Cromatografia liquida ad altissime prestazioni-spettrometria di massa e analisi del database auto-consolidato dei componenti della fitoterapia cinese

Riepilogo

Descriviamo un protocollo generale e un disegno sistematico che potrebbe essere applicato per separare e riconoscere componenti complessi nell'achillea alpina, Achillea millefolium L., una medicina erboristica cinese.

Abstract

L'erboristeria cinese è complessa e ha numerosi composti sconosciuti, rendendo cruciale la ricerca qualitativa. La cromatografia liquida ad altissime prestazioni con spettrometria di massa a tempo di volo a quadrupolo (UPLC-Q-TOF-MS) è il metodo più utilizzato nell'analisi qualitativa dei composti. Il metodo include protocolli standardizzati e programmati per il pretrattamento dei campioni, la sintonizzazione MS, l'acquisizione MS e l'elaborazione dei dati. I pretrattamenti dei campioni comprendono la raccolta, la polverizzazione, l'estrazione con solvente, gli ultrasuoni, la centrifugazione e la filtrazione. La post-elaborazione dei dati è stata descritta in dettaglio e include l'importazione dei dati, la costruzione di database autostabiliti, la creazione di metodi, l'elaborazione dei dati e altre operazioni manuali. La parte fuori terra dell'achillea alpina, Achillea millefolium L., è usata per trattare l'infiammazione, i disturbi gastrointestinali e il dolore e i suoi 3-oxa-guaianolidi potrebbero essere utili per lo sviluppo di farmaci antinfiammatori. Sono stati identificati tre composti rappresentativi della LMA, combinando TOF-MS con un database auto-stabilito. Inoltre, sono state discusse le differenze rispetto alla letteratura esistente, l'ottimizzazione dei parametri in fase liquida, la selezione della modalità di scansione, l'idoneità della sorgente ionica, la regolazione dell'energia di collisione, lo screening degli isomeri, la limitazione del metodo e le possibili soluzioni. Questo metodo di analisi standardizzato è universale e può essere applicato per identificare composti complessi nell'erboristeria cinese.

Introduzione

La medicina cinese ha accumulato la più ricca conoscenza empirica del mondo¹. L'analisi qualitativa dei componenti chimici nella fitoterapia tradizionale cinese è diventata un argomento cruciale nella ricerca². Distinguere le differenze chimiche nell'erboristeria cinese è difficile a causa della complessità delle categorie e della diversificazione dell'origine³. I principali tipi di composti in erboristeria cinese includono alcaloidi, saponine, flavonoidi, antrachinoni, terpenoidi, cumarine, lignani, polisaccaridi, polipeptidi e proteine¹. Tuttavia, la separazione dei composti e l'identificazione degli isomeri ostacolano lo sviluppo della ricerca qualitativa sulla fitoterapia cinese.

La combinazione della cromatografia liquida ad altissime prestazioni (UPLC) con colonne cromatografiche adeguate fornisce un forte supporto per la separazione di composti complessi nella fitoterapia cinese⁴. Negli ultimi anni, la spettrometria di massa ad alta risoluzione è diventata sempre più popolare nell'analisi qualitativa della fitoterapia cinese. I metodi di spettrometria di massa ad alta risoluzione comunemente usati includono la spettrometria di massa a tempo di volo a quadrupolo (Q-TOF-MS⁾⁵, la spettrometria di massa orbitrap (Orbitrap-MS)⁶ e la spettrometria di massa ciclotronica ionica a trasformata di Fourier (FT-ICR-MS⁾⁷. L'FT-ICR-MS ha la risoluzione più elevata, ma comporta costosi costi operativi e di manutenzione⁸. Orbitrap-MS presenta vantaggi nella rilevazione di piccoli composti molecolari, specialmente a pesi molecolari inferiori a 500 Da⁹. Q-TOF-MS è il metodo più utilizzato nell'analisi qualitativa della farmacochimica del siero^10,11. Rispetto al tradizionale database di rete o al database commerciale, l'analisi congiunta con un database auto-creato per l'elaborazione dei dati è diventata sempre più popolare.

L'achillea millefolium L. (LMA), un tipo di erboristeria cinese, cresce principalmente nello Xinjiang, nella Mongolia interna e nelle aree nord-orientali della Cina¹². La parte superficiale dell'AML è ampiamente utilizzata per trattare l'infiammazione, i disturbi gastrointestinali e il dolore, tra cui reumatalgia, mal di denti e mal di stomaco¹³. I 3-oxa-guaianolidi della LMA offrono un grande potenziale come guida per lo sviluppo di farmaci antinfiammatori¹⁴. Gli studi attuali sui componenti chimici dell'AML si concentrano su sesquiterpeni, monoterpeni, flavonoidi e composti fenolici¹⁵. Tuttavia, per l'identificazione dei composti nella LMA, non è disponibile uno schema sistematico di induzione qualitativa che potrebbe essere utilizzato per altri medicinali erboristici cinesi. Questo studio mira a fornire un'identificazione standardizzata dei componenti chimici nell'erboristeria cinese combinando Q-TOF-MS e l'analisi di database autostabilita.

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Protocollo

1. Pretrattamento del campione

1. Collezione di erboristeria cinese AML
   1. Pianta i semi di achillea alpina Herb, Achillea millefolium L. (AML) nel terreno a febbraio. Raccogliere la parte fuori terra di AML nel luglio dello stesso anno (Figura 1A).
      NOTA: La LMA utilizzata in questo documento è stata raccolta in un'area montuosa a un'altitudine di 400 m a Mianyang, Sichuan, Cina.
2. Trattamento di essiccazione
   1. Lavare tutta l'AML raccolta in acqua pura per rimuovere sedimenti e impurità. Essiccare l'AML in forno a 50 °C per 24 ore (Figura 1B).
3. Preparazione della polvere
   1. Dopo l'essiccazione, frantumare l'AML in una polvere grossolana utilizzando un frantoio multifunzionale ad alta velocità. Passare la polvere attraverso un setaccio da 50 maglie (Figura 1C).
4. Estrazione con solvente
   1. Introdurre 1 g di campione di LMA accuratamente pesato in un pallone conico con 30 mL di una soluzione di etanolo e acqua al 75% (Figura 2A).
   2. Estrarre la miscela in un sonicatore da bagno a ultrasuoni per 30 minuti a 25 °C (Figura 2B).
   3. Centrifugare il campione a 14.000 × g per 5 minuti (Figura 2C).
   4. Inserire una siringa per iniezione con un filtro a membrana microporosa (0,22 μm, solo organico) e filtrare il surnatante in un flacone campione da 2 ml (Figura 2D).

2. Sintonizzazione MS

1. Avviare il software di controllo LC-MS (Figura 3A). Aprire il modulo MS tune ed eliminare due volte la soluzione di encefalina leucina (LE) da 1 ng/μL.
2. Nel pannello di controllo del flusso LockSpray , impostare una portata di 50 μl/min e fare clic sul pulsante Flusso per far entrare la soluzione LE nello spettrometro di massa (Figura 3B).
3. Fare clic sul pulsante LockSpray Source Setup per completare la sintonizzazione MS in modalità positiva (Figura 3C). Fare clic sull'icona negativa per cambiare la modalità ionica. Fare clic sul pulsante LockSpray Source Setup per completare la sintonizzazione MS in modalità negativa.

3. Acquisizione di MS

1. Impostare una tabella di sequenza, inclusi il nome del file, il metodo MS, il file di ingresso, la fiala e il volume. Fare clic sul pulsante Salva per registrare la tabella delle sequenze.
2. Fare clic sul pulsante Esegui e sul pulsante Avvia in sequenza (Figura 3D). Selezionare l'opzione Acquisisci solo dati di esempio . Fare clic sul pulsante OK per avviare l'acquisizione dei dati.
3. Fare clic sul pulsante Cromatogramma per aprire la finestra del cromatogramma ionico totale (TIC) in tempo reale (Figura 3E). Fare clic sul pulsante Visualizza e sul pulsante TIC in sequenza. Selezionare l'opzione Cromatogramma BPI , quindi fare clic sul pulsante OK per visualizzare la finestra del cromatogramma di picco di base (BPI) (Figura 3F).

4. Trattamento dei dati

1. Avvia il software di analisi dei dati.
2. Fare clic sul pulsante Il mio lavoro e sul pulsante Importa dati MassLynx per accedere alla finestra figlio (Figura 4A). Seleziona i file di dati grezzi e inserisci il nome del set di campioni, quindi fai clic sul pulsante Crea set di campioni UNIFI per importare i dati grezzi degli spettri MS.
   NOTA: Assicurarsi che i dati grezzi positivi e negativi vengano importati separatamente.
3. Creazione di database
   1. Fare clic sul pulsante Amministrazione nella finestra iniziale (Figura 4B). Fare clic sul pulsante Importa elementi della libreria . Selezionare il file modello di database in formato .xlsx con tutte le strutture composte separate in formato .mol nella stessa cartella.
   2. Immettere un nome per il database. Fare clic sul pulsante Verifica per assicurarsi che tutti i composti siano visualizzati. Fare clic sul pulsante Importa per completare la creazione di un database autostabilito.
      NOTA: Tutti i composti in file indipendenti in formato .mol che devono essere importati nel database sono preparati sulla base dei riferimenti della letteratura. I file di struttura composta vengono disegnati da soli utilizzando un software di disegno.
4. Fare clic sul pulsante Crea metodo di analisi per aprire una finestra figlio. Fare clic sul pulsante Genera un metodo di solo processo per stabilire un metodo di elaborazione dei dati.
5. Analisi dei dati
   1. Fare clic sul pulsante Crea analisi per aprire una finestra figlio.
   2. Fare clic sul pulsante Crea analisi da dati esistenti , quindi selezionare i dati importati e il metodo stabilito.
   3. Fare clic sul pulsante Elabora per avviare un calcolo di dati lunghi (Figura 4D).
   4. Fare clic sul pulsante Indaga per passare alla finestra TIC.
   5. Fare clic sul pulsante Seleziona tracce e selezionare il TOF MS^E BPI. Fare clic sul pulsante Sostituisci tutto per visualizzare il BPI.
6. Fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare l'opzione Aggiungi colonna | visualizzare le informazioni sul composto, tra cui il nome del composto, la massa naturale, il m/z osservato, l'errore di massa, il tempo di ritenzione osservato (RT), il conteggio dei rivelatori, la risposta, gli addotti, le assegnazioni alternative e il numero totale di frammenti trovati (Figura 4E).
7. Selezionare l'opzione Frammenti ad alta energia per visualizzare i frammenti dello spettro di massa secondario del composto selezionato (Figura 4F).
8. Disegnare manualmente i percorsi di scissione molecolare in base a ciascun frammento secondario (Figura 4G).
   NOTA: Gli esempi sono descritti in dettaglio nella sezione dei risultati rappresentativi.

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Risultati

L'achillea alpina è stata utilizzata come modello per mostrare il risultato rappresentativo. Come mostrato nella Figura 4G, la quercetina-3'-O-glucoside con m/z = 463,08935 si è trasformata in un intermedio con m/z = 300,02828 attraverso la perdita di una molecola di esoso durante la reazione di idrolisi. In un'altra via, la rottura del legame C-C nello scheletro della struttura dei flavonoidi ha portato alla formazione di un intermedio con m/z = 223,06232...

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Discussione

La spettrometria di massa ad alta risoluzione, combinata con un database auto-creato, offre una tecnologia qualitativa sistematica per identificare i componenti chimici nell'erboristeria cinese. A differenza di un database commerciale, che contiene la comune medicina tradizionale cinese, un database auto-creato che utilizza i composti riportati in letteratura fornisce una maggiore accuratezza nell'analisi della medicina rara o etnica¹⁶. Metodi simili sono stati ap...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
chloroform	Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd	CAS 67-66-3
ethyl acetate	ChuandongChemical	CAS 141-78-6
liquid chromatograph	Waters	ACQUITY Class 1 plus
MassLynx	Waters	V4.2	MS control software
Methanol	ChuandongChemical	CAS 67-56-1
n-butyl alcohol	ChuandongChemical	CAS 71-36-3
petroleum ether	ChuandongChemical	CAS 8032-32-4
Quadrupole time-of-flight mass spectrometry	Waters	SYNAPT XS
UNIFI	Waters		Data analysis software