione dell'ALI per valutare l'integrità dello strato cellulare50.
    1. Prima di misurare i valori di resistenza del filtro di prova, utilizzare una coltura cellulare rivestita con terreno condizionato 804G (priva di cellule) per misurare il valore di resistenza di fondo in Ohm (Ω)
    2. Sottrarre il valore della resistenza di fondo dai valori di resistenza del filtro di prova e moltiplicare la differenza per l'area della superficie di crescita cellulare per ottenere il valore TEER per ciascun filtro di prova.
      TEER = (ΩT - ΩB) X C
      TEER = Resistenza elettrica transepiteliale (Ω.cm2)
      ΩT = Valore di resistenza del filtro di prova (Ω)
      ΩB = Valore della resistenza di fondo (Ω)
      C = Superficie di crescita cellulare (cm2)
      NOTA: Gli inserti per colture cellulari utilizzati per le misurazioni TEER vengono successivamente fissati con formalina tamponata al 10% e utilizzati immediatamente per la colorazione in immunofluorescenza e la microscopia a fluorescenza (metodo descritto di seguito) o conservati a 4 °C per la colorazione successiva.
  2. Saggio di permeabilità epiteliale della fluoresceina isetionato destrano (FITC-destrano)
    NOTA: Il test di permeabilità epiteliale è stato eseguito utilizzando due diversi pesi molecolari di FITC-destrano (10 kD e 20 kD) durante la differenziazione di ALI.
    1. Preparare la soluzione di lavoro FITC-destrano (1 mg/mL): misurare 5 mg di FITC e miscelare 1 mL di DMSO (5 mg/mL). Risospendere 5 mg/mL in terreno HBTEC riscaldato a 37 °C a una concentrazione di 1 mg/mL. Proteggere la soluzione dalla luce.
    2. Trasferire i filtri di prova (contenenti cellule) in una nuova piastra a 12 pozzetti e aggiungere 1 mL di terreno HBTEC nello scomparto basolaterale.
    3. Aspirare il terreno dello scomparto apicale (se presente) e sostituirlo con 250 μL di soluzione di lavoro FITC-destrano. Incubare a temperatura ambiente al riparo dalla luce per 60 min.
    4. Terminare il test FITC-destrano rimuovendo i filtri di prova (contenenti soluzione di lavoro FITC-destrano) dalla piastra a 12 pozzetti.
    5. Raccogliere il terreno basolaterale dalla piastra a 12 pozzetti in provette da microcentrifuga da 1,5 mL e vortex.
    6. Trasferire 100 μl di aliquote da ciascuna provetta in una micropiastra di polistirene nero a fondo trasparente a 96 pozzetti in triplicati. Trasferire 100 μl di terreno HBTEC in pozzetti aggiuntivi nella piastra a 96 pozzetti come controllo negativo per misurare la fluorescenza di fondo.
    7. Misura l'intensità della fluorescenza utilizzando uno spettrofotometro che utilizza un'eccitazione di 490 nm e un massimo di emissione di 520 nm.
    8. Sottrarre il valore medio della fluorescenza di fondo dai valori di fluorescenza del filtro di prova per ottenere una fluorescenza corretta ed esprimere i valori in percentuale rispetto ai valori di fluorescenza corretti al giorno 0 di ALI per FITC 10 kD e 20 kD.

5. Esposizione all'iperossia utilizzando l'incubatore TriGas

  1. Il giorno 7 dell'ALI, determinare il numero di inserti di coltura cellulare da mettere in iperossia in base alle esigenze sperimentali e di raccolta.
  2. Impostare il livello di O2 nell'incubatore TriGas al 60% di O2. In genere ci vogliono ~30-45 minuti perché il livello di O2 raggiunga il 60%.
  3. Una volta che il livello di O2 si stabilizza al 60%, posizionare la piastra per colture cellulari a 24 pozzetti con gli inserti per colture cellulari assegnati al gruppo iperossia all'interno dell'incubatore e chiudere lo sportello dell'incubatore.
    NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito nel modo più efficiente possibile per evitare un calo significativo del livello di O2 all'interno dell'incubatrice.
  4. Cambiare i terreni negli inserti di coltura cellulare esposti all'iperossia seguendo lo stesso programma dei pozzetti di controllo (21% O2 esposti). Controllare ogni giorno che gli inserti per colture cellulari non presentino perdite di terreno e aspirare delicatamente eventuali perdite nella camera di coltura cellulare.
  5. Continuare l'esposizione all'iperossia per 7 giorni (ALI giorni da 7 a 14). Una volta completata l'esposizione all'iperossia, raccogliere le cellule o eseguire saggi utilizzando inserti di coltura cellulare il giorno 14 di ALI.

6. Saggio dello stress ossidativo per valutare gli effetti dell'iperossia

NOTA: Abbiamo utilizzato il kit di analisi CM-H2DCFDA e misurato l'intensità della fluorescenza il giorno 14 di ALI come marcatore di stress ossidativo negli inserti di coltura cellulare dopo l'esposizione all'O2 . L'H2DCFDA è una forma chimicamente ridotta e acetilata di 2',7'-diclorofluoresceina (DCF), che è un indicatore delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) pervenute alle cellule vive. CM-H2DCFDA è il derivato clorometilico tiolo-reattivo di H2DCFDA, che promuove un ulteriore legame covalente ai componenti intracellulari, consentendo una più lunga ritenzione del colorante all'interno della cellula. Queste molecole non sono fluorescenti fino a quando i gruppi acetato non vengono rimossi dall'azione delle esterasi intracellulari e si verifica l'ossidazione nella cellula51. Dopo l'ossidazione intracellulare, l'aumento risultante della fluorescenza può essere misurato con un microscopio a fluorescenza come misura surrogata dello stress ossidativo cellulare52. Il reagente è leggero e sensibile all'aria e quindi deve essere protetto dalla luce e mantenuto ermetico il più possibile.

  1. Preparazione della soluzione di dosaggio CM-H2DCFDA: Ogni fiala contiene 50 μg di colorante reagente in polvere. Per ottenere una soluzione madre da 1 mM, aggiungere 80 μL di DMSO sterile alla fiala, mescolare bene con una pipetta e agitare delicatamente. Per una concentrazione finale di 1 μM del colorante negli inserti per colture cellulari, aggiungere 0,1 μL di 1 mM di stock per 100 μL di PBS (ad esempio, aggiungere 0,6 μL di soluzione madre a 600 μL di PBS per 6 inserti per colture cellulari).
    NOTA: La concentrazione finale del colorante può variare tra 1 e 5 μM. La dose deve essere ottimizzata per ogni condizione di coltura.
  2. Aggiungere 100 μl della soluzione colorante da 1 μM in ciascuna coltura cellulare sia per il gruppo esposto all'iperossia che per il gruppo esposto alla normossia. Utilizzare almeno 1 coltura cellulare come controllo negativo da ciascun gruppo di trattamento (100 μL di PBS senza colorante). Incubare a 37 °C per 30 minuti, al riparo dalla luce. Lavare 1 volta con PBS.
  3. Preparazione del vetrino: Scolare il PBS in eccesso. Tenere con cura gli inserti della coltura cellulare e utilizzare una lama per tagliare lentamente la membrana della coltura cellulare. Versare 1-2 gocce di liquido montante sul vetrino. Con una pinza a punta piatta, afferrare con cura l'angolo della membrana, posizionarla con la cellula rivolta verso il basso sul montante e coprirla con un vetrino coprioggetti. Rimuovere il liquido di montaggio in eccesso e lasciare asciugare all'aria per 15 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Le diapositive sono ora pronte per essere visualizzate.
    NOTA: La preparazione del vetrino e della microscopia fluorescente deve essere eseguita il più velocemente possibile poiché l'intensità della fluorescenza diminuisce significativamente nell'arco di 2-3 ore.
  4. Microscopia a fluorescenza: Acquisizione di immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza utilizzando il canale Cy2 (cianine-2). Acquisisci immagini da tre aree separate e non sovrapposte per coltura cellulare.
  5. Rilevamento fluorescente dello stress ossidativo
    NOTA: Utilizzare le immagini della microscopia a fluorescenza fluorescente per misurare la fluorescenza cellulare totale corretta (CTCF) utilizzando il software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) e il flusso di lavoro descritto di seguito. CTCF funge da marcatore per lo stress ossidativo negli inserti di coltura cellulare in seguito all'esposizione all'iperossia e viene misurato eliminando la fluorescenza di fondo con l'aiuto del software ImageJ.
    1. Aprire l'immagine al microscopio in ImageJ e selezionare l'area di interesse utilizzando lo strumento rettangolo. Salva l'area di selezione (α) facendo clic con il pulsante destro del mouse e seleziona Aggiungi al gestore ROI (regione di interesse). Utilizzare quest'area di selezione tra le immagini.
    2. Selezionare i parametri per la misurazione in Analizza > Imposta misurazioni e selezionare Area, Densità integrata e Valore medio di grigio nella scheda delle impostazioni.
    3. Per ogni immagine, utilizza la stessa area di selezione dal gestore ROI e seleziona Analizza > misura. Il valore di densità integrato rappresenta la fluorescenza totale (Ft) dell'area selezionata. Annotare i valori di misurazione dalla finestra pop-up.
    4. Per correggere la fluorescenza di fondo (Fb) in ogni immagine, selezionare una piccola area di regione non fluorescente con lo strumento rettangolo. Selezionare Analizza > Misura per questa regione. Il valore medio dell'intensità rappresenta Fb. Annotare i valori di misurazione dalla finestra pop-up.
    5. Calcola CTCF moltiplicando l'intensità media di fluorescenza delle letture di fondo per l'area totale del ROI e sottraendo questo numero dal valore di densità integrato del ROI. Ripetere questo flusso di lavoro per tutte le immagini per entrambi i gruppi di trattamento (Controllo e Iperossia).
      CTCF = Ft - (Fb x α)
      CTCF = Fluorescenza cellulare totale corretta (U.A.)
      Ft = fluorescenza totale
      Fb = Fluorescenza di fondo
      α = Area di selezione

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Risultati

Per isolare gli nTAEC, abbiamo raccolto aspirati tracheali da neonati intubati nella terapia intensiva neonatale e trasportato gli aspirati su ghiaccio in laboratorio per un'ulteriore elaborazione (Figura 1A). Dopo aver seminato i campioni di aspirato tracheale in un terreno di crescita epiteliale delle vie aeree (BLEAM-I contenente inibitori di Rho/Smad, GSK3 e mTOR), le cellule cuboidali sono comparse entro 7-10 giorni. En...

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Discussione

Il protocollo qui descritto descrive in dettaglio un metodo per la raccolta e l'elaborazione di campioni di aspirato tracheale neonatale da neonati intubati in terapia intensiva neonatale con successivo isolamento ed espansione di nTAEC vivi da questi campioni utilizzando metodi precedentemente stabiliti39. Inoltre, abbiamo descritto un metodo per la coltura di nTAEC su ALI e la caratterizzazione della loro differenziazione in un epitelio mucociliare polarizzato d...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare e nessun conflitto di interessi da segnalare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è supportato da finanziamenti della Presbyterian Health Foundation (PHF) e dell'Oklahoma Shared Clinical and Translational Resources (U54GM104938 con un Institutional Development Award (IDeA) da NIGMS) ad AG. Vorremmo ringraziare il Dr. Paul LeRou e il Dr. Xingbin Ai del Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, per aver fornito cellule di donatori neonatali utilizzate in alcuni degli esperimenti. Le figure sono state create con Biorender. L'analisi statistica è stata eseguita con GraphPad Prism.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
10% Buffered FormalinFisher Scientific23-426796
1X PBS (Phosphate Buffered Saline) Solution, pH 7.4Gibco10010049
A 83-01Tocris29-391-0
ALI Transwell Inserts, 6.5mmCorning3470
Anti-Acetylated Tubulin antibody, Mouse monoclonalSigmaT7451
Anti-alpha Tubulin antibodyAbcamab7291
Anti-Cytokeratin 5 antibodyAbcamab53121
BronchiaLife Epithelial Airway Medium (BLEAM)LifeLine Cell TechnologyLL-0023
CHIR 99021Tocris44-231-0
Cleaved caspase-3 antibodyCell signaling9664T
SCGB1A1 or Club Cell Protein (CC16) Human, Rabbit Polyclonal AntibodyBioVendor R&DRD181022220-01
CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator)Thermo ScientificC6827
Corning Cell Culture Treated T25 FlasksCorning430639
Corning U-Shaped Cell Culture T75 FlasksCorning430641U
CyQUANT LDH Cytotoxicity AssayThermo ScientificC20300
DAPI Solution (1 mg/mL)Fisher ScientificEN62248
Dimethyl sulfoxide [DMSO] Hybri-MaxSigmaD2650
Distilled waterGibco15230162
EVOM Manual for TEER MeasurementWorld Precision InstrumentEVM-MT-03-01
FBS (Fetal Bovine Serum)Gibco10082147
Fluorescein Isothiocyanate Dextran (average mol wt 10,000)Fisher ScientificF0918100MG
Fluorescein isothiocyanate–dextran (average mol wt 20,00)SigmaFD20-100MG
Goat Anti-Mouse IgG(H+L), Human ads-HRPSouthern Biotech1031-05
Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488InvitrogenA-21141
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546InvitrogenA-11035
Goat Anti-Rabbit IgG(H+L), Mouse/Human ads-HRPSouthern Biotech4050-05
HBTEC Air-Liquid Interface (ALI) Differentiation MediumLifeLine Cell TechnologyLM-0050
HEPESLonzaCC-5024
Heracell VIOS 160i Tri-Gas CO2 Incubator, 165 LThermo Scientific51030411
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitThermo Scientific4368814
HLL supplementLifeLine Cell TechnologyLS-1001
ImageJNIHN/Aimagej.nih.gov/ij/
Invivogen Normocin - Antimicrobial ReagentFisher ScientificNC9273499
L-GlutamineLifeLine Cell TechnologyLS-1013
Normal Goat SerumGibcoPCN5000
NormocinInvivogenant-nr-05
p63 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-25268
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP36930
PureLink RNA Mini KitThermo Scientific12183025
RAPAMYCINThermo ScientificAAJ62473MC
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Scientific4444964
Taqman Gene Exression Assays: 18S rRNAThermo ScientificHs99999901_s1
Taqman Gene Exression Assays: CATThermo ScientificHs00156308_m1
Taqman Gene Exression Assays: FOXJ1Thermo ScientificHs00230964_m1
Taqman Gene Exression Assays: GAPDHThermo ScientificHs02786624_g1
Taqman Gene Exression Assays: GPX1Thermo ScientificHs00829989_gH
Taqman Gene Exression Assays: GPX2Thermo ScientificHs01591589_m1
Taqman Gene Exression Assays: GPX3Thermo ScientificHs01078668_m1
Taqman Gene Exression Assays: KRT5Thermo ScientificHs00361185_m1
Taqman Gene Exression Assays: MUC5ACThermo ScientificHs01365616_m1
Taqman Gene Exression Assays: SCGB1A1Thermo ScientificHs00171092_m1
Taqman Gene Exression Assays: SOD1Thermo ScientificHs00533490_m1
Taqman Gene Exression Assays: SOD2Thermo ScientificHs00167309_m1
Thermo Scientific Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane (0.22 μm pores, 500 ml)Thermo Scientific5660020
TM-1 Combined SupplementLifeLine Cell TechnologyLS-1055
Total caspase-3 antibodyCell signaling14220S
Triton X-100Sigma9036-19-5
Trypsin-EDTA (0.05%), Phenol redGibco25300062
Y-27632 2 HClTocris12-541-0

Riferimenti

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