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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo che descrive la farmacologia di rete e le tecniche di docking molecolare per esplorare il meccanismo d'azione di Jiawei Shengjiang San (JWSJS) nel trattamento della nefropatia diabetica.

Abstract

Abbiamo mirato ad approfondire i meccanismi alla base dell'azione di Jiawei Shengjiang San (JWSJS) nel trattamento della nefropatia diabetica e nell'implementazione della farmacologia di rete. Utilizzando la farmacologia della rete e le tecniche di docking molecolare, abbiamo previsto i componenti attivi e i bersagli di JWSJS e costruito una meticolosa rete "farmaco-componente-bersaglio". Le analisi di arricchimento dell'ontologia genica (GO) e dell'enciclopedia di Kyoto dei geni e dei genomi (KEGG) sono state utilizzate per discernere i percorsi terapeutici e i bersagli dei JWSJ. Autodock Vina 1.2.0 è stato utilizzato per la verifica dell'attracco molecolare ed è stata condotta una simulazione di dinamica molecolare a 100 ns per confermare i risultati dell'attracco, seguita dalla verifica in vivo degli animali. I risultati hanno rivelato che JWSJS condivideva 227 bersagli intersecanti con la nefropatia diabetica, costruendo una topologia di rete di interazione proteina-proteina. L'analisi dell'arricchimento KEGG ha denotato che JWSJS mitiga la nefropatia diabetica modulando i lipidi e l'aterosclerosi, la via di segnalazione PI3K-Akt, l'apoptosi e la via di segnalazione HIF-1, con la proteina chinasi 1 attivata dal mitogeno (MAPK1), MAPK3, il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) e la serina/treonina-proteina chinasi 1 (AKT1) identificati come bersagli collettivi di più percorsi. Il docking molecolare ha affermato che i componenti principali di JWSJS (quercetina, acido palmitoleico e luteolina) potrebbero stabilizzare la conformazione con tre bersagli cardine (MAPK1, MAPK3 e EGFR) attraverso il legame idrogeno. Gli esami in vivo hanno indicato un notevole aumento del peso corporeo e riduzioni delle proteine sieriche glicate (GSP), del colesterolo lipoproteico a bassa densità (LDL-C), dell'uridina trifosfato (UTP) e dei livelli di glucosio nel sangue a digiuno (FBG) dovuti a JWSJS. La microscopia elettronica accoppiata con ematossilina ed eosina (HE) e la colorazione periodica con acido-Schiff (PAS) hanno evidenziato il potenziale di ciascun gruppo di trattamento nell'alleviare il danno renale in misura diversa, esibendo vari cali di p-EGFR, p-MAPK3/1 e BAX e incrementi dell'espressione di BCL-2 nei tessuti renali dei ratti trattati. In conclusione, queste intuizioni suggeriscono che l'efficacia protettiva della JWSJS sulla nefropatia diabetica potrebbe essere associata alla soppressione dell'attivazione della via di segnalazione EGFR/MAPK3/1 e all'alleviamento dell'apoptosi delle cellule renali.

Introduzione

Il diabete mellito (DM) è una malattia cronica che colpisce più sistemi e può causare varie complicanze dovute all'iperglicemia continua, come la nefropatia diabetica (DN), la retinopatia e la neuropatia1. La DN è una grave complicanza della DM, che rappresenta circa il 30%-50% della malattia renale allo stadio terminale (ESRD)2. La sua manifestazione clinica è la microalbuminuria, che può progredire in ESRD caratterizzata da aumento del volume glomerulare, iperplasia stromale mesangiale e ispessimento della membrana basale glomerulare3. La patogenesi della DN è complessa e non è stata completamente chiarita. Metodi clinici come l'abbassamento della glicemia, la regolazione della pressione sanguigna e la riduzione della proteinuria sono utilizzati principalmente per ritardarne il progresso, ma l'effetto è generale.

Attualmente, non è stato trovato alcun farmaco specifico per il trattamento della DN4. Per secoli, tuttavia, le erboristerie cinesi sono state ampiamente utilizzate nel trattamento della DM e delle sue complicanze5 e hanno migliorato i sintomi clinici dei pazienti e ritardato la progressione della malattia. A causa dei vantaggi degli effetti multicomponente, multi-target e multi-percorso, si prevede che le erboristerie cinesi siano una fonte di farmaci innovativa per il trattamento del DN6.

"Shengjiang san" ha avuto origine dal "Wanbing Huichun" del medico della dinastia Ming Gong Tingxian. Il libro "Neifu Xianfang" descrive l'uso di Bombyx Batryticatus, Cicadae Periostracum, Curcumaelongae Rhizoma e Radix Rhei et Rhizome. Sulla base di ciò, dopo aver aggiunto Hedysarum Multijugum Maxim, Epimrdii Herba e Smilacis Glabrae Rhixoma, esercita la funzione dello shengjiang san di aumentare la lucidità, diminuire la torbidità, rilasciare "calore" stagnante e armonizzare il "qi" e il sangue 7,8. Aumenta anche l'effetto di rafforzamento della milza e di tonificazione dei reni. La sua efficacia è coerente con la patogenesi del "qi" di DN per salire e scendere fuori ordine a causa della carenza di "energia vitale", dell'eccessiva secchezza e "calore" e del ristagno di "calore" causato da un triplo energizzante 7,8.

Precedenti studi clinici hanno dimostrato che le erboristerie cinesi sono state utilizzate per trattare il DM e le sue complicanze, e jiawei shengjiang san (JWSJS) ha dimostrato di regolare la glicemia e i lipidi, ridurre la proteinuria e migliorare significativamente l'efficacia clinica dei pazienti con DN7 precoce. La capacità di JWSJS di ridurre i livelli di proteine urinarie e glucosio nel sangue nei ratti DN è stata confermata da studi precedenti. Ciò probabilmente accade inibendo le vie di segnalazione TXNIP/NLRP3 e RIP1/RIP3/MLKL, riducendo la piroptosi dei podociti e prevenendo l'apoptosi necrotica nei tessuti renali dei ratti DN, ottenendo così la protezione renale9. JWSJS può aumentare l'espressione delle proteine nefrina e podocina e ridurre il danno da podociti nei ratti DN, suggerendo così che JWSJS ha un effetto inibitorio sul danno da podociti. JWSJS ha un certo effetto anti-DN con buoni profili di sicurezza, ma ci sono poche ricerche su di esso e questo lavoro si concentra principalmente sulla piroptosi e sull'apoptosi necrotica. La letteratura non è sufficientemente approfondita o sistematica10. I nostri risultati precedenti hanno confermato che JWSJS può ridurre la proteinuria e alleviare il danno renale nei ratti DN7. Tuttavia, ci sono solo pochi studi sul meccanismo della JWSJS per il trattamento della DN, e questi mancano di profondità e sistematizzazione. Pertanto, questo studio mira ad analizzare le sostanze molecolari e i meccanismi d'azione di JWSJS per il trattamento della DN utilizzando la farmacologia di rete e fornire una solida base per la ricerca futura.

La farmacologia delle reti è un metodo emergente per studiare il meccanismo d'azione dei farmaci, tra cui la chemioinformativa, la biologia delle reti, la bioinformatica e la farmacologia11,12. Il disegno della ricerca farmacologica di rete è abbastanza simile al concetto olistico della medicina tradizionale cinese13,14 ed è un metodo importante per studiare il meccanismo delle medicine erboristiche cinesi. Il docking molecolare può studiare le interazioni tra le molecole e prevedere i loro modelli di legame e affinità. Il docking molecolare è emerso come una tecnica fondamentale nel campo della ricerca farmacologica assistita da computer15. Pertanto, questo studio ha costruito una rete di interazione JWSJS-DN-target attraverso la farmacologia di rete e i metodi di docking molecolare che offre una base teorica affidabile per ulteriori esplorazioni del trattamento DN con JWSJS.

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Protocollo

Tutti gli animali sono stati mantenuti e utilizzati in conformità con la Guida del Consiglio Nazionale delle Ricerche degli Stati Uniti per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, 8a edizione, e sono stati segnalati come raccomandato nelle linee guida ARRIVE 16,17. Lo studio è stato condotto in conformità con la Guida del Consiglio Nazionale delle Ricerche cinese per la cura e l'uso degli animali da laboratorio ed è stato approvato dal Comitato Etico Animale dell'Università di Medicina Cinese di Hebei (DWLL2019030).

1. Principi attivi JWSJS e raccolta target

  1. Inserisci la composizione medicinale JWSJS (Hedysarum Multijugum Maxim, Epimrdii Herba, Smilacis Glabrae Rhixoma, Radix Rhei et Rhizome e Curcumaelongae Rhizoma) nel database di farmacologia dei sistemi di medicina tradizionale cinese e nel database della piattaforma di analisi (TCMSP)18 per recuperare tutti i componenti chimici.  Secondo lo screening di assorbimento, distribuzione, metabolismo ed escrezione (ADME) la biodisponibilità orale (OB) ≥ il 30% e le proprietà simili ai farmaci (DL) ≥ 0,18 ingredienti chimici19,20.
  2. Utilizzare il database TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/ tcmsp.php, versione 2.3) per recuperare i target corrispondenti degli ingredienti chimici.
  3. Ottieni i principi attivi di Bombyx Batryticatus e Cicadae Periostracum effettuando una ricerca nei database di Medicina Tradizionale Cinese e Composizione Chimica21.
  4. Per la credibilità sperimentale, selezionare composti con numeri CAS (Chemical Abstracts Service) per questo studio. Quindi scarica i diagrammi di struttura 2D (formato .sdf) dei principi attivi da PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/, aggiornati nel 2021)22.
  5. Utilizzare SwissADME (www.swissadme.ch, aggiornato nel 2021)23per lo screening dei componenti con elevato assorbimento gastrointestinale (IG) come similarità farmacologica (Lipinski, Ghose, Veber, Egan, Muegge) i cui ≥ 2 item erano "Sì". Ciò ha portato ai componenti attivi di Bombyx Batryticatus e Cicadae Periostracum.
  6. Importali nel database TCMSP per la previsione della proteina bersaglio (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php, versione 2.3)18.
  7. Standardizzare gli obiettivi nel database UniProt (https://www.uniprot.org, aggiornato nel 2021) con lo stato impostato come Revisionato e le specie impostate come Umano24.

2. Raccolta target corrispondente DN

  1. Cerca Nefropatia diabetica tramite GeneCards (https://www.genecards.org/, versione 5.1)25, OMIM (https://omim.org/, aggiornato nel 2021)26, TTD (http://db.idrblab.net/ttd/, aggiornato nel 2021)27, PharmGKB (https://www.pharmgkb.org/, aggiornato nel 2021)28 e database DrugBank (https://www.drugbank.ca/, aggiornato nel 2021)29. Ottieni i target di DN dopo la combinazione e la deduplicazione.
  2. Screening degli obiettivi comuni di JWSJS e DN e costruzione di reti
    1. Esamina i bersagli comuni di JWSJS e DN utilizzando il software R 4.2.0 e disegna diagrammi di Venn. Importa i principi attivi e i potenziali bersagli di JWSJS nel software Cytoscape 3.8.030 per creare un diagramma di rete farmaco-ingrediente-bersaglio che visualizza la connessione tra farmaci, ingredienti, bersagli e malattie.
    2. Lascia che la dimensione del nodo rifletta la dimensione del valore del grado, dove un valore di grado più alto indica che il nodo è più importante nella rete.
  3. Costruzione della rete di interazione proteina-proteina PPI e screening dei bersagli core
    1. Analizzare i geni che si intersecano utilizzando la piattaforma online STRING (Versione: 11.5) per costruire una rete di interazione proteina-proteina (PPI)31. Costruisci la rete utilizzando una modalità di analisi di proteine multiple , imposta la specie su Homo sapiens e imposta il punteggio minimo di interazione richiesto su >0,930.
    2. Utilizza Cytoscape 3.8.0 per analizzare topologicamente la rete, calcolare la centralità tra (BC), la centralità di prossimità (CC), la centralità del grado (DC), la centralità degli autovettori (EC), il metodo basato sulla connettività media locale (LAC) e i valori di centralità della rete (NC) per ciascun nodo e escludere i sei nodi con tutti i valori maggiori della mediana32. Ripetere questo processo più volte per identificare i bersagli principali della JWSJS per la terapia DN.
  4. Analisi funzionali GO e analisi dell'arricchimento della via KEGG
    1. Esegui analisi di arricchimento di OB e KEGG per identificare i processi biologici, le funzioni molecolari, i componenti cellulari e i percorsi associati ai bersagli comuni di JWSJS e DN.
    2. Usa l'org. Hs.eg.db pacchetto per ottenere gli ID delle destinazioni di intersezione e utilizzare clusterProfiler, org. Pacchetti Hs.eg.db, enrichplot e ggplot2 per analisi di arricchimento33.
    3. Screening per l'analisi dell'arricchimento funzionale di OB sui primi 10 risultati biologici con un valore P corretto < 0,05 e selezionare i primi 30 percorsi con il più alto arricchimento per l'analisi KEGG.

3. Attracco molecolare

  1. Utilizzare il software AutoDock Vina per eseguire l'aggancio molecolare tra i componenti principali di JWSJS e i bersagli principali per la terapia DN34.
  2. Cerca nel database di PubChem per ottenere il file sdf della struttura 2D dei componenti principali di JWSJS. Utilizza il software ChemBio 3D Ultra14.0 per generare e ottimizzare la sua struttura 3D, salvarla in formato mol2 e utilizzarla come file ligando.
  3. Trova e scarica il formato pdb della struttura 3D dei bersagli principali dal database della Banca Dati Proteiche (PDB) del Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB). Utilizzare il software Pymol 2.4.0 per rimuovere le molecole d'acqua e i ligandi dalla struttura proteica, salvarlo in formato pdb e utilizzarlo come file recettore.
  4. Importa il file pdb del recettore nel software AutoDockTools 1.5.7 per l'idrogenazione, converti sia la proteina del recettore che il ligando di piccole molecole in formato pdbqt, imposta la tasca attiva per la proteina del recettore con il coefficiente di spaziatura impostato su 1.
  5. Utilizzare Autodock vina 1.2.0 per il docking molecolare e calcolare l'energia di legame; se Affinità < 0, si consideri che la molecola si lega spontaneamente con le proteine, un valore assoluto maggiore di Affinità indica un legame più stabile tra di loro. Infine, visualizza i risultati dell'attracco utilizzando i software Pymol 2.3.0 e LigPlot 2.2.5.

4. Simulazione dinamica molecolare

  1. Per eseguire simulazioni MD utilizzando il software Desmond, attenersi alla seguente procedura:
    1. Utilizzare la versione accademica 2019-1 del software Desmond per valutare la stabilità e la flessibilità delle interazioni proteina-ligando.
    2. Condurre indagini di dinamica molecolare (MD) su un trio dei complessi di ligandi più promettenti derivati da studi di docking. Condurre simulazioni in un ambiente acquoso SPC con NaCl 0,15 M, replicando le condizioni ioniche fisiologiche. La scatola di simulazione è progettata in modo da garantire che il soluto rimanga ad almeno 10 Å di distanza dai suoi confini. I controioni vengono introdotti per neutralizzare la carica elettrica del sistema. Inoltre, vengono applicate condizioni al contorno periodiche, governate dai parametri del campo di forza OPLS 2005.
    3. Avvia una fase di minimizzazione dell'energia per 100 ps utilizzando i parametri predefiniti di Desmond.
    4. Garantire la stabilizzazione della temperatura e della pressione a 26,85 °C (300 K) e 1,01325 bar attraverso la catena Nosé-Hoover e le metodologie Martyna-Tobias-Klein in tutti i sistemi MD di produzione. La simulazione di dinamica molecolare viene eseguita con un timestep di 2 fs per una durata totale di 100 ns, registrando le coordinate atomiche ogni 100 ps.
    5. Aprire il modulo SID (Simulation Interactions Diagram). Caricare i file di dati dei risultati della simulazione nel modulo.
    6. Selezionare il tipo di analisi desiderato tra le opzioni disponibili nel modulo (ad esempio, deviazione quadratica media [RMSD], fluttuazione quadratica media [RMSF], analisi del legame idrogeno, ecc.). Specificate eventuali parametri aggiuntivi necessari per il tipo di analisi scelto.
    7. Esegui l'analisi facendo clic sul pulsante Analizza o Avvia.
    8. Una volta completata l'analisi, visualizzare e interpretare i risultati all'interno dell'interfaccia del modulo SID. Esporta i risultati, se necessario, per un ulteriore utilizzo o presentazione.

5. Convalida degli esperimenti sugli animali

  1. Animali e disegno sperimentale
    NOTA: Questo studio ha coinvolto 75 ratti maschi di Sprague-Dawley, ottenuti da un impianto di produzione animale di grado SPF e di 8 settimane con una massa corporea di 150 g ± 20 g (certificato di produzione animale numero SCXK [Hebei] 2018-004).
    1. Ospita i ratti in un laboratorio per animali di livello SPF e dividili casualmente in gruppi normali e modello dopo 1 settimana di alimentazione adattiva. Fornire al gruppo normale una dieta normale e al gruppo modello una dieta ricca di zuccheri e grassi. Dopo 4 settimane, digiunare i ratti ma non privarli dell'acqua per 12 ore.
    2. Iniettare nel gruppo modello un'iniezione intraperitoneale di streptozotocina (STZ; 35 mg·kg-1). Dopo 72 ore, testare i livelli di zucchero nel sangue attraverso il prelievo di sangue della vena caudale. Se il livello di glucosio nel sangue a digiuno è ≥16,7 mmol· L-1, confermarlo come un modello diabetico di successo.
    3. Confermare il successo del modello DN osservando i cambiamenti istopatologici nel rene di ratto.
    4. Dividere casualmente i modelli replicati con successo nel gruppo modello, che ha ricevuto JWSJS a 4,37 g/kg, 8,73 g/kg e 17,46 g/kg (equivalenti a 3,2, 6,3 e 12,6 volte la dose clinica equivalente) e in un gruppo irbesartan (0,014 g/kg). Ogni gruppo era composto da 10 ratti. Somministrare tutti i farmaci tramite sonda gastrica orale una volta al giorno. Mantenere questo regime di dosaggio in modo costante per 4 settimane.
    5. Anestetizzare i ratti utilizzando un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico all'1% (50 mg/kg) e confermare la corretta anestesia perdendo il riflesso di ritiro del pedale. Raccogliere campioni di sangue dall'aorta addominale prima dell'eutanasia.
    6. Raccogliere i reni dopo l'eutanasia dei ratti utilizzando un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico alla dose di 150 mg/kg.
      NOTA: Gli animali sono stati soppressi umanamente, seguendo le linee guida (https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals) più aggiornate dell'American Veterinary Medical Association (AVMA) per l'eutanasia.
  2. Analisi istologiche renali
    NOTA: I tessuti renali sono stati fissati in paraformaldeide al 4% e disidratati in etanolo dopo 48 ore; Le sezioni erano incorporate nella paraffina. Le sezioni sono state tagliate in fette sottili (4 μm) per l'ematossilina e l'eosina (HE) e la colorazione periodica acido-Schiff (PAS) e i cambiamenti morfologici dell'istologia renale sono stati osservati al microscopio ottico.
    1. Colorazione HE:
      1. Deceratura e idratazione: trattare le sezioni di tessuto con xilene I e II (10 minuti ciascuno), alcol assoluto I e II (3 minuti ciascuno). Quindi, immergere le sezioni di tessuto in etanolo al 95%, 90%, 80% e 70% (2 minuti ciascuna), quindi lavare con acqua distillata per 5 minuti.
      2. Mettere le sezioni di tessuto nella colorazione con ematossilina per 5 minuti e poi differenziare le sezioni con alcol cloridrico per 5 s.
      3. Mettere la sezione nella soluzione colorante eosina per 3 minuti.
      4. Disidratazione, schiaritura e montaggio: disidratare le sezioni in tempi diversi in diversi etanoli (70%, 80%, 90%, 95% ed etanolo assoluto), quindi eliminarle in xilene I e II, quindi montarle con gomma neutra.
    2. Colorazione PAS:
      1. Seguire i passaggi di deceratura descritti al punto 5.2.1 e trattare la sezione con la soluzione di colorazione acida periodica per ~8 minuti.
      2. Sciacquare le sezioni in acqua distillata per 2 minuti e poi macchiarle con il reagente Schiff per 15 minuti al buio.
      3. Lavare le sezioni in acqua di rubinetto per 10 minuti dopo averle trattate con il reagente Schiff.
      4. Controcolorare le sezioni con ematossilina per 1 minuto e poi differenziarle con HCl-alcol per 30 s. Lavare nuovamente le sezioni in acqua di rubinetto per 5 minuti per colorare il nucleo di blu.
    3. Microscopia:
      1. Fissare i campioni in glutaraldeide al 2,5% per 3 ore, quindi sciacquarli in PBS per 3 ore. Inoltre, trattare i campioni con acido osmico all'1% per 3 ore e poi risciacquare nuovamente in PBS per 3 ore.
      2. Disidratare attraverso una serie graduale di bagni alcolici che terminano in acetone (ogni passaggio dura circa 2 ore totali).
      3. Infiltrare i campioni con una miscela di propano epossidico e resina epossidica (1:1) a temperatura ambiente (RT) per 2 ore, seguita da resina epossidica pura a 37 °C per altre 2 ore.
      4. Successivamente, polimerizzare e indurire i campioni a temperature sempre più elevate per un periodo di 36 ore prima del sezionamento. Questo processo garantisce che il tessuto sia completamente infiltrato con la resina, che viene quindi indurita per consentire un taglio sottile per la microscopia elettronica.
      5. Doppia colorazione con acetato di uranile al 3% e piombo acido, osservazione e fotografia dei campioni al microscopio elettronico entro 15 minuti.
        NOTA: Le impostazioni della microscopia elettronica a trasmissione (TEM) sono le seguenti: un ingrandimento di 7000x in modalità ad alto contrasto (Zoom-1 HC-1), con una tensione di accelerazione di 80,0 kV su un sistema TEM.
  3. Immunoistochimica
    1. Deceratura: Posizionare le sezioni di tessuto nello xilene I e II per 10 minuti ciascuna.
    2. Reidratazione: reidratare le sezioni di tessuto decerate mettendole successivamente in etanolo assoluto I e II per 3 minuti ciascuna, seguite da etanolo al 95%, 90%, 80% e 70% per 2 minuti ciascuna.
    3. Recupero dell'antigene: immergere le sezioni di tessuto in una soluzione tampone di citrato 0,1 M e acido citrico ad alta pressione per circa 5 minuti e poi raffreddare a RT.
    4. Bloccaggio: per prevenire il legame aspecifico degli anticorpi, bloccare incubando le sezioni di tessuto con il 5% di siero normale di capra a circa 37 °C per 30 minuti.
    5. Incubazione degli anticorpi primari: aggiungere gli anticorpi primari p-EGFR (diluito 1:200) e p-MAPK3/1 (diluito 1:200) su sezioni di tessuto e incubare per una notte a 4 °C all'interno di una camera umidificata.
    6. Incubazione degli anticorpi secondari: lavare le sezioni tre volte con PBS, quindi aggiungere anticorpi secondari marcati con biotina (diluiti in PBS secondo le istruzioni del produttore) sulle sezioni e incubare a 37 °C per 30 minuti.
    7. Applicare la soluzione di lavoro di streptavidina coniugata con perossidasi di rafano sulle sezioni di tessuto a 37 °C, quindi risciacquare tre volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
    8. Per lo sviluppo DAB, incubare le sezioni con la soluzione di sviluppo DAB (3 minuti al buio a RT), quindi risciacquare con acqua distillata. Il DAB agisce come substrato cromogeno per l'enzima perossidasi di rafano (HRP), che diventa marrone dopo l'ossidazione.
    9. Utilizzare l'ematossilina per controcolorare per circa 2 minuti, differenziare le sezioni con alcool cloridrico all'1% per 5 s, quindi lavare sotto l'acqua corrente per diventare blu.
    10. Disidratare ponendo successivamente le sezioni in una serie di etanolo da bassa ad alta concentrazione, limpido in xilene I e II, e montare le sezioni con gomma neutra.
      NOTA: Questa procedura richiede circa 18-24 ore, compresa l'incubazione notturna degli anticorpi primari.
    11. Seleziona casualmente tre campi visivi (200x) per ogni sezione e analizza i risultati della colorazione delle sezioni utilizzando il software di analisi delle immagini. Il software Image Pro Plus 6.0 è stato utilizzato seguendo i passaggi seguenti.
    12. Innanzitutto, importa un'immagine della sezione nel software.
    13. Correzione della densità: per garantire risultati accurati, eseguire una correzione della densità.
      1. Passare a Misura > Calibrazione > intensità > Nuovo > Std. Opzioni di > densità opzionali > immagine. Quindi, fare clic su un'area vuota dell'immagine per registrare il valore di sfondo e confermarlo facendo clic su OK.
    14. Impostazione dei parametri di misurazione: Impostazione dei parametri di misurazione per calcolare l'area e la densità ottica integrata (IOD).
      1. Fare clic su Misura > Conteggio/Taglia > Misura > selezionare Misure. Selezionare Area(100) e IOD, quindi fare clic su OK.
      2. Vai su Opzioni, seleziona Sfondo scuro sul campione, Prefiltro 4-Connect e fai clic su OK.
    15. Selezione del colore: per determinare con precisione la positività, selezionare i colori per rilevare le aree macchiate rispetto alle aree non colorate.
      1. Fare clic su Seleziona colori > istogramma basato > HSI. Regolare il valore H in base all'immagine mantenendo S invariato e I compreso tra zero e il valore di sfondo. Quindi, conferma facendo clic su Chiudi.
      2. Raccolta e calcolo dei dati: eseguire la raccolta e il calcolo dei dati facendo clic su Misura > Raccoglitore dati > Layout, dove sono selezionati Nome, Area (Somma) e IOD (Somma ). Quindi, fai clic su Conta > Raccogli ora > elenco dati per esportare i dati per ulteriori analisi o archiviazione.
        NOTA: Ciò ha portato a una misurazione semiquantitativa dell'espressione proteica in ciascuna sezione in termini di IOD/area, che indica la quantità di proteina presente rispetto all'area totale analizzata.
  4. Western blotting
    1. Ricavate il tessuto renale e tagliatelo a pezzetti. Mettere questi pezzi in una provetta da centrifuga da 1,5 mL, aggiungere la soluzione di lisi proteica pre-raffreddata (50 mM di Tris [pH 7,4], 150 mM di NaCl, 1% di Triton X-100, 1% di desossicolato di sodio, 0,1% di dodecil solfato di sodio [SDS]) e omogeneizzare.
    2. Lasciare in ghiaccio per 30 min, quindi centrifugare a 13400 x g per 20 min a 4 °C. Conservare il campione risultante in un congelatore a -80 °C.
    3. Usa il metodo Bradford per quantificare le proteine.
      1. Preparare la soluzione di lavoro Coomassie Brilliant Blue mescolando il reagente e l'acqua distillata in un rapporto di 1:4.
      2. Stabilire tre gruppi: bianco, gruppo proteico standard e gruppo proteico campione. Aggiungere 3 mL di soluzione di lavoro Coomassie Brilliant Blue a ciascun gruppo, insieme alla soluzione fisiologica per il gruppo bianco, alla proteina standard per il gruppo standard e alla proteina surnatante estratta per il gruppo campione.
      3. Dopo aver lasciato riposare le miscele per 5 minuti, misurarne i valori di assorbanza utilizzando uno spettrofotometro a raggi ultravioletti.
      4. Calcolare la concentrazione del campione utilizzando questa formula: Concentrazione proteica (mg/mL) = (Valore di assorbanza del campione/Valore di assorbanza della provetta standard) x Concentrazione proteica standard x 5.
    4. Aggiungere un volume uguale di tampone di carico 6x a ciascun campione proteico. Far bollire a 100 °C per 5 minuti prima di aliquotarli e conservarli in congelatore a -20 °C fino a nuovo utilizzo.
    5. Eseguire l'elettroforesi standard, il blotting e il blocco.
      1. Eseguire l'elettroforesi standard su gel di poliacrilammide SDS (PAGE) utilizzando un gel risolutivo al 12%. Applicare una tensione costante di 100 V per il gel di impilamento e di 120 V per il gel risolutivo fino a quando la parte anteriore del colorante raggiunge il fondo del gel.
      2. Trasferire le proteine su membrane di polivinilidene difluoruro (PVDF) a 100 V per 2 ore in una cella frigorifera a 4 °C utilizzando un sistema di trasferimento a umido.
      3. Dopo il trasferimento delle proteine, bloccare le membrane con il 5% di latte scremato in TBST per 1 ora a RT.
    6. Diluire gli anticorpi primari EGFR (1:2.000), p-EGFR (1:2.000), MAPK3/1 (1:2.000), p-MAPK3/1 (1:2.000), Bcl-2 (1:2.000), BAX (1:2.000) e CAPDH (1:5.000) in TBST con il 5% di BSA. Aggiungere questi anticorpi primari diluiti e incubare le membrane per una notte a 4 °C con una leggera agitazione.
    7. Dopo aver lavato la membrana tre volte con TBST, aggiungere gli anticorpi secondari diluiti (1:5.000), quindi incubazione per 1 ora. Dopo lo sviluppo del colore, eseguire l'analisi quantitativa delle bande target utilizzando il software ImageJ.
  5. Analisi qPCR
    1. Raggruppamento: assegna campioni ai gruppi: Control, DN, Irbesartan, JWSJS-L, JWSJS-M, JWSJS-H.
    2. Estrazione dell'RNA: eseguire l'omogeneizzazione dei tessuti e l'estrazione dell'RNA, seguite dall'aggiunta di cloroformio, dalla centrifugazione e dalla precipitazione dell'RNA secondo le istruzioni del produttore.
    3. Precipitazione e lavaggio dell'RNA: precipitare l'RNA con isopropanolo e lavare con etanolo.
    4. Solubilizzazione dell'RNA: Essiccare il pellet di RNA e scioglierlo in acqua trattata con DEPC.
    5. Sintesi del cDNA: Eseguire la trascrizione inversa utilizzando miscele di reazione specifiche secondo le istruzioni del produttore.
    6. Amplificazione qPCR: utilizzare primer specifici per GAPDH, MAPK3, MAPK1 ed EGFR per qPCR ed eseguire l'amplificazione secondo le istruzioni del produttore.
      Le sequenze di primer erano le seguenti:
      GAPDH: F-5'-GCAAGTTCAACGGCACAG-3', R-5'-CTCGCTCCTGGAAGATGG-3';
      MAPK3: F-5'-AGATCTGTGATTTTGGCCT-3', R-5'-TCAATGGATTTGGTGTAGC-3';
      MAPK1: F-5'-CCTCAAGCCTTCCAACCTC-3', R-5'-GCCCACAGACCAAATATCA-3';
      EGFR: F-5'-GGGGATGTGATTATTTCTG-3, R-5'-ATTTTGGTCTTTTGATTGG-3'.

6. Metodi statistici

  1. Eseguire l'analisi utilizzando un software appropriato (ad es. SPSS) e rappresentare i dati misurati come media ± deviazione standard. Se i dati soddisfano i criteri di distribuzione normale e omogeneità della varianza, confrontare i gruppi utilizzando l'ANOVA unidirezionale ed effettuare confronti multipli con il metodo Bonferroni.
  2. Utilizzare il test T2 per confronti multipli se la varianza non è omogenea. Considera P < 0,05 come statisticamente significativo.

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Risultati

Seguendo il protocollo, 90 principi attivi di JWSJS sono stati infine ottenuti dall'analisi dopo lo screening e la deduplicazione secondo gli standard stabiliti di OB e DL. Questi includevano 20 tipi di Hedysarum Multijugum Maxim, 23 tipi di Epimrdii Herba, 15 tipi di Smilacis Glabrae Rhixoma, 16 tipi di Radix Rhei et Rhizome, quattro tipi di Curcumaelongae Rhizoma, 15 tipi di Cicadae Periostracum e sei tipi di componenti di Bomby...

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Discussione

Il nostro studio ha impiegato una combinazione di farmacologia di rete, docking molecolare e modelli animali in vivo . Un passo fondamentale è stata la creazione della rete "drug-component-target", che è stata cruciale per identificare i potenziali meccanismi di JWSJS nel trattamento della DN, concentrandosi in particolare sulla sua interazione con la via di segnalazione EGFR/MAPK3/1.

Durante questo studio, abbiamo apportato diverse modifiche, in pa...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo studio è stato sostenuto dal progetto generale della Fondazione di Scienze Naturali della Provincia di Hebei, Cina (n. H2019423037).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
2×SYBR Green qPCR Master Mix Servicebio, Wuhan, ChinaG3320-05
24-h urine protein quantification (UTP)Nanjing Jiancheng Institute of Biological EngineeringN/A
3,3'-DiaminobenzidineShanghai Huzheng Biotech, China91-95-2
Automatic biochemical analysis instrumentHitachi, Japan7170A
Anhydrous EthanolBiosharp, Tianjin, ChinaN/A
BAX Primary antibodies Affinity, USAAF0120Rat
BCL-2 Primary antibodies Affinity, USAAF6139Rat
BX53 microscopeOlympus, JapanBX53
Chloroform SubstituteECOTOP, Guangzhou, ChinaES-8522
Desmond software New York, NY, USARelease 2019-1
Digital Constant Temperature Water BathChangzhou Jintan Liangyou Instrument, ChinaDK-8D
EGFR Primary antibodies Affinity, USAAF6043Rat
Embed-812 RESINShell Chemical, USA14900
Fasting blood glucose (FBG)Nanjing Jiancheng Institute of Biological EngineeringN/A
FC-type full-wavelength enzyme label analyserMultiskan; Thermo, USAN/A
GAPDH  Primary antibodies Affinity, USAAF7021Rat
Glycated serum protein (GSP)Nanjing Jiancheng Institute of Biological EngineeringN/A
Transmission electron microscopeHitachi, JapanH-7650
Haematoxylin/eosin (HE) staining solutionServicebio, USAG1003
Image-Pro PlusMEDIA CYBERNETICS, USAN/A
Real-Time PCR Amplification InstrumentApplied Biosystems, USAiQ5 
Irbesartan tabletsHangzhou Sanofi PharmaceuticalsN/A
IsopropanolBiosharp, Tianjin, ChinaN/A
 JWSJS granulesGuangdong Yifang PharmaceuticalN/A
Kodak Image Station 2000 MM imaging systemKodak, USAIS2000
Low-density cholesterol (LDL-C)Nanjing Jiancheng Institute of Biological EngineeringN/A
MAPK3/1Primary antibodies Affinity, USAAF0155Rat
Medical CentrifugeHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development, China TGL-16K
Mini trans-blot transfer systemBio-Rad, USAN/A
Mini-PROTEAN electrophoresis systemBio-Rad, USAN/A
NanoVue Plus SpectrophotometerHealthcare Bio-Sciences AB, Sweden111765
p-EGFR Primary antibodies Affinity, USAAF3044Rat
Periodic acid-Schiff (PAS) staining solutionServicebio, USAG1008
p-MAPK3/1 Primary antibodies Affinity, USAAF1015Rat
Secondary antibodies Santa Cruz, USAsc-2357Rabbit
StreptozotocinSigma, USAS0130
SureScript First-Strand cDNA Synthesis KitGeneCopeia, USAQP056T
TriQuick ReagentSolarbio, Beijing, ChinaR1100
Ultra-Clean WorkbenchSuzhou Purification Equipment, ChinaSW-CJ-1F 

Riferimenti

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