La creazione di un modello ortodontico mascellare murino

Riepilogo

Qui mostriamo passo dopo passo un protocollo di movimento ortodontico dei denti gestibile operato su un modello mascellare murino. Con la spiegazione esplicita di ogni passaggio e la dimostrazione visiva, i ricercatori possono padroneggiare questo modello e applicarlo alle loro esigenze sperimentali con alcune modifiche.

Abstract

A causa della mancanza di protocolli riproducibili per stabilire un modello ortodontico mascellare murino, presentiamo un protocollo affidabile e riproducibile per fornire ai ricercatori uno strumento fattibile per analizzare il rimodellamento osseo associato al carico meccanico. Questo studio presenta un diagramma di flusso dettagliato oltre a diversi tipi di diagrammi schematici, foto operative e video. Abbiamo eseguito questo protocollo su 11 topi adulti di tipo largo C57/B6J e abbiamo raccolto campioni nei giorni postoperatori 3, 8 e 14. I dati micro-TC e istopatologici hanno dimostrato il successo dei movimenti dentali abbinati al rimodellamento osseo utilizzando questo protocollo. Inoltre, in base ai risultati della micro-TC nei giorni 3, 8 e 14, abbiamo diviso la modellazione ossea in tre fasi: fase di preparazione, fase di riassorbimento osseo e fase di formazione ossea. Ci si aspetta che queste fasi aiutino i ricercatori interessati alle diverse fasi a stabilire in modo ragionevole il tempo di raccolta dei campioni. Questo protocollo può fornire ai ricercatori uno strumento per effettuare analisi rigenerative del rimodellamento osseo.

Introduzione

L'osso è un tessuto ricostruito altamente attivo che adatta le sue dimensioni, la sua forma e le sue proprietà nel corso della vita dell'individuo ^1,2. Oltre agli ormoni, all'invecchiamento, all'alimentazione e ad altri fattori biologici o biochimici³, l'idea che il carico meccanico sia il fattore più determinante ha ottenuto un'accettazione generale ^4,5. In alcune circostanze con carico meccanico anormale, lo squilibrio tra il riassorbimento osseo e la formazione ossea può portare a un rimodellamento osseo anomalo e a disturbi ossei. Le malattie ossee come l'osteoporosi da disuso e la perdita ossea durante il riposo a letto a lungo termine o in presenza di microgravità durante il volo spaziale hanno una stretta relazione con il carico meccanico anormale ^6,7,8.

Il carico meccanico è stato utilizzato anche per trattare malattie legate alle ossa come il trattamento di distrazione e il trattamento ortodontico. Il trattamento di distrazione è stato utilizzato nelle malattie dello sviluppo come la craniosinostosi e l'ipoplasia mandibolare ^9,10, mentre il trattamento ortodontico è stato ampiamente utilizzato per correggere la posizione anomala dei denti e qualsiasi malocclusione¹¹. Il fulcro del trattamento ortodontico è anche la gestione del carico meccanico. Quando il tessuto osseo è sottoposto a carico meccanico, un processo di rimodellamento osseo altamente coordinato viene indotto dall'accoppiamento del riassorbimento osseo seguito dalla formazione ossea, che può spostare i denti per raggiungere lo scopo ortodontico^12,13.

Sebbene il trattamento ortodontico sia stato ampiamente applicato nella pratica clinica, poiché la nostra conoscenza degli effetti biologici del carico meccanico è limitata, i risultati del trattamento ortodontico sono incontrollabili. Per superare queste limitazioni, sono stati creati diversi modelli animali come topo, ratto, coniglio, gatto, cane, scimmia e maiale per studiare il meccanismo alla base del rimodellamento osseo indotto dal carico meccanico (Tabella 1)14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24^, 25,26,27,28,29,30,31,32. Gli animali di grandi dimensioni come cani, scimmie e maiali presentano alcuni vantaggi rispetto ai piccoli animali nelle operazioni ortodontiche: hanno denti e dentatura più simili a quelli umani in modo che la procedura chirurgica sia facile da replicare negli esseri umani. Inoltre, un'ampia visuale può ridurre la difficoltà dell'operazione e rendere possibile l'applicazione di una varietà di schemi ortodontici^33,34. Tuttavia, gli animali di grossa taglia sono difficili da ottenere, il che comporta sfide legate alle dimensioni del campione, e sono soggetti a restrizioni etiche³⁵. Inoltre, le procedure di estrazione di routine e gli strumenti complessi rendono gli esperimenti difficili da eseguire a causa dei quali gli animali di grandi dimensioni vengono utilizzati raramente.

In tali circostanze, i roditori vengono utilizzati principalmente per stabilire modelli ortodontici. Tra questi modelli, ratti e conigli hanno una minore difficoltà operativa e più schemi di movimento dei denti rispetto ai topi. Tuttavia, il modello murino ha il vantaggio unico che è disponibile un gran numero di topi geneticamente modificati, il che è particolarmente cruciale per studiare i meccanismi sottostanti³⁶. Tuttavia, il modello murino è il modello più difficile da manipolare a causa delle sue dimensioni ridotte. Esaminando i metodi attuali, lo spostamento del primo molare in direzione mesiale è l'unico metodo pratico per un modello ortodontico. Due dispositivi vengono utilizzati principalmente per spostare la molla elicoidale del dente e l'elastico. L'uso di una fascia elastica è più facile, ma la forza ortodontica varia notevolmente, il che rende difficile ottenere risultati stabili.

Xu et ^al.15 hanno stabilito un modello murino con una molla elicoidale sulla mandibola. Tuttavia, a causa della mobilità della mandibola e della natura ostruttiva della lingua, l'intervento chirurgico sulla mascella è sempre la prima scelta sia per considerazioni intraoperatorie che postoperatorie. Taddei et ^al.16 hanno descritto un protocollo più dettagliato sulla mascella murina 10 anni fa e dovrebbero essere aggiunti ulteriori dettagli visivi e pellucidi. In sintesi, questo protocollo ha descritto sistematicamente un protocollo dettagliato di movimento ortodontico dei denti in un modello mascellare murino per aiutare i ricercatori a padroneggiare il metodo di modellazione in modo standardizzato e consentire la valutazione comparativa tra diversi studi.

Protocollo

Le procedure sugli animali in questo studio sono state esaminate e approvate dal Comitato Etico della Scuola di Stomatologia della Cina Occidentale, Università del Sichuan (WCHSIRB-D-2017-041). In questo studio sono stati utilizzati topi adulti C57BL/6 (vedere la tabella dei materiali). Questo protocollo aggiunge un carico meccanico al primo molare mascellare destro (M1) per il movimento mesiale in cui viene indotto un processo di rimodellamento osseo altamente coordinato dall'accoppiamento del riassorbimento osseo e della formazione ossea (Figura 1).

1. Preparazione preoperatoria

1. Articoli chirurgici
   1. Preparare i seguenti elementi chirurgici per l'operazione: piattaforma chirurgica (Figura 2A), dispositivo di fissaggio (Figura 2B), strumenti chirurgici (Figura 2C e Figura supplementare S1), forniture ortodontiche (Figura 2C) e forniture per restauri dentali (Figura 2D).
      NOTA: La molla elicoidale personalizzata è realizzata su misura e fornisce una forza di 10cN quando viene allungata a 10 mm.
2. Sterilizzazione
   1. Sterilizzare gli strumenti chirurgici in autoclave e tutti gli elementi chirurgici con irradiazione ultravioletta per almeno 30 min.
3. Anestesia
   1. Anestetizzare il topo somministrando ketamina (100 mg/kg) e diazepam (5 mg/kg) per iniezione intraperitoneale.
   2. Applicare l'unguento veterinario sugli occhi del murino con un bastoncino di cotone per evitare la secchezza oculare.
   3. Procedere con l'intervento solo quando il topo non risponde quando le dita dei piedi vengono pizzicate con una pinza.

2. Processo chirurgico

1. Stendere e fissare con nastro adesivo gli arti del topo anestetizzato in posizione supina alla piattaforma chirurgica utilizzando del nastro adesivo.
2. Appunta un ago da 27 G su entrambi i lati sopra la testa e un altro ago da 27 G su entrambi i lati sotto l'ascella.
3. Avvolgi un elastico attorno ai due aghi sopra e agli incisivi superiori e un altro attorno ad altri due aghi e agli incisivi inferiori. Modificare le posizioni dell'ago per controllare il grado di apertura e l'orientamento della bocca (Figura 3A).
   NOTA: Per l'operazione di movimento ortodontico dei denti, tenere la bocca aperta al massimo prima che il buccinatore diventi completamente teso. La lingua deve essere tirata verso il lato non operatorio per esporre il campo chirurgico e prevenire l'ischemia.
4. Piegare l'estremità da 1,5 mm di un filo di acciaio inossidabile 304 da 3 cm e spingere l'estremità piegata attraverso lo spazio interprossimo tra M1 e il secondo molare mascellare (M2) dal lato vestibolare con pinzette oftalmiche curve (Figura 3B). Quando l'estremità palatale del filo di legatura è visibile dal lato palatale, estrarla fino a circa la metà della sua lunghezza e farla passare attraverso un'estremità della molla elicoidale personalizzata.
5. Fate un nodo quadrato con le due estremità del filo di legatura in direzione mesiale del mascellare M1 fino a quando la molla non è saldamente fissata al dente (Figura 3C). Sottrai il filo in eccesso.
6. Allo stesso modo, perforare un secondo filo di acciaio inossidabile 304 da 3 cm attraverso l'altra estremità della molla elicoidale.
7. Pulire e asciugare le superfici degli incisivi con batuffoli di cotone. Applicare adesivi su tutte quelle superfici con bastoncini di cotone e fotopolimerizzarli.
8. Spingere il secondo filo di acciaio inossidabile attraverso lo spazio interprossimo tra gli incisivi mascellari e fare un nodo scorsoio in direzione labiale (Figura 3D). Sottrai il filo in eccesso e fai in modo che il resto del filo si trovi vicino alla superficie del dente.
9. Iniettare resina fotopolimerizzabile per coprire il nodo e gli incisivi; fotopolimerizzare la resina (Figura 3E).

3. Gestione postoperatoria

1. Dopo l'intervento chirurgico, iniettare nei topi 0,05 mg/kg di buprenorfina per via intraperitoneale per l'analgesia postoperatoria.
2. Posizionare il topo anestetizzato su una termocoperta termostatica a 37 °C. Quando il murino riprende conoscenza con la deambulazione, rimettilo in una gabbia separata.
3. A causa del funzionamento limitato degli incisivi dopo l'intervento chirurgico, sostituire il normale foraggio duro con solo una dieta morbida.
4. Controllare gli apparecchi ortodontici ogni giorno. Se durante l'ispezione si osservano condizioni che influenzano la conduzione della forza ortodontica, come la deformazione della molla, l'allentamento della molla e la caduta del dispositivo, il topo deve essere escluso dall'esperimento.
5. Al fine di mantenere la comparabilità degli esperimenti, valutare il peso dei topi ogni giorno dopo l'intervento chirurgico. Tutti i topi che presentano una perdita di peso superiore al 30% del loro peso preoperatorio devono essere esclusi dall'esperimento.

Risultati

Abbiamo eseguito l'intervento OTM su 11 topi maschi adulti (C57/BL6, 3 mesi). Sono stati sottoposti a eutanasia per ottenere risultati nei giorni 3, 8 e 14 dopo l'intervento chirurgico. In questi esperimenti, il lato mascellare destro è il lato operativo, mentre il lato mascellare sinistro è il lato di controllo. La micro-TC ha mostrato che c'è stato un aumento temporale consecutivo della distanza tra M1 e M2: 30 μm, 70 μm e 110 μm rispettivamente ai giorni 3, 8 e 14 dopo l'intervento chirurgico (

Discussione

In questo articolo, abbiamo cercato di descrivere passo dopo passo il più semplice protocollo ortodontico di movimento dentale su modello mascellare murino per studiare i meccanismi latenti del rimodellamento osseo indotto dal carico meccanico. Oltre alla ricerca sul rimodellamento osseo, ci sono alcune altre applicazioni principali di questo metodo: 1) ricerca metodologica sull'accelerazione del movimento ortodontico dei denti; 2) ricerca sul riassorbimento radicolare ortodontico; 3) meccanismi biologici del movimento ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Experimental Models: Mouse Lines
C57/B6J	Gempharmatech Experimental Animals Company	C57/B6J
Critical Commercial Assays
Hematoxylin and Eosin Stain Kit	Biosharp	BL700B
Masson’s Trichrome Stain Kit	Solarbio	G1340
Instruments
27 G needle	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.	SB1-074(IV)
Adhesives	Minnesota Mining and Manufacturing Co., Ltd.	41282
Corkboard	DELI Group Co., Ltd.	8705
Cotton balls	Haishi Hainuo Group Co.,  Ltd.	20120047
Cotton sticks	Lakong Medical Devices Co., Ltd.	M6500R
Customized coil spring	Chengdu Mingxing Spring Co., Ltd.	1109-02
Forceps	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	none
Light-cured fluid resin	Shofu Dental Trading (SHANGHAI) Co., Ltd.	518785
Light curer	Liang Ya Dental Equipment Co., Ltd.	LY-A180
Medical adhesive tapes	Haishi Hainuo Group Co.,  Ltd.	0008-2014
Medical non-woven fabric	Henan Yadu Industrial Co., Ltd.	01011500018
Needle holders	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	none
Rubber bands	Haishi Hainuo Group Co.,  Ltd.	32X1
Surgical scissors	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	none
Tweezers	Chengdu Shifeng Co., Ltd.	none