Prelievo di sangue della vena succlavia nei ratti coscienti

Riepilogo

Qui presentiamo una combinazione di efficaci metodi di restrizione dei ratti e puntura della vena succlavia che consentono una raccolta di sangue rapida, sicura e ripetuta nei ratti senza anestesia.

Abstract

Esistono diversi metodi consolidati per ottenere campioni di sangue ripetuti dai ratti, con i metodi più comunemente impiegati che sono il campionamento della vena caudale laterale senza anestesia e il campionamento della vena giugulare con anestesia. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi richiede assistenza e attrezzature anestetiche e talvolta pone difficoltà in termini di raccolta del sangue o di scarsa qualità dei campioni di sangue. Inoltre, questi metodi di raccolta del sangue consumano molto tempo e risorse umane quando è necessario un campionamento ripetuto del sangue per un gran numero di ratti. Questo studio presenta una tecnica per il campionamento ripetitivo del sangue in ratti non anestetizzati da parte di un singolo individuo esperto. Campioni di sangue altamente soddisfacenti possono essere ottenuti perforando la vena succlavia. Il metodo ha dimostrato un impressionante tasso di successo complessivo del 95%, con un tempo mediano di soli 2 minuti dalla contenzione del ratto al completamento della raccolta del sangue. Inoltre, l'esecuzione di prelievi di sangue consecutivi all'interno dell'intervallo designato non infligge alcun danno ai ratti. Questo metodo merita di essere promosso per la raccolta del sangue, soprattutto negli studi di farmacocinetica su larga scala.

Introduzione

I ratti sono uno degli animali da esperimento più comuni e ci sono molti modi per ottenere campioni di sangue. Per gli esperimenti che prevedono un singolo prelievo di sangue nella fase conclusiva, è possibile ottenere una quantità sufficiente di sangue mediante puntura cardiaca o prelievo di sangue dell'aorta addominale¹. Tuttavia, alcuni studi richiedono la raccolta ripetuta di sangue dai ratti per analisi del sangue o biochimiche di routine, specialmente negli studi di farmacocinetica e tossicologia, in cui è necessaria una raccolta ripetuta di sangue per determinare l'assorbimento, la distribuzione e il metabolismo dei farmaci².

Attualmente, sebbene la raccolta del sangue della vena caudale sia il metodo più comune per il prelievo di sangue dai ratti, nonostante non richieda l'anestesia, questo metodo può essere impegnativo per raccolte ripetute e il volume di sangue raccolto è relativamente piccolo ^3,4. Inoltre, sebbene il sangue possa essere raccolto dalle vene safene e del pene, la quantità di sangue ottenuta è limitata ed è necessaria l'anestesia ^1,5. Inoltre, i campioni di sangue prelevati dal plesso venoso sottomandibolare, così come dalle vene sublinguali, giugulari e succlavia forniscono campioni di qualità superiore, ma in genere richiedono l'anestesia o l'assistenza di più individui 1,6,7,8,9. Infine, la raccolta di sangue del seno/canale retro-orbitale non solo richiede l'anestesia, ma può anche potenzialmente causare lesioni e stress ai ratti⁹.

La qualità dei campioni di sangue tipicamente ottenuti dalle vene principali è generalmente di altissimo livello¹. Attualmente, alcuni studi hanno scoperto che il microcampionamento continuo attraverso la vena giugulare è un metodo molto adatto per la ricerca tossicologica nei ratti, sebbene questo metodo di solito richieda il cateterismo della vena giugulare 10,11,12. Pertanto, vale la pena esplorare come ottenere campioni di sangue di alta qualità secondo il principio delle 3R della ricerca sugli animali senza intervento chirurgico. L'obiettivo di questo studio era quello di presentare un metodo per estrarre in modo efficiente il sangue dalla vena succlavia nei ratti. Questa tecnica consente la rapida raccolta di campioni soddisfacenti attraverso una procedura da parte di una sola persona senza la necessità di anestesia.

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Protocollo

Questo studio ha aderito alle linee guida delineate nell'ottava edizione della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio¹³. La ricerca ha ricevuto l'approvazione del Comitato Etico del Secondo Ospedale dell'Università di Lanzhou ed è stata documentata in aderenza alle linee guida ARRIVE 2.0¹⁴. Dodici ratti Wistar sani (sei maschi del peso di 290-330 g e sei femmine del peso di 250-280 g) di età compresa tra 12 e 16 settimane sono stati ospitati nel GLP Animal Laboratory dell'Università di Lanzhou per 3 giorni prima dell'esperimento vero e proprio. Le gabbie per topi utilizzate erano del tipo R5, misuravano 545 mm x 395 mm x 200 mm ed erano dotate di materiale di lettiera autoclavato. A tutti i ratti è stato fornito libero accesso sia al cibo che all'acqua. Il laboratorio ha mantenuto un'umidità media del 25%, una temperatura media di 24 °C e un ciclo di luce alternato tra giorno e notte (7:00/19:00). Al termine dello studio, tutti gli animali sono stati sottoposti a eutanasia utilizzando una dose eccessiva di isoflurano. Per informazioni complete sui materiali e gli strumenti utilizzati in questo studio, fare riferimento alla Tabella dei materiali.

1. Calcolo della dimensione del campione e selezione degli animali

1. Scegliere il metodo¹⁵ dell'equazione delle risorse per stimare la dimensione del campione animale utilizzando l'equazione (1).
   E = Numero totale di animali − Numero totale di gruppi (1)
   Dove E è il grado di libertà di analisi della varianza (ANOVA) e varia da 10 a 20.
   NOTA: In questo studio, 12 animali sono stati divisi in due gruppi A e B (tre maschi e tre femmine per gruppo).
2. Definire l'esito primario di questo studio come il tasso di successo e il consumo di tempo di ripetuti prelievi di sangue da parte di un singolo individuo.
3. Definire le misure di esito secondarie come variazioni del peso corporeo del ratto, dell'assunzione di cibo e acqua, nonché dell'incidenza di eventi avversi (come fratture della clavicola, ematomi sottocutanei, pneumotorace e mortalità).
4. Definire il successo del prelievo di sangue come rispondente ai seguenti criteri: i) meno di tre punture per un singolo prelievo di sangue; ii) un tempo totale (dalla contenzione dei ratti al completamento del prelievo di sangue) non superiore a 5 minuti; e iii) raggiungere il volume sanguigno desiderato ottenendo plasma chiaro. Considerare qualsiasi deviazione da questi criteri un errore di campionamento.

2. Contenzione degli animali e raccolta del sangue

NOTA: I campioni di sangue dei ratti di gruppo A e B sono stati raccolti da due ricercatori esperti, entrambi i quali avevano prelevato almeno 100 campioni di sangue. I campioni di sangue sono stati raccolti da entrambi i gruppi di ratti per un totale di 96 volte nel corso di 4 giorni. Questo metodo di raccolta del sangue non richiede anestesia o dispositivi di contenzione aggiuntivi per i ratti. Tuttavia, richiede tecniche di manipolazione esperte.

1. Alle 8:00 del giorno prima del prelievo di sangue (giorno 1), assegnare ogni ratto alla sua gabbia individuale mentre vengono pesati il cibo e l'acqua. Quindi, chiedi a un altro ricercatore, cieco alle misurazioni, di registrare il peso dei ratti, il consumo di cibo e l'assunzione di acqua ogni giorno alle 8:00 dal giorno 1 in poi.
2. Per seguire questo protocollo, prelevare il sangue prima alle 10:00 e poi alle 22:00 ogni giorno, raccogliendo 0,15 ml di sangue alternativamente dalle vene succlavia su entrambi i lati.
   NOTA: La quantità di sangue da raccogliere è stata determinata dal volume massimo che il ratto di peso più basso poteva tollerare entro una settimana.
3. Sciacquare una siringa con eparina di sodio (25 U/mL) e disinfettare il sito di iniezione con alcol.
4. Accarezza delicatamente la pelle della schiena del ratto e pizzica ripetutamente il collo per aiutarlo a rilassarsi (Video 1).
5. Usando il pollice e l'indice della mano non dominante, afferrare e sollevare saldamente la pelle del collo del ratto (Figura 1A e Video 1).
6. Con la coordinazione della mano dominante, utilizzare le restanti tre dita e il palmo della mano non dominante per fissare la pelle posteriore del ratto e immobilizzare gli arti anteriori (Figura 1B, C e Video 2).
   NOTA: Se il ratto resiste o lotta, questa procedura può essere ripetuta più volte per aiutare il ratto ad abituarsi alla manipolazione. I seguenti passaggi sono fondamentali per il successo della raccolta del sangue.
7. Usando il dito indice della mano non dominante, spingi delicatamente verso il basso sulla pelle della testa del ratto mentre le altre dita, insieme al palmo, aiutano a ruotare verso l'esterno l'articolazione della spalla. Durante questo processo, utilizzare la mano dominante per estendere completamente l'articolazione della spalla del ratto (Figura 1D-F e Video 2).
8. Afferrare saldamente il ratto con la mano non dominante per allineare la testa e il corpo del ratto in linea retta (Figura 1G,H). Quindi, utilizzare la mano dominante per individuare la posizione della clavicola e confermare il sito di puntura (Figura 1I, Video 2 e Video 3).
   NOTA: La rasatura del ratto non è necessaria. Nella Figura 1, la rasatura è stata eseguita solo per mostrare la clavicola e la posizione della puntura in misura maggiore. Quando si trattengono i ratti, in particolare i ratti > 350 g, consentire al ratto di appoggiare le zampe su una superficie solida aiuterà a sostenere il loro peso corporeo. Inoltre, il dispositivo di ritenuta deve monitorare la frequenza respiratoria di ciascun ratto durante la raccolta del sangue per garantire che il sistema di ritenuta non sia troppo stretto, il che potrebbe causare difficoltà respiratorie.
9. Tenendo la siringa parallela al corpo del ratto nella mano dominante, con la punta dell'ago rivolta verso l'alto e la bilancia della siringa rivolta verso lo sperimentatore, mantenere un angolo di circa 15° con la linea mediana del corpo del ratto. Inserire l'ago 0,5 cm sotto la tacca della clavicola (alla giunzione del terzo prossimale della clavicola e dello sterno), assicurandosi che l'ago rimanga parallelo al corpo del ratto (Figura 1J e Video 3).
   NOTA: Prestare particolare attenzione all'angolo e alla profondità di inserimento dell'ago per evitare di perforare il vaso sanguigno o causare danni involontari ai vasi adiacenti.
10. Estrarre delicatamente la siringa per creare una pressione negativa, spesso accompagnata da una sensazione palpabile di rottura all'ingresso nel vaso sanguigno (particolarmente pronunciata durante il prelievo di sangue iniziale). Mantenere questa posizione e raccogliere 0,1-1,0 mL di sangue a velocità costante secondo necessità (seguendo le linee guida IACUC di circa 4-5,3 mL/kg di sangue a settimana¹) (Figura 1K e Video 3).
11. Se non c'è sangue durante la puntura, provare a regolare delicatamente l'angolazione e la profondità dell'ago o ruotare delicatamente la siringa (Video 3). Se tre tentativi consecutivi sullo stesso lato non hanno successo, interrompere tutte le emorragie e poi passare al lato opposto per la puntura.
    NOTA: Si consiglia una rapida puntura attraverso la pelle per evitare che il ratto si dibatta a causa del disagio.
12. Applicare un batuffolo di cotone per l'emostasi e riportare il ratto nella sua gabbia (Video 4).
13. Elaborare i campioni di sangue in base ai requisiti sperimentali.

3. Elaborazione del campione di sangue

1. Smaltire l'ago della siringa in un contenitore per oggetti taglienti. Trasferire il sangue raccolto in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL precedentemente risciacquata con eparina. Mettere la provetta in una centrifuga, impostandola a 4 °C e 1.200 x g, e centrifugare per 10 minuti per separare il plasma. Trasferire il siero utilizzando una pipetta Pasteur da 1,0 mL in una provetta per microcentrifuga pulita e conservarlo a -80 °C.
   NOTA: Per prevenire l'emolisi dovuta alla pressione, rimuovere la punta dell'ago quando necessario. Durante l'aspirazione del plasma, evitare di prelevare le cellule del sangue dal fondo della provetta. Occasionalmente, la superficie della siringa potrebbe raccogliere pelo di ratto; Fare attenzione a non far entrare il pelo nel tubo, poiché può portare alla coagulazione.

4. Analisi statistica

1. Presentare tutti i dati come media ± deviazione standard e testarli per l'omogeneità della varianza.
2. Usa il test esatto di Fisher per confrontare le percentuali di successo tra i gruppi.
3. Utilizzare un test t indipendente a due campioni per confrontare le medie complessive tra i due gruppi.
4. Utilizzare l'analisi della varianza (ANOVA) per misurazioni continue come il tempo di prelievo del sangue, il peso corporeo, l'assunzione di cibo e il consumo di acqua. Si consideri statisticamente significativo P < 0,05.

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Risultati

I campioni di plasma di alta qualità mostrano una tonalità giallo pallido, chiarezza e trasparenza, privi di qualsiasi sfumatura rossa o coagulazione, come illustrato nella Figura 2A. La Figura 2B mostra rispettivamente l'emolisi (lato sinistro) o la coagulazione (lato destro) a causa di procedure improprie. Nel corso di 96 sessioni di raccolta del sangue in 4 giorni, i tempi medi di prelievo di sangue singolo per i gruppi A e B

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Discussione

Sebbene la raccolta del sangue della vena caudale sia il metodo più comune per il prelievo ripetuto di sangue nei ratti, potrebbe essere influenzata dai farmaci anestetici e, a causa delle piccole dimensioni della vena caudale, la quantità di sangue che può essere raccolta in un singolo caso è limitata, portando a una maggiore durata della raccolta del sangue ^4,5. Sebbene i sistemi di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e spettrometria di massa t...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.75% normal saline	Gansu Fuzheng Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	——	Prepared heparin sodium solution
1 mL Pasteur pipette	Biosharp	BS-XG-01-NS	Blood collection
1 mL syringe (26 G, 0.45 mm x 12 mm)	Shinva Medical Instrument Co.,Ltd.	0.45*12RWLB	Blood collection
1.5 mL Eppendorf tube	Biosharp	BS-15-M	Blood storage and collection
75% medical alcohol	Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd.	——	Disinfection of rat blood collection site
Centrifuge tube holder	Biosharp	BS-05/15-SM60	——
Electronic scale	Shanghai PUCHUN Measure Instrument Co., Ltd.	JE1002	Weigh
Heparin sodium injection	Hebei Changshan Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd.	——	Rinse the syringe and EP tube; dilute with normal saline to 25 U/mL
Low temperature centrifuge	HuNan Xiang Yi Centrifuge Instrument  Co., Ltd.	H1750R	Separation of serum