Ottenere criosezioni di alta qualità dell'intero occhio di coniglio

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo affidabile per ottenere criosezioni di alta qualità di occhi interi di coniglio. Descrive in dettaglio le procedure di dissezione, fissazione, inclusione e sezionamento dell'occhio di coniglio, che possono essere facilmente adattate per l'uso in qualsiasi studio che utilizza l'immunoistochimica negli occhi più grandi.

Abstract

Questo protocollo descrive come ottenere criosezioni retiniche di alta qualità in animali più grandi, come i conigli. Dopo l'enucleazione, l'occhio viene brevemente immerso nel fissativo. Quindi, la cornea e l'iride vengono rimosse e l'occhio viene lasciato per una notte per un'ulteriore fissazione a 4 °C. Dopo il fissaggio, la lente viene rimossa. L'occhio viene quindi inserito in un criomold e riempito con un mezzo di inclusione. Rimuovendo la lente, il mezzo di inclusione ha un migliore accesso al vitreo e porta a una migliore stabilità retinica. È importante sottolineare che l'occhio deve essere incubato in terreno di inclusione durante la notte per consentire la completa infiltrazione in tutto il vitreo. Dopo l'incubazione notturna, l'occhio viene congelato su ghiaccio secco e sezionato. Intere sezioni retiniche possono essere ottenute per l'uso in immunoistochimica. I protocolli di colorazione standard possono essere utilizzati per studiare la localizzazione degli antigeni all'interno del tessuto retinico. L'adesione a questo protocollo si traduce in criosezioni retiniche di alta qualità che possono essere utilizzate in qualsiasi esperimento che utilizza l'immunoistochimica.

Introduzione

La retina è composta da diversi strati di cellule specializzate all'interno dell'occhio che insieme lavorano per convertire la luce in segnali neurali. Poiché la retina svolge un ruolo fondamentale nella visione, la comprensione della sua struttura e funzione può fornire preziose informazioni su alcune delle cause più comuni di perdita della vista, come la degenerazione maculare e la retinopatia diabetica, tra le altre.

I conigli fungono da comodo modello animale nella ricerca retinica in quanto offrono numerosi vantaggi rispetto ad altri modelli. Gli occhi di coniglio sono relativamente simili nell'anatomia agli occhi umani ^1,2. Ad esempio, i conigli hanno un'area di maggiore densità dei fotorecettori, nota come striscia visiva orizzontale, che è analoga alla fovea negli esseri umani. Altri modelli animali di uso comune, come i roditori, non hanno un equivalente anatomico. Inoltre, rispetto ai roditori, la vascolarizzazione retinica nei conigli è abbastanza simile a quella dell'uomo. Anche gli occhi di coniglio sono relativamente grandi. Ciò li rende particolarmente adatti per studi che prevedono la somministrazione di farmaci o interventi chirurgici all'interno del vitreo o della retina che altrimenti potrebbero essere difficili o impossibili in un occhio più piccolo³.

L'immunoistochimica (IHC) è una tecnica ampiamente utilizzata per studiare la localizzazione degli antigeni all'interno di un tessuto e ha ampie applicazioni nella ricerca retinica ^4,5,6. Poiché la retina è una struttura delicata, ottenere risultati utili tramite IHC richiede un'attenta elaborazione dei tessuti. Il distacco della retina e altri artefatti tissutali come rotture o pieghe retiniche si verificano comunemente durante l'elaborazione e possono interferire con l'interpretazione dei risultati. Il successo dell'elaborazione dipende da una varietà di fattori, tra cui la manipolazione dei tessuti, il tipo e la durata della fissazione, il tipo di terreno di inclusione e le tecniche di sezionamento 7,8,9,10. Nonostante i vantaggi dell'utilizzo dei conigli come modello animale nella ricerca retinica, esistono pochissimi protocolli che descrivono il successo dell'elaborazione tissutale della retina del coniglio. Questo articolo descrive un metodo affidabile per ottenere sezioni retiniche di alta qualità da occhi di coniglio interi per l'uso nell'IHC.

Protocollo

Tutte le procedure sono state eseguite in conformità e approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della University of Southern California. Quattordici (n = 14) conigli con cintura olandese di età compresa tra 4 e 6 mesi sono stati utilizzati nello sviluppo di questo protocollo. Venivano utilizzati sia animali maschi che femmine. Tutti gli animali pesavano tra 2,0 e 2,5 kg. Tutti gli animali erano alloggiati singolarmente. Un elenco dei materiali e delle attrezzature consigliate è disponibile nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione

1. Preparazione fissativa.
   1. Preparare il 4% di paraformaldeide (PFA) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Come minimo, sono necessari 50 ml di fissativo per occhio.
2. Preparazione dell'agente crioprotettivo.
   1. Preparare il 30% in peso in volume (p/v) di saccarosio in PBS. Porre su uno shaker per almeno 15 minuti per assicurarsi che il saccarosio sia completamente sciolto. Come minimo, sono necessari 50 ml di agente crioprotettivo per occhio.
3. Preparazione dello strumento di dissezione.
   1. Raccogli due paia di pinze, un paio di forbici curve, una lama di bisturi e un piatto di dissezione da 100 mm e posizionali vicino a un microscopio da dissezione. Un esempio di configurazione è mostrato nella Figura 1A.

2. Fissazione iniziale

1. Dopo l'enucleazione transcongiuntivale¹¹, posizionare immediatamente l'occhio in almeno 50 mL di PFA al 4% in PBS su ghiaccio. Assicurarsi che l'occhio sia completamente sommerso. Se si accumulano bolle d'aria sulla superficie esterna dell'occhio, rimuoverle agitando delicatamente.

3. Rimozione della cornea e dell'iride

1. Dopo 15 minuti, rimuovere l'occhio dal 4% di PFA in PBS e posizionarlo in una capsula di dissezione da 100 mm al microscopio da dissezione. Riempi il piatto con PBS per evitare che l'occhio si secchi.
2. Rimuovere la cornea.
   1. Iniziare creando un'incisione con una lama chirurgica 1 mm anteriormente al limbus, parallela al piano dell'iride per evitare di perforare accidentalmente le strutture sottostanti (Figura 1B).
   2. Inserire le forbici curve nell'incisione iniziale e continuare a tagliare circonferenzialmente rimanendo a 1 mm dal limbus. Utilizzare una pinza per stabilizzare l'occhio durante il taglio (Figura 1C).
   3. Una volta completato il taglio circonferenziale, rimuovere la cornea con una pinza e rimuovere delicatamente il PBS in eccesso con una salvietta da laboratorio. Posizionare la cornea in una soluzione di saccarosio al 30% a temperatura ambiente (RT) per la crioprotezione o scartarla. La crioprotezione è completa quando la cornea affonda, il che in genere richiede meno di 1 ora.
3. Rimuovi l'iride.
   1. Inizia facendo un taglio iniziale con le forbici curve attraverso l'iride. Separare completamente l'iride dal resto del tessuto tagliando circonferenzialmente in modo simile alla rimozione della cornea (Figura 1D).
   2. Una volta completato il taglio circonferenziale, rimuovere l'iride con una pinza e rimuovere delicatamente la PBS in eccesso con una salvietta da laboratorio. Posizionare l'iride in una soluzione di saccarosio al 30% a RT per la crioprotezione o scartare come sopra. La crioprotezione è completa quando l'iride affonda, che in genere richiede meno di 30 minuti.

4. Completamento del fissaggio

1. Con la cornea e l'iride rimosse, posizionare l'occhio in almeno 50 ml di PFA al 4% appena preparato in PBS e metterlo su uno shaker per un'agitazione delicata. Assicurarsi che l'occhio rimanga immerso durante l'agitazione.
2. Tenere d'occhio il 4% di PFA in PBS a 4 °C durante la notte.
   NOTA: Abbiamo scoperto che il 4% di PFA si traduce in un'eccellente colorazione IHC se utilizzato tra 16 ore e 24 ore a 4 °C, con durate di fissazione più lunghe con conseguente aumento della colorazione di fondo aspecifica e del mascheramento degli epitopi.

5. Rimozione dell'obiettivo

1. La mattina seguente, rimuovere l'occhio dal 4% di PFA in PBS e posizionarlo in una capsula di dissezione da 100 mm al microscopio da dissezione. Riempi il piatto con PBS per evitare che l'occhio si secchi.
2. Rimuovere l'obiettivo.
   1. Inizia afferrando con cura la capsula anteriore del cristallino con una pinza.
      NOTA: Fare molta attenzione a non spingere o tirare con forza la lente con la pinza in quanto ciò può creare un distacco della retina.
   2. Inserire con cautela le forbici nella camera posteriore con le lame curvate posteriormente lungo la lente. Eseguire un taglio iniziale attraverso le zonule della lente con le forbici curve.
      NOTA: Fare molta attenzione a non spingere o tirare con forza le zonule con le forbici in quanto ciò può creare un distacco della retina (Figura 1E).
   3. Continuare a fare piccoli tagli attraverso le zonule della lente in uno schema circonferenziale. Fai da tre a cinque tagli per ora d'orologio.
   4. Per verificare se il cristallino è separato dal resto del tessuto, afferrare delicatamente la capsula anteriore del cristallino con una pinza e tentare di sollevarla delicatamente. Se la lente non si solleva immediatamente, non tentare di tirare di più in quanto ciò può creare un distacco della retina. Invece, fai più tagli attraverso le zonule rimanenti dell'obiettivo e riprova.
   5. Una volta separata dal resto del tessuto, posizionare la lente in una soluzione di saccarosio al 30% a RT per la crioprotezione o scartare come sopra. La crioprotezione è completa quando la lente affonda, il che in genere richiede alcune ore.
3. Posizionare l'occhio in almeno 50 ml di saccarosio al 30% in PBS a 4 °C per la crioprotezione. La crioprotezione è completa quando l'occhio affonda, il che richiede in genere 24-48 ore. Per accelerare la crioprotezione, sostituire la soluzione iniziale di saccarosio con una nuova dopo 8-12 ore e/o tenere l'occhio in soluzione di saccarosio a RT.

6. Incorporamento

1. Una volta completata la crioprotezione, rimuovere l'occhio dalla soluzione di saccarosio al 30% e posizionarlo in una capsula di dissezione da 100 mm al microscopio da dissezione. Capovolgere con cura l'occhio in modo che sia rivolto verso il basso per rimuovere la soluzione di saccarosio in eccesso dalla parte interna dell'occhio.
   NOTA: Non tentare di rimuovere la soluzione in eccesso dalla parte interna dell'occhio con una salvietta da laboratorio poiché la salvietta può attaccarsi al corpo vitreo e provocare un distacco della retina.
2. Con l'occhio rivolto verso il basso, rimuovere delicatamente la soluzione di saccarosio in eccesso dalla parte esterna dell'occhio con una salvietta.
3. Riempire uno stampo da inclusione monouso con un composto per temperatura di taglio ottimale (OCT) a una profondità di 0,5-1,0 cm.
   NOTA: Questa base assicura che l'occhio non tocchi il fondo dello stampo, il che interferisce con la criosezione successiva.
4. Posizionare l'occhio nello stampo da inclusione monouso rivolto verso l'alto. Riempire lentamente la parte interna dell'occhio con OCT, prestando particolare attenzione per evitare la formazione di bolle all'interno dell'occhio. Se si formano delle bolle, rimuoverle con cura o spingerle fino al bordo dello stampo usando una pinza.
5. Termina di riempire lo stampo da inclusione usa e getta con OCT. Assicurati che l'occhio sia completamente immerso nell'OCT e non tocchi le superfici interne dello stampo o sia esposto all'aria. Avvolgere lo stampo monouso per l'inclusione contenente l'occhio in OCT in parafilm; Porre a 4 °C per una notte.
   NOTA: Nella nostra esperienza, periodi di incubazione più brevi non consentono all'OCT di infiltrarsi completamente nel vitreo. Di conseguenza, uno strato di saccarosio rimane spesso tra la retina e l'OCT. Quando ciò si verifica, la retina spesso si stacca o si strappa completamente dal resto del tessuto durante la criosezione poiché il saccarosio congelato probabilmente fornisce meno supporto strutturale rispetto all'OCT congelato, rendendo difficili o addirittura impossibili ottenere sezioni di alta qualità.
6. La mattina seguente, posizionare lo stampo di inclusione contenente l'occhio in OCT in una capsula di dissezione da 100 mm al microscopio da dissezione. Verificare che la membrana ialoide posteriore appaia sollevata verso l'alto dalla retina interna.
   NOTA: Questo sollevamento verso l'alto può oscurare la visione della retina, rendendo difficile determinare l'orientamento.
7. Per determinare meglio l'orientamento dell'occhio, afferrare con attenzione la membrana ialoide posteriore anteriormente e tentare di staccarla con una pinza per esporre la retina sottostante mentre si è in OCT.
   NOTA: A volte, può essere visibile il canale ialoide, che si attacca alla testa del nervo ottico e può essere utilizzato per scopi di orientamento poiché la testa del nervo ottico si trova nella parte superiore della retina (Figura 2A). Non è necessario rimuovere completamente la membrana ialoide posteriore poiché l'OCT si è già infiltrato nel corpo vitreo per rivestire la retina interna e l'eventuale membrana rimanente non influenzerà la criosezione (Figura 2B). La membrana ialoide posteriore deve essere rimossa solo per l'orientamento, se necessario. Altre opzioni per determinare l'orientamento includono il posizionamento di una sutura o di un altro tipo di segno prima dell'enucleazione.
8. Trasferire l'occhio in un nuovo stampo da inclusione con nuovo OCT riempito a una profondità di 0,5-1,0 cm e quindi riempire con nuovo OCT come nei passaggi 6.3-6.5 per garantire che il mezzo di inclusione finale sia privo di detriti e/o altre imperfezioni che potrebbero essersi accumulate durante la notte. Se possibile, rimuovere delicatamente l'OCT con una salvietta anche dall'interno dell'occhio, anche se questo non è necessario.
9. Etichettare lo stampo a scopo di orientamento (Figura 2C). Orientare l'occhio con l'occhio rivolto verso l'alto nello stampo criogenico assicura che l'OCT rilineerà la retina interna. Il canale ialoide, che si attacca alla testa del nervo ottico, è un punto di riferimento importante per determinare la parte superiore dell'occhio (Figura 2A).
10. Posizionare lo stampo da inclusione etichettato contenente l'occhio nell'OCT sopra il ghiaccio secco. Assicurarsi che l'occhio non tocchi nessuna delle superfici interne dello stampo di inclusione o sia esposto all'aria. Assicurarsi che lo stampo tocchi direttamente il ghiaccio secco per accelerare il processo di congelamento (Figura 2D).
11. Trasferire l'occhiello incorporato in un congelatore a -80 °C o direttamente nel criostato per il sezionamento (Figura 2E).

7. Criosezione

1. Montare il blocco con la parte superiore dell'occhio rivolta verso l'esterno e la parte inferiore dell'occhio rivolta verso il basso, con la cornea e l'iride rimanenti rivolte a destra (come nella Figura 2E) o a sinistra (non mostrata). In alternativa, montare il blocco con un orientamento diverso, a seconda delle esigenze. Se necessario, rompere lo stampo per mobilizzare il blocco rompendo con cura ogni lato dello stampo uno alla volta e segnando direttamente il blocco per non perdere l'orientamento dell'occhio.
2. Lasciare che il blocco si equilibri alla temperatura all'interno del criostato per 30-60 minuti; -20 °C è un buon punto di partenza.
3. Una volta montata, posizionare una lama nuova all'angolazione desiderata, tipicamente parallela all'asse verticale dell'occhio.
4. Impostare lo spessore della sezione come desiderato: le sezioni spesse 10-20 μm sono un buon punto di partenza. Un esempio di sezione spessa 14 μm è illustrato nella Figura 3A-C.
   1. In modo lento e controllato, inizia a sezionare il blocco. Assicurarsi che la lama stia tagliando il blocco parallelamente all'asse verticale dell'occhio. In caso contrario, regolare l'angolo in cui la lama entra in contatto con il blocco o l'orientamento del tavolino di conseguenza.
   2. Durante il sezionamento del blocco, evitare che la sezione si raggrinzisca o si arricci con una spazzola. Capovolgi rapidamente la sezione e applica una leggera pressione verso il basso con una spazzola a pelo lungo per appiattire la sezione e ridurre al minimo le rughe o l'arricciamento. Modellare un pennello separato con una punta appuntita per facilitare la manipolazione della sezione.
5. Fissare la sezione a un vetrino caricato spostando lentamente il vetrino rivolto verso il basso verso la sezione. Evitare che la sezione si pieghi su se stessa o si deformi in altro modo durante il fissaggio facendo rotolare delicatamente il vetrino sulla sezione.
   NOTA: Non posizionare la diapositiva direttamente sopra la sezione o premerla contro la sezione in quanto ciò potrebbe danneggiare o distorcere la sezione.
6. Lasciare asciugare i vetrini per una notte prima di trasferirli in un congelatore a -80 °C o procedere direttamente a un protocollo di immunofluorescenza standard.

Risultati

Dopo l'elaborazione dei tessuti, un protocollo standard di immunofluorescenza può essere utilizzato per studiare un numero qualsiasi di processi biologici all'interno della retina. Le figure 3A-C illustrano immagini a fluorescenza rappresentative di una sezione retinica ottenute tramite microscopia confocale. La sezione retinica è stata immunocolorata secondo un protocollo¹² precedentemente descritto.

Le ...

Discussione

Prima di implementare il protocollo di cui sopra, abbiamo costantemente riscontrato difficoltà con l'elaborazione tissutale degli occhi di coniglio per l'IHC. Avevamo adattato diversi protocolli dagli occhi di animali più piccoli come i topi, ma abbiamo scoperto che questi portavano a una fissazione inadeguata e difficoltà con il sezionamento dei tessuti. Ci sono diverse considerazioni importanti che consentono sezioni coerenti e di alta qualità della retina del coniglio.

Una considerazion...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm culture dish	Corning	353025	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
50 mL tube	Genesee Scientific	28-106	For fixation and cryoprotection (step 1)
Cryostat	Leica	CM1850	For cryosectioning (step 7)
Curved scissors	Fine Science Tools	91500-09	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
DAPI	Fisher Scientific	D3571	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000-C	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Donkey anti-Goat 488	Fisher Scientific	A-11055	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Donkey anti-Mouse 555	Fisher Scientific	A-31570	Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Forceps	Fine Science Tools	91150-20	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Glass Slide Cover	VWR	48404-453	For cryosectioning (step 7)
Goat anti-SOX2	R&D Systems	AF2018	Diluted 1:100 in blocking buffer
High-profile disposable cryostat blades	Leica Microsystems Inc.	14035838926	For cryosectioning (step 7)
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666-A	Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6)
Mouse anti-RPE65	Novus Bio	NB100-355SS	Diluted 1:100 in blocking buffer
OmniPur Sucrose	Millipore	167117	Used for cryoprotectant (step 1.2)
Paraformaldehyde 20% solution	Electron Microscopy Sciences	15713	Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1)
Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep)	Polysciences, Inc.	18646A	Used as embedding mold (step 6)
Phosphate buffered saline, 1x	Corning	21-030-CV	Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2)
Scalpel blade no. 15	Feather	08-916-5D	Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	For cryosectioning (step 7)
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Used as embedding media (step 6)