Microgoffratura: un processo conveniente per la fabbricazione di microcanali su microfluidica a base di carta nanocellulosica

Riepilogo

Questo protocollo descrive un processo semplice che utilizza comodi microstampi in plastica per semplici operazioni di microgoffratura per fabbricare microcanali su carta di cellulosa nanofibrillata, raggiungendo una larghezza minima di 200 μm.

Abstract

La nanocarta, derivata dalla cellulosa nanofibrillata, ha suscitato un notevole interesse come materiale promettente per applicazioni microfluidiche. Il suo fascino risiede in una gamma di qualità eccellenti, tra cui una superficie eccezionalmente liscia, un'eccezionale trasparenza ottica, una matrice uniforme di nanofibre con porosità su scala nanometrica e proprietà chimiche personalizzabili. Nonostante la rapida crescita della microfluidica basata su nanocarta, le attuali tecniche utilizzate per creare microcanali su nanocarta, come la stampa 3D, il rivestimento a spruzzo o il taglio e l'assemblaggio manuale, che sono cruciali per le applicazioni pratiche, possiedono ancora alcune limitazioni, in particolare la suscettibilità alla contaminazione. Inoltre, questi metodi sono limitati alla produzione di canali di dimensioni millimetriche. Questo studio introduce un processo semplice che utilizza comodi micro-stampi in plastica per semplici operazioni di microgoffratura per fabbricare microcanali su nanocarta, raggiungendo una larghezza minima di 200 μm. Il microcanale sviluppato supera gli approcci esistenti, ottenendo un miglioramento di quattro volte, e può essere fabbricato in 45 minuti. Inoltre, i parametri di fabbricazione sono stati ottimizzati e viene fornita una comoda tabella di riferimento rapido per gli sviluppatori di applicazioni. È stato dimostrato il proof-of-concept per un miscelatore laminare, un generatore di gocce e dispositivi analitici funzionali basati su nanocarta (NanoPAD) progettati per il rilevamento della rodamina B utilizzando la spettroscopia Raman potenziata dalla superficie. In particolare, i NanoPAD hanno mostrato prestazioni eccezionali con limiti di rilevamento migliorati. Questi risultati eccezionali possono essere attribuiti alle proprietà ottiche superiori della nanocarta e all'accurato metodo di microgoffratura recentemente sviluppato, che consente l'integrazione e la messa a punto dei NanoPAD.

Introduzione

Recentemente, la carta di cellulosa nanofibrillata (NFC) (nanocarta) è emersa come un materiale di substrato molto promettente per varie applicazioni come l'elettronica flessibile, i dispositivi energetici e i biomedici 1,2,3,4. Derivata da piante naturali, la nanocarta è economica, biocompatibile e biodegradabile, il che la rende un'alternativa interessante alla tradizionale carta di cellulosa ^5,6. Le sue eccezionali proprietà includono una superficie ultra-liscia con una rugosità superficiale inferiore a 25 nm e una struttura a matrice di cellulosa densa, che consente la creazione di nanostrutture altamente strutturate⁷. Abbondanti gruppi ossidrilici di nanocarta contribuiscono alla sua struttura nanocellulosica compatta e compatta⁸. La nanocarta presenta un'eccellente trasparenza ottica e una minima foschia ottica, il che la rende adatta per i sensori ottici. Inoltre, la sua idrofilia intrinseca consente un flusso senza pompa, anche con la sua struttura spessa, fornendo un movimento autonomo del fluido ^9,10. La nanocellulosa ha diverse applicazioni in sensori biologici, dispositivi elettronici conduttivi, piattaforme di coltura cellulare, supercondensatori, batterie e altro ancora, dimostrando la sua versatilità e il suo potenziale^11,12. In particolare, la nanocellulosa è promettente per i dispositivi microfluidici analitici (μPAD) a base di carta, offrendo vantaggi unici rispetto alla carta per cromatografia convenzionale.

Nell'ultimo decennio, i μPAD hanno attirato un'attenzione significativa grazie alla loro convenienza, biocompatibilità, funzionamento senza pompa e facilità di produzione^13,14. Questi dispositivi sono emersi come efficaci strumenti diagnostici point-of-care, in particolare in contesti con risorse limitate^15,16,17. Un progresso significativo in questo campo è stato lo sviluppo della stampa a cera, introdotta da George Whitesides¹⁸ e dal gruppo Bingcheng Lin¹⁹, che ha permesso la creazione di μPAD funzionali incorporando microcanali su carta cromatografica. Successivamente, i μPAD si sono evoluti rapidamente e varie tecniche di biorilevamento, tra cui i metodi elettrochimici 20, la chemiluminescenza²¹ e il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA)22,23,24, sono state implementate con successo per il rilevamento di diversi biomarcatori come proteine 25,26, DNA 27,28, RNA ^29,30 e esosomi³¹. Nonostante questi risultati, i μPAD devono ancora affrontare delle sfide, tra cui la bassa velocità di flusso e l'evaporazione del solvente.

Sono stati proposti diversi metodi per la creazione di microcanali su nanocarta^32,33,34. Un approccio prevede la stampa 3D di ingredienti sacrificali nel materiale, ma richiede un rivestimento idrofobico che limiti il funzionamento senza pompa³³. Un'altra tecnica prevede l'impilamento manuale degli strati di canale tra i fogli di nanocarta utilizzando la colla, che richiede molto lavoro³². In alternativa, il rivestimento a spruzzo di fibre di nanocellulosa su stampi pre-strutturati può creare microcanali, ma comporta una preparazione dello stampo lunga e costosa³⁴. In particolare, questi metodi sono limitati a microcanali su scala millimetrica, compromettendo i vantaggi dei dispositivi microfluidici per quanto riguarda il consumo e l'integrazione del volume dei reagenti. Lo sviluppo di un semplice processo di modellazione a microcanali di nanocarta con risoluzione su scala micrometrica rimane una sfida.

Questo studio presenta un metodo unico di modellazione a microcanali di nanocarta basato sulla microgoffratura pratica. L'approccio offre diversi vantaggi rispetto ai metodi esistenti, in quanto non richiede attrezzature costose o specializzate, è semplice, economico e altamente accurato. Uno stampo a microcanali convesso viene fabbricato tagliando al laser un film di politetrafluoroetilene (PTFE), noto per la sua inerzia chimica e le sue proprietà antiaderenti. Questo stampo viene quindi utilizzato per imprimere microcanali su una membrana di gel di nanocarta. Un secondo strato di gel di nanocarta viene applicato sulla parte superiore per creare canali cavi chiusi. Utilizzando questa tecnica di patterning, vengono sviluppati dispositivi microfluidici fondamentali su nanocarta, tra cui un miscelatore laminare e un generatore di gocce. Inoltre, viene dimostrata la fabbricazione di nanoPAD per microscopia Raman potenziata dalla superficie (SERS). La creazione in situ di un substrato SERS a base di nanoparticelle d'argento si ottiene introducendo due reagenti chimici (AgNO₃ e NaBH₄) nei canali, ottenendo prestazioni notevoli con bassi limiti di rivelazione (LOD).

Protocollo

1. Processo di microgoffratura per la modellazione di microcanali su nanocarta

1. Preparazione dello stampo
   NOTA: Fare riferimento a Yuan et ^al.12 per i dettagli sulla preparazione dello stampo.
   1. Preparare una pellicola in PTFE come indicato nella tabella dei materiali.
   2. Tagliare al laser la pellicola di PTFE preparata per realizzare uno stampo a microcanali convesso (Figura 1A-I).
      NOTA: Le dimensioni dello stampo in PTFE determinano le dimensioni del microcanale (Figura 2E,F) in una relazione di funzione lineare del primo ordine.
2. Preparazione della nanocarta
   1. Disperdere 4,0 g di gel NFC ossidato (2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-il)ossile (TEMPO) in acqua distillata (vedi tabella dei materiali) (concentrazione finale dello 0,1% in peso).
   2. Agitare abbondantemente la sospensione a 120,8 x g per 30 minuti a temperatura ambiente fino a quando non sono visibili fiocchi di cellulosa.
   3. Filtrare sottovuoto la sospensione trasparente per ottenere un gel di nanocarta (Figura 1A-II).
      NOTA: In questo esempio, il diametro del gel di nanocarta ottenuto è di 4 cm. I NanoPAD possono essere adattati a varie applicazioni selezionando dispositivi di filtrazione ad aspirazione con raggi diversi, consentendo la progettazione di NanoPAD su scale diverse.
3. Goffratura di gel di nanocarta
   1. Posiziona lo stampo in PTFE sulla superficie del gel di nanocarta.
   2. Goffrare il gel di nanocarta (Figura 1A-III) utilizzando lo stampo in PTFE con la pressa a caldo per 10 minuti ogni volta a pressione e temperatura ottimizzate (Figura 2A-D).
      NOTA: Una pressione di goffratura più elevata (da 250 kPa a 1000 kPa) migliora la precisione di fabbricazione, ma non deve superare i 1000 kPa per evitare danni alla struttura in cellulosa. Temperature di goffratura più elevate (25-100 °C) migliorano la precisione dei microcanali promuovendo la disidratazione e la decarburazione, ma le temperature non devono superare i 75 °C per evitare la formazione di pieghe del gel e una ridotta trasmissione della luce⁷. In questo esempio, i parametri di goffratura ottimizzati erano 750 kPa e 75 °C.
4. Sgancio dello stampo
   1. Staccare un ulteriore strato di gel di nanocarta filtrante dalla membrana filtrante (Figura 1A-IV).
5. Legame
   1. Attaccate lo strato staccato sopra lo strato goffrato di gel di nanocarta, impilando i due strati per creare una struttura a microcanali cava (Figura 1A-V).
      NOTA: Il legame idrogeno più forte nella nanocarta "gelatinosa" rispetto alla sospensione di fibre e alla nanocarta essiccata migliora l'aggrovigliamento e l'adesione delle fibre di nanocellulosa. Di conseguenza, due strati di nanocarta "gelatinosa" possono legarsi strettamente attraverso l'autodiffusione senza forza esterna.
6. Essiccazione
   1. Porre i due strati di gel di nanocarta in un forno di essiccazione a 75 °C per circa 30 minuti (Figura 1A-VI).

2. Costruzione di dispositivi microfluidici fondamentali

1. Costruzione del miscelatore laminare
   1. Preparare i NanoPAD con canali dritti e curvi (Figura 3A) seguendo il passaggio 1.
      NOTA: In questo esempio, le dimensioni dei canali sono di 1 mm di larghezza e 50 μm di profondità.
   2. Aggiungere contemporaneamente goccioline rosse e blu nelle zone di ingresso, consentendo il flusso automatico attraverso il canale cavo.
      NOTA: Il successo del flusso indipendente delle soluzioni rosse e blu in un canale rettilineo e la loro miscelazione all'estremità del canale curvo può essere attribuito al basso numero di Reynolds degli strati nei dispositivi microfluidici e al flusso radiale indotto dallo sforzo di taglio³⁵.
2. Costruzione del generatore di gocce
   1. Preparare i NanoPAD a due ingressi con un canale di giunzione a T (Figura 3D) secondo il passaggio 1.
   2. Introdurre acqua ed esacano (olio), due liquidi immiscibili, nelle due zone di ingresso del canale di giunzione a T per generare goccioline (Figura 3E).
      NOTA: In questo esempio, le dimensioni del canale di giunzione a T sono 1 mm di larghezza, 25 mm di lunghezza e 50 μm di profondità.
   3. Fissare la velocità di Q 1 a 6 μL/min e la velocità di Q₂ a n × Q 1 (n =_1-6). Utilizzare due pompe a siringa e impostarle alla velocità sopra indicata per iniettare acqua e olio. Questo comportamento è governato dall'unica semplice equazione di scala (fornita di seguito).
      NOTA: In questo esempio, olio e acqua colorata sono stati versati nel canale³⁶.
      
      Dove α = 1, β = 1, L è la lunghezza, W è la larghezza della gocciolina e Q₁ e Q₂ sono le portate dell'acqua e dell'esadecano, rispettivamente^37,38.

3. Crescita in situ di AgNP

1. Preparazione di NanoPAD
   1. Preparare i NanoPAD a due ingressi con una zona di rilevamento convergente (Figura 4A) secondo il passaggio 1.
2. Successivo processo di adsorbimento e reazione dello strato ionico
   1. Preparare una soluzione di AgNO₃ da 20 mM e una soluzione di NaBH₄ da 20 mM (vedere la tabella dei materiali).
   2. Far cadere 5 μL della soluzione di AgNO₃ da 20 mM nella zona di ingresso sinistra del canale di flusso.
   3. Lasciare che la soluzione di AgNO₃ rimanga nella zona di reazione per 30 s.
      NOTA: Ripetere i passaggi 3.2.2. e 3.2.3. cinque volte per garantire la distribuzione uniforme delle AgNP senza agglomerazione, il che potrebbe spiegare la maggiore intensità di banda.
   4. Far cadere 5 μL di acqua distillata nella zona di ingresso sinistra del canale di flusso per il risciacquo.
      NOTA: Ripetere il passaggio 3.2.4. tre volte per garantire la rimozione degli ioni Ag in eccesso e non adsorbiti attraverso il lavaggio.
   5. Aggiungere 5 μL della soluzione 20 mM di NaBH₄ nella zona di ingresso destra del canale di flusso.
      NOTA: Ripetere il passaggio 3.2.5. fino a quando le AgNP non sono generate uniformemente nella zona di reazione. Le reazioni chimiche coinvolte nella fase 3 sono rappresentate dalla seguente formula³⁹:
      
      
      In questo esempio, sui NanoPAD si sono formati array di AgNP densi, uniformi e ben strutturati (Figura 4B). Il diametro medio delle AgNP era di 55 nm (Figura 4C).

4. Misurazione SERS

1. Preparazione del sistema di spettroscopia Raman
   1. Accendere il laser e avviare il software in dotazione per lo spettrometro Raman (vedere la tabella dei materiali).
   2. Impiega un obiettivo 50x per la messa a fuoco e la raccolta dei segnali Raman e un laser da 532 nm per l'eccitazione.
   3. Impostare la risoluzione spettrale su 2 ^cm-1 per una misurazione accurata. Impostare l'intervallo di misurazione dello spettro Raman da 400 ^cm-1 a 600 cm⁻¹.
   4. Calibrare lo spettrometro Raman utilizzando un wafer di silicio¹².
      NOTA: Eseguire il passaggio 4.1. per il passaggio 4.2.
2. Misurazione della rodamina B (RhB)
   1. Sciogliere 4,7 mg di RhB (vedi Tabella dei materiali) in 10 mL di etanolo per preparare una soluzione di RhB da 1 mM.
   2. Preparare una serie di soluzioni di RhB con concentrazioni comprese tra 10 μM e 0,1 pM diluendo la soluzione di RhB da 1 mM nell'etanolo.
   3. Aggiungere 5 μL della soluzione di RhB sulla zona di ingresso del canale NanoPAD e lasciarla asciugare.
      NOTA: Ripetere il passaggio 4.2.3. per le soluzioni di RhB di diverse concentrazioni indicate al punto 4.2.2.
   4. Impostare il tempo di eccitazione su 10 s, il reticolo su 2 cm⁻¹ e il numero di cicli su 1. Impostare l'intervallo di misurazione dello spettro Raman da 500 ^cm-1 a 1800 cm⁻¹.
   5. Regolare singolarmente la vite di messa a fuoco grossolana e la vite di messa a fuoco fine per ottenere una messa a fuoco corretta, quindi fare clic su stop per salvare la posizione.
   6. Fare clic su Avvia per iniziare la misurazione.
   7. Ripetere le misurazioni sette volte e salvare i dati raccolti.
   8. Spegnere il laser.
3. Analisi dei dati
   1. Importare i dati salvati nel software di analisi dei dati (vedi Tabella dei materiali).
   2. Calcola lo spettro medio dai dati salvati.
   3. Selezionare l'opzione di sformo della linea per tracciare gli spettri Raman.
   4. Utilizzare lo strumento Analizzatore di picco per impostare la linea di base degli spettri.
   5. Applicare la funzione Processo segnale - Liscia per uniformare gli spettri e ottenere risultati finali.

Risultati

È stato ideato un metodo unico per creare modelli a microcanali su nanocarta utilizzando i pratici micro-stampi in plastica attraverso la comoda tecnica della microgoffratura. In particolare, questo metodo realizza la modellazione dei microcanali su una scala di soli 200 μm, il che rappresenta un miglioramento di quattro volte rispetto ai metodi esistenti^32,33,34. Dopo aver messo a punto i parametri di patterning, le linee gui...

Discussione

L'obiettivo principale di questo studio è quello di sviluppare un metodo semplice per la fabbricazione di microcanali su nanocarta. Per affrontare questa sfida è stata ideata un'efficiente tecnica di goffratura utilizzando il PTFE come stampo¹². Ottimizzando la temperatura e la pressione di goffratura, sono stati condotti una serie di esperimenti per stabilire un processo di fabbricazione affidabile per i NanoPAD. Inoltre, è stato dimostrato l'uso di una tabella di riferimento rapido per regola...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AgNO3	Hushi (Shanghai, China)	7761-88-8	>99%
Ethanol	Hushi (Shanghai, China)	64-17-5	>99%
Hexadecane	Macklin (Shanghai, China)	544-76-3	>99%
LabSpec software	Horiba (Japan)	LabSpec5
Melamine	Macklin (Shanghai, China)	108-78-1	>99%
NaBH4	Aladdin (Shanghai, China)	16940-66-2	>99%
Origin lab software	OriginLab (USA)
Polyethylene terephthalate (PET)	Myers Industries (Akron, USA)
Polytetrafluoroethylene films	Shenzhen Huashenglong plastic material Co., Ltd. (Shenzhen, China)		Teflon film
PVDF filter membrane	EMD Millipore Corporation (USA)	VVLP04700	pore size: 0.1 μm
Raman spectrometer	Horiba (Japan)	Xplo RA
Rhodamine B	Macklin (Shanghai, China)	81-88-9	>95%
Scanning electron microscopy (SEM)	FEI(USA)	Scios 2 HiVac
Silicon wafer	Horiba (Japan)		diameter: 5 mm
TEMPO-oxidized NFC slurry	Tianjin University of Science and Technology		1.0 wt% solid, carboxylate level 2.0 mmol/g solid, average nanofiber diameter: 10 nm