Istituzione di un modello murino sperimentale di endometrioma per studiarne l'infertilità correlata

Riepilogo

Questo studio introduce un nuovo modello murino specificamente progettato per simulare l'endometrioma, un sottotipo clinicamente significativo di endometriosi. Utilizzando topi C57BL/6J, il modello mira a chiarire i meccanismi fisiopatologici alla base dell'infertilità correlata all'endometrioma, offrendo uno strumento raffinato per colmare l'attuale divario di conoscenze in medicina riproduttiva.

Abstract

L'endometrioma (OMA), un sottotipo di endometriosi caratterizzato dalla formazione di cisti endometriosiche nelle ovaie, colpisce il 17-44% degli individui con diagnosi di endometriosi. Le donne con OMA spesso sperimentano una fertilità compromessa, ma i meccanismi esatti alla base dell'infertilità associata all'OMA rimangono poco chiari. In particolare, i modelli animali esistenti simulano l'endometriosi peritoneale superficiale (SUP) e l'endometriosi infiltrante profonda (DIE), lasciando una notevole lacuna nella ricerca incentrata sull'OMA. In risposta alla lacuna di conoscenze, questo articolo introduce un modello murino pionieristico che simula l'OMA e fornisce una descrizione completa delle tecniche e delle procedure impiegate nel modello. Con un alto tasso di successo dell'83% e una specificità delle lesioni ovariche, questo modello è molto promettente per far progredire la nostra comprensione dell'OMA, in particolare nel contesto dell'infertilità. Offre una piattaforma preziosa per condurre ricerche mirate sulle sfide della fertilità associate all'OMA, aprendo potenzialmente la strada a migliori strategie diagnostiche e terapeutiche nel campo della medicina riproduttiva.

Introduzione

L'endometrioma (OMA) è il sottotipo più predominante di endometriosi, osservato in circa il 17-44% degli individui con diagnosi di endometriosi ^1,2. È caratterizzata dalla formazione di cisti endometriosiche all'interno delle ovaie. Queste cisti, colloquialmente chiamate "cisti di cioccolato", derivano il loro nome dalla loro caratteristica consistenza marrone, simile al catrame³. Oltre all'OMA, l'endometriosi può anche presentarsi come endometriosi peritoneale superficiale (SUP) ed endometriosi infiltrante profonda (DIE). Il SUP si riferisce alle lesioni sul rivestimento peritoneale, mentre DIE si riferisce alle lesioni che penetrano più di 5 mm sotto la superficie peritoneale⁴. L'eterogeneità nella posizione, nell'aspetto e nella profondità della lesione tra questi sottotipi di endometriosi si traduce in diversi sintomi clinici e gravità variabile della malattia ^5,6. L'OMA è particolarmente associata a stadi più gravi dell'endometriosi ed è stata implicata nell'infertilità, nelle aderenze pelviche e nell'aumento del rischio di cancro ovarico 1,7,8,9.

L'associazione dell'endometriosi, in particolare dell'OMA, con l'infertilità è un problema clinico di grave preoccupazione. L'endometriosi è presente nel 25-50% delle donne infertili, con il 30-50% delle donne con diagnosi di endometriosi che soffrono di infertilità 10,11,12,13,14. Sebbene gli esatti meccanismi di infertilità associati all'OMA rimangano sfuggenti, sono state sollevate alcune ipotesi. Uno suggerisce che l'endometriosi porti a uno stato infiammatorio cronico, che può interrompere la normale funzione ovarica e compromettere la qualità degli ovociti^15,16. Un altro propone un sovraccarico anomalo di ferro nel liquido follicolare ovarico, che si ritiene sia associato al disturbo della maturazione degli ovociti¹⁴. Altri studi affrontano le interruzioni nella regolazione ormonale¹⁷, nella qualità degli ovociti¹⁸ e nello sviluppo embrionale¹⁹.

Storicamente, i modelli di roditori hanno svolto un ruolo cruciale nell'approfondire la nostra comprensione dell'endometriosi, in particolare nello studio della sua patologia, dell'impatto sulla fertilità e dei meccanismi del dolore 20,21,22,23. I roditori, in particolare ratti e topi, sono stati ampiamente utilizzati come modelli animali nell'esplorazione delle relazioni causa-effetto, dei meccanismi sottostanti, delle potenziali tecniche diagnostiche e degli interventi terapeutici per questa malattia 22,24,25,26. È importante riconoscere che tutti i modelli animali hanno i loro usi e limiti specifici. La scelta di un particolare modello dipende dal risultato o dall'aspetto specifico che viene misurato o studiato²⁷. Ad esempio, un modello di ratto ha dimostrato che lo stress potrebbe esacerbare le manifestazioni dell'endometriosi e influenzare i parametri infiammatori, fornendo informazioni sui potenziali fattori scatenanti della malattia²⁸.

Nel contesto della ricerca sull'endometriosi, vengono impiegati vari modelli di roditori. Un approccio comunemente usato è il modello omologo, che prevede il trapianto di tessuto uterino di roditore nella cavità peritoneale o nei vasi mesenterici della stessa specie²⁹. Questo modello offre vantaggi in termini di immunocompetenza e idoneità per studi a lungo termine³⁰. Tuttavia, le limitazioni sorgono a causa della parziale disparità tra il tessuto uterino ectopico di topo impiantato e le caratteristiche delle lesioni endometriosiche umane³¹. Un altro approccio è il modello eterologo, in cui una biopsia endometriale umana viene impiantata in un topo immunodepresso³². Questo modello consente l'uso dell'endometrio ectopico umano come tessuto donatore per lo sviluppo della lesione, fornendo una validità costruttiva³². Tuttavia, si basa su topi immunodepressi come riceventi, il che ostacola una valutazione completa delle risposte immunitarie coinvolte nell'eziologia del disturbo³³. Tuttavia, è importante riconoscere che i modelli esistenti si concentrano principalmente sul rispecchiare la condizione generalizzata SUP, catturando in modo inadeguato le caratteristiche uniche di OMA e DIE³⁴. Attualmente, c'è una scarsità di modelli specifici disponibili per lo studio del DIE, con solo pochi modelli esistenti, incluso un recente modello di roditore sviluppato da Yan et ^al.35. Questa scarsità sottolinea la necessità di ulteriori ricerche e lo sviluppo di modelli che catturino accuratamente le caratteristiche specifiche del DIE. Inoltre, anche la nostra comprensione dell'OMA, in particolare della sua associazione sfumata con la fertilità, rimane limitata^26,36.

Affrontando le sfide esistenti, questo articolo presenta un nuovo modello sperimentale di topo omologo progettato per simulare specificamente l'OMA. Ha lo scopo di fornire informazioni uniche sui meccanismi patologici alla base dell'infertilità correlata all'OMA, colmando così il divario di conoscenze in quest'area cruciale della medicina riproduttiva. In breve, i topi C57BL/6J sono stati utilizzati per i loro tratti riproduttivi simili a quelli umani. Dopo la sincronizzazione del ciclo dell'estro, i tessuti uterini dei topi donatori sono stati tritati e trapiantati nella borsa ovarica dei topi riceventi con un rapporto 1:2. Dopo un intervallo di 4 settimane, sono stati condotti esami morfologici e istologici delle lesioni ovariche per convalidare la presenza di OMA e valutare l'eventuale atresia follicolare associata. Con un tasso di successo dell'83%, questo modello offre ai ricercatori una piattaforma affidabile per gli studi OMA, enfatizzando lo sviluppo di lesioni in particolare nelle ovaie per indagini mirate.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali condotte in questo studio sono state approvate e regolamentate con il numero di protocollo 21-203-MIS_[C] dal Comitato Etico dell'Università Cinese di Hong Kong.

1. Acclimatazione e selezione degli animali

1. Preparazione dei topi
   1. Ottieni 18 topi C57BL/6J (femmine primipare, 8-9 settimane: 6 donatrici, 12 ricette) da un fornitore affidabile. Verificare i certificati sanitari.
   2. Mantenere tutti i topi in un ambiente di stabulazione controllato: 22-24 °C, livelli di umidità tra il 40% e il 60% e con un ciclo luce/buio di 12 ore. Utilizzare aria filtrata HEPA, se disponibile.
   3. Consentire l'acclimatazione di 72 ore per i topi con accesso continuo a cibo e acqua, riducendo al minimo l'interazione umana per ridurre lo stress.
2. Sincronizzazione del ciclo estrale
   1. Raccogli lettiere contenenti feromoni maschili; Introducilo nelle gabbie femminili per 48 ore.
3. Citologia vaginale
   1. Eseguire la citologia vaginale la mattina seguente.
      NOTA: È necessario eseguire uno striscio a un'ora del giorno costante, in genere alle 9:00.
      1. Preparare in anticipo tamponi di cotone a doppia testa, PBS autoclavato, una piastra di Petri da 35 mm e vetrini. Erogare 10 ml di PBS in una capsula di Petri. Immergere un'estremità del batuffolo di cotone nel PBS per consentirgli di assorbire il liquido.
      2. Estrai delicatamente un topo dalla sua gabbia e posizionalo sul coperchio di una gabbia vuota.
      3. Afferra la coda usando il pollice e l'indice di una mano, e con l'altra mano prendi il batuffolo di cotone inumidito e inseriscilo delicatamente nella vagina del topo. Inserire con cautela la punta del bastoncino del tampone a una profondità di circa 1,0 cm nella vagina del topo. Ruotare delicatamente il tampone, mantenendo un angolo di circa 45° rispetto all'asse lungo del corpo dell'animale.
         NOTA: Ruotare lentamente il tampone durante l'inserimento può facilitare una procedura più fluida e ridurre al minimo la potenziale stimolazione della cervice.
      4. Rimuovere delicatamente le cellule dal lume vaginale e dalle pareti ruotando continuamente il tampone, quindi prelevare con cura il tampone.
         NOTA: Durante questo processo, assicurarsi che il tampone venga ruotato continuamente facendo attenzione a non entrare in contatto con i peli circostanti. Successivamente, prelevare con cura il tampone per evitare qualsiasi potenziale contaminazione.
      5. Trasferire le cellule raccolte facendo rotolare delicatamente la punta del tampone su un vetrino di vetro pulito e preetichettato.
         NOTA: Il bastoncino del tampone deve essere scartato dopo aver trasferito le celle sui vetrini e ne deve essere utilizzato uno nuovo per ogni animale.
      6. Ispezionare i vetrini al microscopio per rilevare le cellule epiteliali cornificate. Cerca la presenza uniforme di cellule epiteliali cornificate nella citologia vaginale, che è indicativa dello stadio dell'estro. Scatta fotografie e registra le osservazioni.
         NOTA: Con l'esperienza appropriata, la colorazione degli strisci vaginali non è necessaria. Tuttavia, se uno sperimentatore non è in grado di "leggere" gli strisci senza che siano macchiati, allora è necessario.

2. Istituzione di modelli di endometrioma

NOTA: Selezionare solo i topi nella fase di estro come topi donatori e riceventi nello stabilimento del modello. Quando si eseguono esperimenti su un topo, assicurarsi che sia fuori dalla vista degli altri e che non venga reintrodotto in compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ripreso. Il diagramma della generazione del modello si trova nella Figura 1.

1. Preparazione del tessuto del donatore
   1. Sedare i topi donatori con una combinazione di ketamina (75 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Eutanasia dei topi donatori mediante traslocazione cervicale in anestesia.
   2. Disinfettare la zona addominale con un tampone di etanolo al 70%.
   3. Utilizzare forbici chirurgiche sterili per creare un'incisione (1 cm) lungo la linea mediana del peritoneo per esporre lo strato muscolare. Scegli un altro paio di forbici chirurgiche per tagliare lo strato muscolare e rivelare la cavità pelvica.
   4. Chiudere le punte delle pinze e sollevare delicatamente l'intestino utilizzando la parte centrale smussata.
   5. Localizza l'utero e i tessuti ovarici. Condurre una dissezione sterile dell'intero corno uterino, comprese entrambe le corna uterine, assicurandosi che la dimensione approssimativa del pezzo da rimuovere sia di ~1,5 cm di lunghezza. Mettere i tessuti asportati in una capsula di Petri contenente PBS e rimuovere i tessuti adiposi in eccesso.
   6. Sezionare minuziosamente i tessuti in pezzi da 1 mm³ utilizzando un bisturi sterilizzato. Mantenere i tessuti umidi aggiungendo periodicamente PBS.
2. Procedura di trapianto
   1. Anestetizzare i topi riceventi con una miscela di ketamina (75 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg).
   2. Applicare un unguento oftalmico per prevenire la secchezza oculare durante l'intervento chirurgico. Posizionare i topi in posizione supina su una tavola chirurgica sterile.
   3. Determinare il sito chirurgico manipolando delicatamente le zampe posteriori del topo, con una prominenza ossea palpabile sotto la pelle. Questo punto di prominenza, chiaramente visibile attraverso la pelle, funge da marcatore anatomico affidabile per le ovaie del topo ricevente durante la procedura chirurgica.
   4. Radere il sito chirurgico, assicurandosi che il 150% dell'area circostante sia ripulita dal pelo. Quindi, disinfettare la pelle con cicli alternati di betadina e alcol al 70% almeno 3 volte. Utilizzare un telo chirurgico sterile per evitare il contatto tra tessuti, strumenti sterili e suture con la pelliccia residua. Infine, creare un'incisione laterale precisa (3-5 mm) nel sito chirurgico predeterminato.
   5. Stabilizzare l'ovaio con una pinza manuale non dominante. Iniettare delicatamente 100 μL di PBS nella borsa ovarica, osservando la leggera separazione.
   6. Crea una piccola fessura nella borsa. Trapiantare i frammenti di tessuto uterino (1 mm³) utilizzando una micro pinza.
      NOTA: Evitare il riempimento eccessivo per evitare la pressione sui tessuti circostanti.
   7. Per la chirurgia fittizia, replicare tutti i passaggi tranne il passaggio 2.2.6.
3. Assistenza postoperatoria
   1. Sutura gli strati muscolari con suture riassorbibili (es. 5-0 vicryl) e la pelle con suture non assorbibili (es. 5-0 nylon).
   2. Posizionare il mouse su un termoforo impostato a 37 °C fino al ritorno della piena coscienza. Monitora la respirazione e attendi che le estremità diventino rosa.
   3. Somministrare buprenorfina (0,1 mg/kg, per via sottocutanea) per il dolore ogni 12 ore per 48 ore. Controlla la presenza di segni di dolore, infezione o angoscia ogni 8 ore per le prime 24 ore e poi 3 volte al giorno per i successivi 3 giorni.
      NOTA: L'animale non viene lasciato incustodito fino a quando non ha riacquistato abbastanza coscienza per sostenere la decubito sternale.

3. Convalida del modello

1. Convalida grossolana
   1. Dopo 4 settimane, anestetizzare i topi riceventi utilizzando una combinazione di ketamina (75 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Quindi, in anestesia profonda, sopprimere i topi eseguendo la traslocazione cervicale.
   2. Eseguire un'incisione sulla linea mediana ed esporre la cavità addominale per l'ispezione dell'organo.
   3. Estrarre le ovaie con lesioni visibili e scattare fotografie.
   4. Ispezionare accuratamente la presenza di lesioni endometriosiche estranee.
2. Validazione istologica
   NOTA: A causa della presenza di solventi odoriferi potenzialmente irritanti negli esperimenti istologici, dovrebbe essere condotto in una cappa aspirante.
   1. Fissare le ovaie insieme alle lesioni in formalina tamponata neutra al 10%.
   2. Processare i tessuti seguendo le stesse procedure descritte da Adeniran et ^al.37, tra cui l'allocazione, la fissazione e l'inclusione dei tessuti.
   3. Sezionare in serie i tessuti a 4-5 μm di spessore, galleggiare in un bagno d'acqua a 45 °C e montarli su vetrini. Etichetta chiaramente i vetrini con il numero del mouse, il lato dell'ovaio e il numero della sezione. Asciugare per una notte a 37 °C.
   4. Colorazione con PAS-ematossilina
      1. Deparaffinazione: Posizionare i vetrini nello xilene o in un sostituto dello xilene per rimuovere la paraffina.
         NOTA: Potrebbe essere necessario eseguire questo passaggio un paio di volte.
      2. Reidratazione: reidratare gradualmente le sezioni di tessuto posizionando i vetrini in una serie di concentrazioni decrescenti di etanolo (100%, 95%, 80%, 70%).
      3. Trattamento acido periodico: coprire le sezioni di tessuto con una soluzione acida periodica all'1% e lasciarle riposare per 5-10 minuti a temperatura ambiente.
         NOTA: Questa fase ossida i gruppi glicolici del tessuto in gruppi aldeidici, consentendo la reazione con il reagente di Schiff e la formazione di una macchia rosa-porpora per indicare le strutture ovariche.
      4. Sciacquare accuratamente i vetrini con acqua distillata per rimuovere eventuali residui di acido periodico.
      5. Colorare le sezioni di tessuto con una soluzione di Schiff per 15 minuti.
      6. Sciacquare i vetrini prima in acqua corrente calda del rubinetto per rimuovere le macchie in eccesso, quindi in acqua distillata.
      7. Controcolorare le sezioni con 1 g/L di ematossilina di Meyer per 2-3 minuti.
      8. Sciacquare gli scivoli in acqua corrente del rubinetto per 2-3 minuti.
      9. Applicare il reagente azzurrante per 30 s.
      10. Sciacquare i vetrini in acqua distillata.
      11. Disidratare gradualmente le sezioni immergendole in concentrazioni crescenti di etanolo (70%, 80%, 95% e 100%).
      12. Immergere le sezioni in un agente di pulizia (ad es. xilene) per renderle trasparenti.
      13. Applicare un mezzo di montaggio alle sezioni sui vetrini e posizionare delicatamente un vetrino coprioggetti sulle sezioni, assicurandosi che non ci siano bolle d'aria. Lasciare asciugare le guide all'aria nella cappa per facilitare la solidificazione del mezzo di montaggio.
   5. Esaminare al microscopio ottico. Documentare la presenza di ghiandole endometriali, stroma e cisti emorragiche che confermano l'endometriosi nell'ovaio.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Il successo della creazione di OMA
Dei 12 topi sottoposti al protocollo di trapianto, 10 presentavano lesioni OMA caratteristiche, sia a livello anatomico macroscopico che istologico, che si traducono in un tasso di successo dell'83%. L'esame macroscopico ha rivelato lesioni piene di liquido aderenti alle ovaie, che ricordano le presentazioni cliniche di OMA (Figura 2). L'esame istopatologico, come illustrato nella Fi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

La prevalenza dell'OMA nella popolazione femminile globale sottolinea un problema critico per la salute³⁸. Oltre ai sintomi generali dell'endometriosi, l'OMA comporta ulteriori sfide per la fertilità, tra cui un forte dolore pelvico, il potenziale di torsione ovarica e altre implicazioni notevoli^39,40. Mentre la comprensione della patogenesi e della progressione dell'OMA è in gran parte avvolta nel miste...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 cc syringe with 25 G needle	BD Biosciences	301320
10 mm Tissue culture dish	FALCON	353001
10% Buffered formalin	Fisher Scientific	SF100-4
10x phosphate buffered saline (PBS) buffer	Fisher Scientific	AM9625
30 G needle	BD Biosciences	305107
5-0 black braided silk non-absorbable suture	Ethicon Inc.	W500H
70% Ethanol
Adhesive microscope slides	Marienfeld	810401
Buprenorphine Injection	Med-Vet International	RXBUPRENOR5
Double-headed cotton swab	SANYO Co., LTD.	HUBY-340
Fine forceps	Fine Science Tools	11254-20
Ketamine	Alfasan International b.v	2203095-08
Microtubes	Corning	MCT-150-C
Needle holder	Excelta Corporation	2827-NH-35-SE-ND
Ophthalmic ointment	Major Pharmaceuticals	10033691
Periodic Acid Schiff (PAS) Stain Kit	Abcam	Ab150680
Powder free sterile gloves	Fisher Scientific	19020558
Processing/embedding cassettes	Fisher Scientific	15-197-700A
Size 3 scalpel	Fisher Scientific	22-079-657
Small serrated semi-curved forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5135
Small surgical scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5850
Standard light microscope			For evaluating vaginal cytology smears and histological analysis.
Steel scalpel blades #10	B.Braun	BB510
Sterile gauze	MEDICOM	HMWS 077
Sterilized pyrex glass Petri dishes	Corning	70160-101
Thermoregulated electric pad
VICRYL RAPIDE (polyglactin 910) absorbable Suture	Ethicon Inc.	W9918
Xylazine	Alfasan International b.v	2110333-10