Isolamento immunomagnetico delle cellule staminali CD34+ residenti nella parete vascolare dai topi

Riepilogo

Questo studio ha stabilito un metodo stabile ed efficiente per l'isolamento, la coltura e la determinazione funzionale delle cellule staminali CD34⁺ residenti nella parete vascolare (CD34⁺ VW-SC). Questo metodo di isolamento, facile da seguire ed efficace in termini di tempo, può essere utilizzato da altri ricercatori per studiare i potenziali meccanismi coinvolti nelle malattie cardiovascolari.

Abstract

Le cellule staminali e progenitrici residenti nella parete vascolare CD34⁺ (VW-SC) sono sempre più riconosciute per il loro ruolo cruciale nella regolazione del danno vascolare e della riparazione. Stabilire un metodo stabile ed efficiente per coltivare VW-SC CD34⁺ murini funzionali è essenziale per studiare ulteriormente i meccanismi coinvolti nella proliferazione, migrazione e differenziazione di queste cellule in varie condizioni fisiologiche e patologiche. Il metodo descritto combina lo screening a biglie magnetiche e la citometria a flusso per purificare i VW-SC CD34⁺ residenti primari in coltura. Le cellule purificate vengono quindi identificate funzionalmente attraverso la colorazione in immunofluorescenza e l'imaging con Ca²⁺ . In breve, le cellule vascolari dall'avventizia dell'aorta murina e dell'arteria mesenterica vengono ottenute attraverso l'attacco di blocchi di tessuto, seguito da subcoltura fino a raggiungere una conta cellulare di almeno 1 × 10⁷. Successivamente, i VW-SC CD34⁺ vengono purificati mediante smistamento a biglie magnetiche e citometria a flusso. L'identificazione delle VW-SC CD34⁺ comporta la colorazione con immunofluorescenza cellulare, mentre la multipotenza funzionale viene determinata esponendo le cellule a un terreno di coltura specifico per la differenziazione orientata. Inoltre, il rilascio funzionale interno di Ca²⁺ e l'ingresso esterno di Ca²⁺ vengono valutati utilizzando una workstation di imaging disponibile in commercio in cellule caricate con Fura-2/AM esposte ad ATP, caffeina o tapsigargina (TG). Questo metodo offre una tecnica stabile ed efficiente per isolare, coltivare e identificare le cellule staminali CD34⁺ residenti nella parete vascolare, fornendo l'opportunità di studi in vitro sui meccanismi regolatori delle VW-SC e lo screening di farmaci mirati.

Introduzione

La parete vascolare svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo vascolare, nella regolazione omeostatica e nella progressione delle malattie vascolari. Negli ultimi anni, numerosi studi hanno svelato la presenza di vari lignaggi di cellule staminali nelle arterie. Nel 2004, il gruppo del professor Qingbo Xu ha riportato per la prima volta l'esistenza di cellule staminali/progenitrici vascolari nella periferia della parete vascolare adulta, che esprimono CD34, Sca-1, c-kit e Flk-1¹. Queste cellule staminali vascolari mostrano un potenziale di differenziazione e proliferazione multidirezionale. In condizioni normali, rimangono relativamente quiescenti; Tuttavia, se attivati da fattori specifici, possono differenziarsi in cellule muscolari lisce, cellule endoteliali e fibroblasti. In alternativa, possono regolare la matrice perivascolare e la formazione di microvasi attraverso effetti paracrini per promuovere la riparazione o il rimodellamento dei vasi danneggiati 2,3,4,5,6. Recentemente, è stato scoperto che le cellule staminali CD34⁺ residenti nella parete vascolare svolgono un ruolo nella rigenerazione delle cellule endoteliali dopo una lesione del filo guida dell'arteria femorale². Di conseguenza, l'isolamento e la quantificazione delle VW-SC CD34⁺ e l'esame delle caratteristiche biologiche di base delle cellule staminali CD34⁺ sono cruciali per studiare ulteriormente le vie di segnale coinvolte nella regolazione delle VW-SC CD34⁺.

Attualmente sono disponibili vari metodi per la separazione cellulare, comprese le tecniche basate sulle caratteristiche della coltura cellulare o sulle proprietà fisiche delle cellule, come la centrifugazione in gradiente di densità, che si traduce in cellule selezionate contenenti molte cellule non bersaglio e una purezza relativamente bassa 7,8,9,10,11,12 . Un'altra tecnica comunemente usata è la selezione cellulare a fluorescenza/magnetica. La selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) è un sistema complesso con elevati requisiti tecnici ed è relativamente costoso, richiede molto tempo e potenzialmente influisce sull'attività delle cellule selezionate^13,14. Tuttavia, lo smistamento cellulare attivato da magneti (MACS) è più efficiente e conveniente, con un alto tasso di recupero e attività cellulare e un minore impatto sulle applicazioni a valle⁸. Pertanto, in questo protocollo, abbiamo applicato MACS per purificare i VW-SC CD34⁺ e abbiamo ulteriormente identificato le cellule mediante citometria a flusso. La creazione di metodi di isolamento basati su MACS per lo studio delle cellule staminali della parete vascolare sarebbe inestimabile. In primo luogo, consente studi sperimentali di genetica e biologia cellulare. In secondo luogo, l'isolamento e la coltura efficienti delle cellule staminali residenti nella parete vascolare consentono la valutazione sistematica e lo screening dei fattori di segnalazione che regolano le funzioni delle cellule staminali. In terzo luogo, l'identificazione di fenotipi cruciali nelle cellule staminali fornisce un importante "controllo di qualità" nella valutazione dello stato cellulare. Pertanto, l'identificazione di metodi di purificazione potrebbe essere utile per applicazioni simili a cellule staminali analoghe derivate da vasi.

Questo rapporto fornisce una dimostrazione dettagliata di un metodo stabile e affidabile per la coltura di VW-SC CD34⁺ , compresa l'identificazione cellulare e la valutazione funzionale eseguita mediante citometria a flusso, colorazione in immunofluorescenza e misurazione della segnalazione del Ca²⁺ . Questo studio fornisce una base per ulteriori ricerche approfondite sulla funzione dei VW-SC CD34⁺ e sui loro meccanismi di regolazione in condizioni fisiologiche e patologiche.

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Protocollo

Questo studio è stato approvato e gli animali sono stati gestiti in conformità con le linee guida per la gestione e l'uso di animali da laboratorio in Cina. La ricerca ha aderito rigorosamente ai requisiti etici degli esperimenti sugli animali, con l'approvazione del Comitato Etico Animale (Numero di approvazione: SWMU2020664). Per il presente studio sono stati utilizzati topi C57BL/6 sani di otto settimane di entrambi i sessi, di peso compreso tra 18 e 20 g. Gli animali sono stati ospitati presso il Laboratory Animal Center della Southwest Medical University (SWMU).

1. Coltura a blocchi tissutali di avventizia da aorta e arterie mesenteriche

1. Isolamento VW-SC CD34⁺ residente
   1. Anestetizzare due topi con inalazione di isoflurano al 3% (seguendo protocolli istituzionalmente approvati). Confermare un'adeguata anestesia con un pizzico di punta. Posizionare il topo supino con nastro adesivo e spruzzare disinfettante all'etanolo al 70% per disinfettare il pelo del topo. Apri le cavità toraciche e addominali usando forbici oftalmiche sterili e pinze per esporre il cuore e l'intestino. Dopo aver sezionato l'aorta isolata e le arterie mesenteriche, fissare l'aorta e il letto mesenterico in una capsula di Petri contenente elastomero di silicio e riempita con una soluzione salina fisiologica. Con un altro set di forbici e pinze sterilizzate, seziona rapidamente il grasso intorno all'aorta e alle arterie mesenteriche.
   2. Trasferire i tessuti sezionati in una piastra di Petri da 6 cm contenente una soluzione all'1% di penicillina-streptomicina-amfotericina B (vedere la tabella dei materiali). Dopo aver risciacquato due volte, trasferire le arterie in una cappa di coltura tissutale sotto uno stereomicroscopio.
   3. Tagliare le arterie longitudinalmente e utilizzare una pinza sottile per staccare lo strato esterno dell'aorta e il primo ramo delle arterie mesenteriche. Trasferire gli strati esterni in una piastra di Petri da 3,5 cm contenente 0,1-0,2 mL di terreno di coltura (vedere la Tabella dei materiali). Tagliare gli strati esterni in piccoli pezzi (circa 1 mm³).
   4. Trasferire i pezzi di tessuto in un pallone T25 rivestito di gelatina, garantendo una distribuzione uniforme sul fondo del pallone. Mantenere una distanza moderata tra i pezzi di tessuto per facilitare la scansione e la crescita delle cellule. Porre il matraccio verticalmente in un'incubatrice (37 °C, 5% CO₂) per 3 ore in modo che i blocchi di tessuto aderiscano al fondo del pallone.
   5. Dopo 3 ore, aggiungere 5 ml di terreno di coltura ad alto contenuto di glucosio DMEM per immergere i blocchi di tessuto. Orientare il pallone T25 orizzontalmente. Monitora la migrazione cellulare attorno ai blocchi di tessuto attraverso un microscopio a intervalli di 3 giorni.
      NOTA: Il terreno deve contenere il 20% di siero fetale bovino, lo 0,2% di fattore inibitorio della leucemia (LIF), 0,2 mM di β-mercaptoetanolo e l'1% di penicillina/streptomicina (vedere la Tabella dei materiali). Il siero fetale bovino supporta la proliferazione cellulare, mentre il LIF e il β-mercaptoetanolo ostacolano la differenziazione cellulare ^7,8.
   6. Quando le cellule nel pallone T25 raggiungono circa l'80% di confluenza, passarle e coltivarle in uno o due flaconi T75. Subcoltura delle cellule in cinque passaggi per garantire una crescita e una salute adeguate.
2. Separazione magnetica delle cellule staminali CD34⁺ residenti
   1. Quando le cellule in uno o due flaconi T75 raggiungono l'80% di confluenza, dissociare le cellule con la tripsina e risospenderle in 1 mL di tampone di smistamento (2 mM EDTA e 0,5% FBS). Determinare il numero di cellule (matraccio 10⁷/T75) e centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 minuti (a temperatura ambiente).
   2. Scartare completamente il surnatante e risospendere il pellet di cella in 98 μl di tampone di selezione per 10-7 celle totali. Aggiungere 2 μL di anticorpo CD34 (vedere la Tabella dei materiali). Mescolare bene e incubare per 30 minuti a 4°C al buio con agitare di tanto in tanto.
   3. Lavare le celle aggiungendo 2 mL di tampone di selezione e centrifugare a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.
   4. Rimuovere il surnatante con cura e completamente e risospendere le cellule in 80 μl di tampone di selezione.
   5. Aggiungere 20 μl di microsfere anti-FITC (per 10-7 celle totali, vedere la tabella dei materiali) nel tampone. Mescolare bene con pipettaggio ripetuto e incubare per 15 minuti a 4 °C al buio con agitazione intermittente.
   6. Lavare le celle due volte aggiungendo 2 mL di tampone e centrifugare a 300 x g per 5 minuti per ripellettare le cellule. Scartare completamente il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di tampone.
   7. Posizionare una colonna MS all'interno del campo magnetico di un separatore appropriato, assicurandosi che una provetta di raccolta (ad esempio, una provetta da centrifuga da 15 mL) sia posizionata sotto la colonna MS per raccogliere i componenti separati. (vedi Tabella dei materiali). Sciacquare la colonna con un tampone da 500 μl e attendere che sia completamente attraversata.
   8. Caricare la sospensione cellulare nella colonna e raccogliere il flusso contenente le cellule non marcate nella provetta da 15 mL.
   9. Rimuovere la colonna dal separatore e posizionarla su una nuova provetta da centrifuga da 15 mL. Introdurre 500 μl di tampone nella colonna, quindi sciacquare prontamente le celle marcate magneticamente spingendo lo stantuffo nella colonna.
   10. Per migliorare la purezza delle cellule CD34⁺ , la frazione eluita può essere arricchita utilizzando una seconda colonna MS. Ripetere il processo di separazione come menzionato sopra. Valutare la purezza delle cellule selezionate tramite citometria a flusso.
       NOTA: In genere, si ottengono il 10%-20% di cellule CD34⁺ , con circa il 70%-80% di cellule negative e circa il 10% di perdita dovuta a procedure di colorazione e centrifugazione.
   11. Per confermare ulteriormente la purezza delle cellule staminali CD34⁺ della parete vascolare, identificare le cellule selezionate mediante citometria a flusso. Il presente studio ha dimostrato una purezza superiore al 90%.

2. Identificazione cellulare mediante immunofluorescenza

1. Cellule di semina su vetrini coprioggetti (diametro 8 mm) pre-rivestite con gelatina allo 0,04%.
2. Quando le cellule raggiungono circa il 60%-70% di confluenza, sciacquare due volte con PBS e fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 10 minuti.
3. Lavare le celle con PBS per 3 minuti (3 volte) e permeabilizzare le celle con Triton X-100 allo 0,2% (in PBS) per 5 minuti a temperatura ambiente.
4. Lavare le cellule con PBS per 3 minuti (3 volte) e bloccare il legame non specifico degli anticorpi con il 5% di siero d'asina (in PBS) per 1 ora.
5. Rimuovere il tampone di bloccaggio tenendo ciascun vetrino coprioggetti sul bordo con una pinza e scaricandolo su un foglio di salvietta priva di lanugine.
6. Incubare le cellule in anticorpi primari diluiti 100 volte (CD34, Flk-1, c-kit, Sca-1, Ki67, vedi Tabella dei materiali) in BSA all'1% (in PBS) per una notte a 4 °C.
7. Decantare la soluzione e lavare le celle con PBS per 3 minuti (3 volte). Incubare le cellule con l'anticorpo secondario marcato con Alexa Fluor 488 (1:200 in 1% BSA) (vedere la Tabella dei materiali) per 1 ora a temperatura ambiente al buio.
8. Eseguire la controcolorazione DAPI diluendo la soluzione madre DAPI a 0,5 μg/mL in PBS e incubando le cellule per 5 minuti.
9. Risciacquare con PBS e sigillare i vetrini coprioggetti con un reagente antisbiadimento. Acquisizione di immagini con il microscopio confocale a scansione laser.

3. Differenziamento indotto e caratterizzazione di VW-SC CD34⁺

1. Seminare cellule staminali CD34⁺ a una densità appropriata (40%-50% di confluenza) rispettivamente su vetrini coprioggetti e piastre a 6 pozzetti.
2. Indurre la differenziazione orientata alle cellule endoteliali dalle cellule CD34⁺ coltivando le cellule nel terreno di coltura cellulare endoteliale EBM-2 (vedi Tabella dei materiali) per 1 settimana.
3. Indurre la differenziazione orientata alle cellule dei fibroblasti dalle cellule CD34⁺ coltivando le cellule nel terreno di coltura cellulare dei fibroblasti FM-2 (vedi Tabella dei materiali) per 3 giorni.
4. Sottoporre le cellule indifferenziate e differenziate a colorazione in immunofluorescenza (come indicato nel passaggio 2) con eccitazione laser di 488 nm e obiettivo 40x. Rilevare l'espressione dei marcatori delle cellule endoteliali (CD31, VWF) e dei marcatori delle cellule dei fibroblasti (PDGFRα, Vimentina) (vedere la Tabella dei Materiali).
5. Dissociare le cellule con la tripsina e ottenere il pellet cellulare per centrifugazione (300 x g, 5 min, temperatura ambiente). Risospendere le cellule con 100 μL di tampone di smistamento. Preincubare la sospensione cellulare con anticorpi monoclonali purificati anti-topo CD16/CD32 (1 μg) (vedere la Tabella dei materiali) a 4 °C per 5 minuti.
6. Aggiungere 2 μL di PE Rat Anti-Mouse CD34 (1:50), CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody APC (2 μL, 1:50) e CD140a (PDGFRa) Monoclonal Antibody FITC (2 μL, 1:50) direttamente alle cellule preincubate in presenza di Mouse Fc Block e incubare ulteriormente a 4 °C per 15 minuti.
7. Lavare le celle due volte aggiungendo 2 mL di tampone e centrifugare a 300 x g per 5 minuti (temperatura ambiente) per ripellettare le cellule. Scartare completamente il surnatante e risospendere le cellule in 300 μL di tampone. Inserire le provette di flusso con le cellule colorate in una ghiacciaia pronta per la citometria a flusso.

4. Rilevamento della segnalazione intracellulare del Ca²⁺ nelle cellule staminali vascolari CD34+

1. Cellule seme su vetrini coprioggetti 10 ore prima degli esperimenti a una densità fino al 70% di confluenza.
2. Estrarre i vetrini coprioggetti e attaccarli sul fondo di una camera personalizzata con eventuale vaselina.
3. Lavare i vetrini una volta con PBS, sostituirli con Fura-2/AM (5 μM) nella soluzione di Tyrode (NaCl 137 mM, KCl 5,4 mM, MgCl₂ 1,2 mM, glucosio 10 mM, HEPES 10 mM, CaCl₂ 2,4 mM) (vedere la Tabella dei materiali) e incubare le cellule per 30 minuti al buio.
4. Rimuovere il colorante trattando con la soluzione di Tyrode per 10 minuti per consentire la deesterificazione della fura-2/AM.
5. Montare la camera sul tavolino di un microscopio a fluorescenza invertita dotato di un sistema di imaging ad ampio campo contenente un monocromatore e una telecamera CCD (vedi Tabella dei materiali).
6. Apri la finestra principale, vai alla finestra di dialogo Grab Settings e alla pagina della fotocamera e premi il pulsante live per la visualizzazione dell'immagine live .
7. Scegli il tipo di immagine a fluorescenza, imposta i tempi di ripetizione del loop a 340 nm/380 nm, le dimensioni dell'immagine e il tempo di esposizione della fotocamera a 380 nm e 340 nm per ottenere una luminosità ottimale dell'immagine.
8. Scatta singole istantanee e disegna diverse linee a mano libera per cerchiare le celle con colori diversi e predefinire la regione di interesse (ROI), indicando lo sfondo come ROI 0.
9. Modificare nuovamente un protocollo già incorporato nella visualizzazione dell'area di lavoro e creare una nuova area di lavoro.
10. Esegui il protocollo e il "Fluorescence 340 nm div Fluorescence 380 nm (Live Kinetic)" visualizzerà il grafico cinetico online.
11. Nella vista numerica, sarà visibile un foglio di calcolo che presenta colonne di valori in scala di grigi e le informazioni temporali corrispondenti. Esporta i dati del foglio di calcolo utilizzando gli appunti.
12. Calcolare F340 nm/F380 nm che indica le variazioni intracellulari di Ca²⁺ dopo aver sottratto la fluorescenza di fondo (ROI 0).

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Risultati

Isolamento e purificazione di VW-SC CD34⁺
L'elevata purezza dei VW-SC CD34⁺ è ottenuta dall'avventizia dell'arteria aortica e mesenterica di topo mediante attacco tissutale e selezione di microsfere magnetiche. La percentuale di cellule CD34⁺ nella parete del vaso è generalmente del 10%-30%. La citometria a flusso conferma che la purezza delle cellule CD34⁺ ottenute mediante smistamento con biglie magnetiche è superiore al 90% (Figura...

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Discussione

Questo studio fornisce un metodo rapido e conveniente per ottenere VW-SC CD34⁺ funzionali dall'aorta e dalle arterie mesenteriche dei topi. I VW-SC CD34⁺ ottenuti con questo metodo hanno attività proliferativa e proprietà di differenziazione multidirezionale. I recettori del trifosfato inositolo 1,4,5-trisfosfato (IP₃Rs), i recettori della rianodina (RyRs) e i canali del calcio gestiti in negozio mediano il rilascio e l'ingresso di Ca²⁺ nelle VW-SC CD34⁺ . L'istitu...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% gelatin solution	Sigma	G1393
Anti-CD31 antibody	R&D	AF3628
Anti-CD34 antibody	Abcam	ab81289
Anti-c-kit antibody	CST	77522
Anti-FITC MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-701
Anti-FITC MicroBeads MACS	Miltenyi Biotec	130-048-701
Anti-Flk- 1 antibody	Abcam	ab24313
Anti-Ki67 antibody	CST	34330
Anti-PDGFRα antibody	Abcam	ab131591
Anti-Sca- 1 antibody	Invitrogen	710952
CD140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), FITC	eBioscience  Invitrogen	11-1401-82
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), APC	eBioscience  Invitrogen	17-0311-82
CD34 Antibody, anti-mouse, FITC, REAfinity Clone REA383	Miltenyi Biotec	130-117-775
cell culture hood	JIANGSU SUJING GROUP CO.,LTD	SW-CJ-2FD
Centrifuge	CENCE	L530
CO2 incubators	Thermofisher Scientific	4111
Confocal laser scanning microscope	Zeiss	zeiss 980
DMEM High Glucose Medium	ATCC	30-2002
EBM-2 culture medium	Lonza	CC-3162
FACSMelody	BD Biosciences
FACSMelody™ System	BD
Fetal bovine serum	Millipore	ES-009-C
FM-2 culture medium	ScienCell	2331
Fura-2/AM	Invitrogen	M1292
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	Thermofisher Scientific	A32731
Leukemia inhibitory factor	Millipore	LIF2010
Microscope	Olympus	IX71
MiniMACS   Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-090-312
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution	Beyotime	C0224
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141
Stereo Microscope	Olympus	SZX10
TILLvisION 4.0 program	T.I.L.L.Photonics GmbH	polychrome V
VWF Monoclonal Antibody (F8/86)	Thermofisher Scientific	MA5-14029
β-Mercaptoethanol	Thermofisher Scientific	21985023