Epon Post Embedding Microscopia Ottica ed Elettronica Correlativa

Riepilogo

Presentiamo un protocollo dettagliato per la microscopia ottica ed elettronica correlativa post-embedding di Epon utilizzando una proteina fluorescente chiamata mScarlet. Questo metodo può mantenere contemporaneamente la fluorescenza e l'ultrastruttura. Questa tecnica è suscettibile di un'ampia varietà di applicazioni biologiche.

Abstract

La microscopia ottica ed elettronica correlativa (CLEM) è una microscopia completa che combina le informazioni di localizzazione fornite dalla microscopia a fluorescenza (FM) e il contesto dell'ultrastruttura cellulare acquisita dalla microscopia elettronica (EM). CLEM è un compromesso tra fluorescenza e ultrastruttura e, di solito, l'ultrastruttura compromette la fluorescenza. Rispetto ad altre resine di inclusione idrofile, come il glicidil metacrilato, HM20 o K4M, Epon è superiore nella conservazione dell'ultrastruttura e nelle proprietà di sezionamento. In precedenza, avevamo dimostrato che mEosEM può sopravvivere alla fissazione del tetrossido di osmio e all'inclusione di epon. Utilizzando mEosEM, abbiamo ottenuto, per la prima volta, Epon post embedding CLEM, che mantiene la fluorescenza e l'ultrastruttura contemporaneamente. Qui, forniamo dettagli dettagliati sulla preparazione del campione EM, l'imaging FM, l'imaging EM e l'allineamento dell'immagine. Miglioriamo anche le procedure per identificare la stessa cellula immaginata dall'imaging FM durante l'imaging EM e dettagliamo la registrazione tra le immagini FM e EM. Riteniamo che si possa facilmente ottenere la microscopia ottica ed elettronica correlativa post-embedding Epon seguendo questo nuovo protocollo nelle strutture EM tradizionali.

Introduzione

La microscopia a fluorescenza (FM) può essere utilizzata per ottenere la localizzazione e la distribuzione della proteina bersaglio. Tuttavia, il contesto che circonda la proteina bersaglio viene perso, il che è fondamentale per studiare a fondo la proteina bersaglio. La microscopia elettronica (EM) ha la più alta risoluzione di imaging, fornendo diversi dettagli subcellulari. Ciononostante, i mercati emergenti non dispongono di un'etichettatura target. Unendo accuratamente l'immagine di fluorescenza acquisita da FM con l'immagine grigia acquisita da EM, la microscopia elettronica e di luce correlativa (CLEM) può combinare le informazioni ottenute da queste due modali....

Protocollo

L'allevamento e gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali del Fujian Medical University Medical Center. Il flusso di lavoro dettagliato del protocollo corrente è illustrato nella Figura 1.

1. Preparazione del campione

1. Cervello di topo
   1. Acquistare topi transgenici (vedi Tabella dei materiali) e primer oligonucleotidici (vedi Tabella dei materiali) per genotipizzare questi topi.
   2. Perfondere e rimuovere il cervello intatto dalla volta cranica seguendo il protocollo^1....

Discussione

Il protocollo qui presentato è un metodo di imaging versatile, in grado di combinare le informazioni di localizzazione della proteina bersaglio dalla microscopia ottica (LM) e il contesto che circonda la proteina bersaglio dalla microscopia elettronica (EM)⁶. Con i limiti delle attuali proteine fluorescenti, il metodo ampiamente utilizzato è il pre-embedding della microscopia ottica ed elettronica correlativa (CLEM), il che significa che l'imaging LM viene eseguito prima della preparazione del c.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 M Phosphate Buffer (PB)			NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O
0.2 M Tris-Cl (pH 8.5)	Shanghai yuanye Bio-Technology	R26284
25% Glutaraldehyde (GA)	Alfa Aesar	A17876	Hazardous chemical
Abbelight 3D	Nanolnsights
Acetone	SCR	10000418
Ammonium hydroxide	J&K Scientific	335213
BioPhotometer D30	eppendorf
Cleaning buffer of cover glasses			50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O
Coverglass	Warner	64-0715
DABCO	Sigma	290734	Hazardous chemical
DDSA	SPI company	GS02827	Hazardous chemical
Desktop centrifuge	WIGGENS	MINICEN 10E
Diamond knife	DiATOME	MX6353
DMP-30	SPI company	GS02823	Hazardous chemical
DNA transfection reagent	Thermo Fisher	2696953	Lipofectamine 3000 Transfection Kit
Epon 812	SPI company	GS02659	Hazardous chemical
Ethanol	SCR	10009218
Fiji image J	National Institutes of Health
Fixative solution			4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB
Formvar	Sigma	9823
Glycerol	SCR	10010618
Gold nanoparticles	Corpuscular	790120-010
Gradient resin			Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3
Hydrofluoric acid	SCR	10011118
Hydrogen peroxide	SCR	10011218
ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/)			Easy CLEMv0 Plugin
Imaging chamber	Thermo Fisher	A7816
Large gelatin capsules	Electron Microscopy Sciences	70117
Mounting buffer			Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO
Mowiol 4-88	Sigma	9002-89-5
Na2HPO4 ž12H2O	SCR	10020318
NaH2PO4 ž2H2O	SCR	20040718
NMA	SPI company	GS02828	Hazardous chemical
Oligonucleotide primers	Takara Biomedical Technology (Beijing)		Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers  5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type.
Oscillating microtome	Leica	VT1000S
Osmium tetroxide	SCR	L01210302	Hazardous chemical
OsO4 solution			1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O
Parafilm	Amcor	PM-996
Paraformaldehyde (PFA)	SCR	80096618	Hazardous chemical
Perfusion buffer			4% PFA+0.1 M PB
Pioloform	Sigma	63148-65-2	Hazardous chemical
Poly-L-lysine	Sigma	25986-63-0
Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O)	SCR	10016818
Scalpel blades	Merck	S2771
Scalpel handles	Merck	S2896-1EA
Stereomicroscope	OLYMPUS	MVX10
Transgenic mice	The Jackson Laboratory		Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g.
Transmission electron microscope (TEM)	FEI		TECNAL G2
UA solution (2% UA)			Aqueous solution
Ultramicrotome	Leica	LEICA EM UC6
Uranyl acetate (UA)	TED PELLA	19481	Hazardous chemical