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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Per rispondere alle esigenze diagnostiche urgenti della dengue, qui presentiamo un dispositivo analitico cartaceo Dengue NS1 integrato nell'app per smartphone (DEN-NS1-PAD) per quantificare la concentrazione dell'antigene Dengue NS1 in campioni clinici di siero/sangue. Questa innovazione migliora la gestione della dengue aiutando il processo decisionale clinico in vari contesti sanitari, anche quelli con risorse limitate.

Abstract

L'infezione da virus della dengue (DENV), trasmessa dalle zanzare Aedes , è una delle principali preoccupazioni per la salute pubblica nei paesi tropicali e subtropicali. Con un'incidenza annua di circa 10 milioni di casi e 20.000-25.000 decessi, in particolare tra i bambini, c'è un urgente bisogno di strumenti diagnostici pratici. La presenza della proteina non strutturale 1 (NS1) della dengue durante l'infezione precoce è stata collegata al rilascio di citochine, alla perdita vascolare e alla disfunzione endoteliale, rendendola un potenziale marcatore per la dengue grave.

I test immunologici cartacei, come i saggi a flusso laterale (LFA) e i dispositivi analitici microfluidici basati su carta (PAD), hanno guadagnato popolarità come test diagnostici grazie alla loro semplicità, rapidità, economicità, specificità e facilità di interpretazione. Tuttavia, i test immunologici convenzionali su carta per la rilevazione della dengue NS1 si basano in genere sull'ispezione visiva, producendo solo risultati qualitativi. Per ovviare a questa limitazione e migliorare la sensibilità, abbiamo proposto un test di rilevamento della dengue NS1 altamente portatile su un dispositivo analitico (PAD) basato su carta, ovvero DEN-NS1-PAD, che integra un'applicazione per smartphone come lettore colorimetrico e quantitativo. Il sistema di sviluppo consente la quantificazione diretta delle concentrazioni di NS1 nei campioni clinici.

I campioni di siero e di sangue ottenuti dai pazienti sono stati utilizzati per dimostrare le prestazioni del prototipo del sistema. I risultati sono stati ottenuti immediatamente e possono essere utilizzati per la valutazione clinica, sia in strutture sanitarie ben attrezzate che in contesti con risorse limitate. Questa combinazione innovativa di un test immunologico cartaceo con un'applicazione per smartphone offre un approccio promettente per migliorare il rilevamento e la quantificazione dell'antigene NS1 della dengue. Aumentando la sensibilità oltre le capacità dell'occhio nudo, questo sistema ha un grande potenziale per migliorare il processo decisionale clinico nella gestione della dengue, in particolare in aree remote o scarsamente servite.

Introduzione

L'infezione da virus dengue (DENV) è la malattia trasmessa dalle zanzare a più rapida diffusione1 e più di 390 milioni di persone sono infettate da 96 milioni di infezioni sintomatiche, 2 milioni di casi di malattia grave e più di 25.000 decessi all'anno si verificano nel mondo 1,2. Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), si stima che 3,9 miliardi di persone siano a rischio di dengue; ~70% vive nei paesi dell'Asia-Pacifico e principalmente nel sud-est asiatico3. Nel 2019, il numero di casi di dengue segnalati all'OMS è stato di 4,2 milioni e la Thailandia ha contribuito con almeno 136.000 casi di dengue e 144 casi di morte per infezione da dengue4. L'epidemia di dengue in Thailandia si verifica durante la stagione delle piogge, da aprile a dicembre, sia nelle aree urbane che in quelle rurali, soprattutto nell'area nord-orientale.

Le infezioni da DENV hanno diverse manifestazioni cliniche che vanno dai sintomi subclinici, alla febbre dengue lieve (DF) alla febbre emorragica dengue grave (DHF). La caratteristica principale di una grave condizione di DHF è l'aumento della permeabilità vascolare seguito da shock e disfunzione d'organo1. Comprendere il percorso molecolare che può causare la perdita vascolare è molto importante nello sviluppo di trattamenti efficaci per la dengue. La proteina non strutturale 1 (NS1) della dengue è una glicoproteina secreta durante l'infezione viraleprecoce 5,6 e funziona come cofattore per la replicazione dell'RNA virale7. NS1 può innescare il rilascio di citochine e contribuire alla perdita vascolare legandosi al recettore toll-like 4 (TLR4) e al glicocalice endoteliale 8,9. La ricerca in vitro ha dimostrato che NS1 interagisce con le cellule endoteliali e induce l'apoptosi. Questa condizione può contribuire alla disfunzione endoteliale e alla perdita vascolare10. I livelli sierici dell'antigene NS1, correlati con i livelli sierici di interleuchina (IL)-10, sono aumentati significativamente nei pazienti con malattia clinica grave11. La dengue NS1 contribuisce anche alla patogenesi della malattia inducendo IL-10 e sopprimendo le risposte delle cellule T specifiche per DENV12,13. Inoltre, la proteina NS1 della dengue è stata correlata a una grave malattia clinica e la concentrazione di NS1 > 600 ng mL-1 nei primi 3 giorni di malattia è stata associata allo sviluppo di DHF14.

La persistenza dell'antigene NS1 della dengue nei pazienti con DHF potrebbe essere utilizzata come marcatore di dengue6 grave. Esistono diversi metodi per rilevare NS1 nei campioni clinici, come il test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) e il test rapido15. Il gold standard per misurare la concentrazione di proteine NS1 in ambito clinico è il metodo ELISA. Tuttavia, il metodo ELISA è costoso e richiede personale qualificato e strutture di laboratorio16. Pertanto, lo sviluppo di una tecnologia per rilevare e quantificare le proteine NS1 nel test point-of-care (POCT) è ancora in corso. Nell'ultimo decennio, i test immunologici cartacei come i saggi a flusso laterale (LFA) e i dispositivi analitici microfluidici basati su carta (μPAD) sono diventati popolari come test diagnostici grazie alla loro semplicità, rapidità, economicità e specificità 17,18,19. In un test immunologico su carta, sono state utilizzate diverse etichette per generare segnali, come nanoparticelle d'oro (AuNPs)20, nanoparticelle magnetiche21,22, punti quantici23 e materiali fluorescenti24,25. Le AuNP sono le etichette più comuni utilizzate nei test immunologici cartacei grazie al loro basso costo di produzione, alla facilità di fabbricazione, alla stabilità e alla semplice lettura. Attualmente, i saggi a flusso laterale (LFA) per la dengue NS1 sono notoriamente utilizzati in ambito clinico26,27. Tuttavia, il rilevamento convenzionale delle etichette LFA utilizza comunemente l'occhio nudo e fornisce solo risultati qualitativi.

Nell'ultimo decennio, più di 5 miliardi di smartphone sono stati ampiamente utilizzati a livello globale e c'è il potenziale per sviluppare il rilevamento portatile28,29. Gli smartphone hanno capacità multifunzionali come sensori fisici integrati, processori multi-core, fotocamere digitali, porte USB, porte audio, wireless e software applicativo, che li rendono adatti per l'uso in varie piattaforme di biosensori30. Inoltre, le tecnologie wireless consentono di inviare rapidamente i dati e possono essere utilizzate per il monitoraggio in tempo reale e in loco31. Mudanyali et al. hanno combinato il test immunologico cartaceo e gli smartphone per sviluppare una piattaforma POCT portatile, senza apparecchiature, rapida, a basso costo e facile da usare per la malaria, la tubercolosi e l'HIV32. Ling et al. hanno riportato un test a flusso laterale combinato con la fotocamera di uno smartphone per rilevare quantitativamente l'attività della fosfatasi alcalina nel latte33. Hou et al. hanno anche sviluppato un sistema di imaging a doppia modalità basato su smartphone per segnali quantitativi da colore o fluorescenza nel saggio a flusso laterale34. Inoltre, l'utilizzo dello smartphone come lettore colorimetrico e quantitativo può migliorare la sensibilità mentre l'occhio nudo non può segnalare con sicurezza la presenza del target35.

Rappresentando una svolta nella diagnostica della dengue, il DEN-NS1-PAD 36,37,38 (d'ora in poi denominato dispositivo) offre una soluzione portatile ed efficiente. Utilizzando la tecnologia microfluidica a base di carta stampata a cera, questo dispositivo quantifica NS1 con elevata sensibilità e specificità attraverso l'elaborazione delle immagini. Per migliorarne ulteriormente l'utilità, abbiamo sviluppato un'app per smartphone di facile utilizzo per la lettura colorimetrica e quantitativa. La convalida clinica utilizzando campioni di pazienti provenienti da ospedali thailandesi sottolinea il suo impatto immediato sulla valutazione dei pazienti in tempo reale. La nostra innovazione segna un progresso fondamentale nella gestione semplificata della dengue point-of-care, promettendo di rivoluzionare la diagnostica in ambienti sanitari con risorse limitate.

Protocollo

Il Comitato Etico dell'Institutional Review Board, Royal Thai Army Medical Department, Phramongkutklao Hospital, Bangkok, Thailandia (IRBRTA 1218/2562) ha concesso l'approvazione. Nell'effettuare questo studio, abbiamo rispettato tutte le normative etiche necessarie.

1. Fabbricazione del dispositivo del test immunologico su carta

NOTA: Il dispositivo di dosaggio immunologico su carta è stato fabbricato seguendo i metodiprecedentemente stabiliti 36,37 e la richiesta di brevetto tailandese n. 19010081638.

  1. Progettazione e disegno del modello: Progettare il dispositivo analitico cartaceo (Figura 1A,B) con 18 modelli in cera PAD su un computer.
    NOTA: Il design è specifico e destinato alla carta in formato A5. Il numero di PAD è correlato alle dimensioni della carta, come richiesto dall'utente.
  2. Stampa il modello disegnato sulla carta di cellulosa utilizzando una stampante a cera (Tabella dei materiali).
  3. Sciogliere la carta cerata in forno da laboratorio per 75 secondi a 150 °C. Successivamente, conservarlo in una scatola di silice fino al momento del bisogno per i passaggi successivi.
  4. Applicare 0,5 μL di poli-L-lisina (PLL) allo 0,025% sia nell'area di prova che in quella di controllo. Incubare a temperatura ambiente (RT) per 2 minuti in una scatola di silice e poi riscaldare in forno a 65 °C per 5 minuti.
  5. Applicare 0,5 μL di 1 μg μL-1 di anticorpo IgG anti-topo di capra sull'area di controllo e 0,5 μL di 1 μg μL-1 dell'anticorpo di cattura sull'area del test. Lasciare asciugare le gocce in una scatola di gel di silice a RT per 30 minuti.
  6. Applicare 2 μL del tampone di blocco sull'area del campione, 3 μL sull'area coniugata e 2 μL sull'area di rilevamento. Lasciare asciugare le gocce a RT in una scatola di gel di silice per 30 min.
  7. Applicare 2 μL di soluzione di complesso nanoparticella-anticorpo d'oro (AuNPs-Ab) sull'area coniugata e lasciare asciugare in una scatola di gel di silice a RT per 30 minuti.

2. Assemblaggio del test immunologico cartaceo

  1. Rimuovere con cautela la pellicola protettiva sul retro della carta di supporto in plastica adesiva per esporre l'adesivo.
  2. Allineare la carta di cellulosa trattata con il cartoncino di plastica adesiva e premere saldamente i due strati insieme.
    NOTA: Evitare di toccare il campo idrofilo per ridurre al minimo il rischio di contaminazione o danni al dispositivo.
  3. Applicare una pellicola di plastica per rivestire la carta e premerle insieme.
  4. Tagliare il pezzo di dispositivi desiderato usando le forbici da fogli di dispositivi completamente assemblati.
  5. I DEN-NS1-PAD (Figura 1C) sono ora pronti per l'uso. Per una stabilità a lungo termine, conservarli a 4 °C.

3. Preparazione del coniugato AuNPs-Ab

NOTA: L'AUNPS-Ab è stato preparato come descritto in precedenza da Prabowo et al.36.

  1. Combinare 10 μL di 1 mg di anticorpo anti-NS1 mL−1 in PBS, 1 mL di colloide AuNPs da 40 nm e 0,1 mL di tampone borato 0,1 M (pH 8,5).
  2. Ruotare la miscela a 50 rpm per 60 min e incubare a RT.
  3. Applicare 0,1 mL di 10 mg mL−1 BSA in BBS, ruotare a 50 rpm e incubare a RT per 15 min.
  4. Centrifugare la soluzione a 20.187 × g e 4 °C per 30 min.
  5. Pipettare con cura e separare il surnatante dalle AuNPs-Ab precipitate.
  6. Risospendere gli AuNPs-Ab in 500 μL di BBS e disperderli utilizzando la sonicazione.
  7. Ripetere la centrifugazione a 20.187 × g e 4 °C per 30 min.
    NOTA: Ripetere i processi di dispersione e centrifugazione 3 volte.
  8. Aggiungere 50 μL di tampone coniugato alla sospensione, rendendola pronta per l'applicazione sull'area coniugata.

4. Sviluppo di applicazioni mobili

  1. Sviluppo dell'elaborazione delle immagini e dell'apprendimento automatico
    1. Raccogli un set di dati per un modello di immagine supervisionato raccogliendo oltre 900 immagini con messa a fuoco automatica di DEN-NS1-PAD, catturando varie condizioni come diverse concentrazioni, marche di telecamere (12-13 megapixel), rotazioni (90° e 180°) e impostazioni di illuminazione. Punta a 30 immagini in ogni condizione specifica.
    2. Etichettare la verità di base identificando e annotando due regioni di interesse come aree di test e controllo all'interno delle immagini raccolte per l'apprendimento supervisionato.
    3. Progetta un algoritmo per identificare la striscia di sfondo. Individuare la linea centrale tra le regioni di test e di controllo, calcolarne il punto medio e stabilire una regione quadrata proporzionale alla dimensione media delle due regioni principali mantenendo lo stesso orientamento di rotazione.
    4. Creare un modello di segmentazione delle immagini utilizzando il set di dati e le etichette di verità di base dei passaggi 4.1.1 e 4.1.2 per eseguire il training di un modello di segmentazione delle immagini per identificare le aree di interesse.
  2. Algoritmo dell'applicazione
    1. Applicare il modello di segmentazione delle immagini sottoposto a training alle nuove immagini per individuare automaticamente le aree di test, controllo e sfondo.
    2. Utilizzare le tecniche di elaborazione delle immagini di base per ottenere un singolo valore di intensità per ciascuna delle tre aree di interesse (test, controllo e sfondo).
    3. Trasforma l'immagine in una rappresentazione di matrice 3D (canale y, x) per accedere ai valori dei pixel.
    4. Converti l'immagine in scala di grigi calcolando la media dei valori RGB e applica l'inversione con la formula (255-x).
    5. Normalizzare i valori dell'area di test e di controllo sottraendo il valore dell'area di sfondo.
    6. Utilizzare la curva di calibrazione prestabilita per calcolare la concentrazione di NS1.
    7. Classificare i risultati come positivi o negativi in base a un valore di cut-off di 0,1103 derivato dalle intensità normalizzate della scala di grigi37.

5. Curva di calibrazione e sensibilità

  1. Preparare il campione NS1 nel siero umano per la calibrazione con concentrazioni di 0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 e 1,0 μg mL-1.
  2. Far cadere 50 μL di ciascuna concentrazione sull'area del campione ed eseguire le misurazioni in triplice copia.
  3. Lasciare che i campioni si assorbano completamente nel dispositivo, operazione che potrebbe richiedere 20-30 minuti per ottenere i risultati.
  4. Cattura le immagini del dispositivo utilizzando una fotocamera digitale o uno smartphone dopo 5 minuti di incubazione.
  5. Analizza le aree di test e controllo utilizzando ImageJ e un'applicazione mobile personalizzata.
  6. Costruisci la curva di calibrazione in base ai dati di ImageJ e dell'applicazione mobile.
  7. Calcola il limite del bianco (LOB), il limite di rilevamento (LOD) e il limite di quantificazione (LOQ) utilizzando le equazioni (1-3) seguenti:
    LOB = Media dei dati bianchi + 1:645* ð (deviazione standard dei dati bianchi) (1)
    LOD = LOB +1:645*ð (deviazione standard dei dati di concentrazione più bassa) (2)
    LOQ = Media dei dati in bianco + 10*ð (deviazione standard dei dati in bianco) (3)

6. Esecuzione di un test immunologico cartaceo con campioni clinici

  1. Raccogliere e processare 300 μL di sangue periferico da 30 pazienti il primo giorno di ricovero in provette EDTA viola superiori, seguendo le buone pratiche cliniche.
  2. Centrifugare il sangue a 2.884 × g e 4 °C per 20 min.
  3. Trasferire il componente liquido (plasma) in una provetta di polipropilene pulita utilizzando una pipetta.
  4. Conservare immediatamente il plasma nel congelatore a −20 °C per l'analisi successiva.
  5. Applicare 20 μL di plasma sull'area del campione sulla parte superiore del dispositivo. Quindi, aggiungere 30 μL di tampone di lavaggio (0,05% v/v Tween 20 in soluzione salina tamponata con fosfato).
  6. Lasciare che il campione penetri completamente nel dispositivo, operazione che potrebbe richiedere 20-30 minuti per ottenere i risultati.
  7. Cattura le immagini del dispositivo utilizzando una fotocamera digitale o uno smartphone dopo 5 minuti di incubazione a temperatura ambiente.
  8. Analizza le aree di test e controllo utilizzando ImageJ e un'applicazione mobile personalizzata.

7. Quantificazione con applicazione mobile

NOTA: L'intensità del test immunologico cartaceo viene analizzata nell'applicazione mobile (Figura 2).

  1. Apri l'applicazione mobile sviluppata sullo smartphone.
  2. Seleziona Usa fotocamera o Carica dalla galleria per scegliere o caricare l'origine dati. Fallo tramite l'acquisizione della fotocamera o selezionando un'immagine dalla galleria del dispositivo.
  3. Passare alla sezione analitica e toccare il pulsante Analizza sullo schermo.
  4. Attendere che l'applicazione analizzi i dati e visualizzi i risultati.

Risultati

La scelta di un metodo di fabbricazione è fondamentale per garantire prestazioni di dosaggio riproducibili nei dispositivi di dosaggio immunologico su carta. Nel nostro studio, abbiamo esplorato vari processi di produzione e materiali nel contesto della dimostrazione di un test immunologico su carta. Il metodo scelto utilizza un sistema di stampa a cera per creare barriere idrofobiche all'interno di dispositivi microfluidici a base di carta. Questo approccio si distingue per la sua semplicità, velocità e risultati coe...

Discussione

Uno dei parametri di progettazione importanti per un sistema di lettura basato su smartphone è la capacità di fornire un'elaborazione riproducibile delle immagini dei campioni. In questo studio, per semplicità e praticità, le immagini sono state catturate da tre diverse marche di smartphone con fotocamere da 12-13 MP senza l'utilizzo di una scatola di imaging o accessori. Le condizioni variabili di acquisizione dell'immagine, come la risoluzione della fotocamera, il tempo di acquisizione dell'immagine, le condizioni ...

Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Riconoscimenti

M.H.P. ringrazia il fondo di ricerca per le borse di studio dell'Universitas Islam Indonesia (UII). Gli autori estendono la loro gratitudine a Mr. Nutchanon Ninyawee per la sua preziosa esperienza e assistenza durante lo sviluppo dell'applicazione mobile e per i suoi contributi al manoscritto. Inoltre, gli autori apprezzano il sostegno finanziario fornito da Thailand Science Research and Innovation (TSRI), Basic Research Fund: Fiscal year 2023 (progetto n. FRB660073/0164) nell'ambito del programma Smart Healthcare dell'Università di Tecnologia di Thonburi di King Mongkut.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Materials
0.1 M phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2) 
BBS containing 0.1% Tween 20, 10% sucrose, and 1% casein  the conjugate area treatment and blocking buffer
Borate buffered saline (BBS) (25 mM sodium borate and 150 mM sodium chloride at pH 8.2) supplemented with 1% BSA the washing buffer during the conjugation process AuNPs with the antibody
Boric acidMerck10043-35-3
Bovine serum albumin fraction V (BSA)  PAA Lab GmbH (Germany)K41-001 
CaseinMerck9005-46-3
Chromatography paper Grade 2 GE Healthcare3002-911 
Clear laminate film3M (Stationery shops)
Disodium hydrogen phosphateMerck7558-79-4
Double tape sideStationery shops
Goat anti-mouse IgG antibody MyBiosource (USA)MBS435013
Gold nanoparticles (40 nm)  Serve Science Co., Ltd. (Thailand)
Human IgG polyclonal antibody  MerckAG711-M
Mouse dengue NS1 monoclonal antibody MyBiosource (USA)MBS834415
Mouse dengue NS1 monoclonal antibody MyBiosource (USA)MBS834236
NS1 serotype 2 antigensMyBiosource (USA)MBS 568697
PBS 1X containing 0.1% Tween 20 was used as telution buffer
Plastic backing card 10x30 cmPacific Biotech Co., Ltd. (Thailand)
Poly-L-lysine (PLL)Sigma AldrichP4832
Potassium ChlorideMerck104936
Potassium monophosphateMerck104877
Sodium ChlorideMerck7647-14-5
Sodium tetraborate Sigma Aldrich1303-96-4
SucroseMerck57-50-1
Tween 20Sigma Aldrich9005-64-5
Instruments
CytationTM 5 multimode readerBioTek
Mobile phonesHuawei Y7, iPhone 11, Samsung a20
Photo scannerEpson Perfection V30
OvenMemmert
Wax printer Xerox ColorQube 8880-PS
Software
Could AutoML Vision Object Detection documentationGoogle Cloud
ImageJNational Institute of Health, Bethesda, MD, USA
Inkscape 0.91 Software

Riferimenti

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